Оценка эффективности работы экзогенных редокс-медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза-клетки Escherichia coli-медиатор Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКАЯ ЭНЕРГЕТИКА. 2011. Т. 11, № 2. С. 604)4

УДК 541.136

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ ЭКЗОГЕННЫХ РЕДОКС-МЕДИАТОРОВ В БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ ГЛЮКОЗА КЛЕТКИ ESCHERICHIA COL/-МЕДИАТОР

И. А. Казаринов, Е. В. Кузьмичева, А. А. Игнатова

Саратовский государственный университет им. ТТ. Г. Чернышевского, Россия E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 24.03.2011 г.

Методом вращающегося дискового электрода оценена эффективность работы редокс-медиаторов ¡метилепового си пего, нейтрального красного и галлоциапипа) в биоэлектрохимической системе глюкоза - клетки Escherichia со//-медиатор. Определены коэффициенты диффузии исследуемых медиаторов. Показано, что эффективными обратимыми переносчиками электронов при работе биоапода па основе клеток Escherichia coli являются редокс-медиаторы метилеповый синий и галлоциапип.

Ключевые слова: микробный электрокатализ, биоапод. медиатор, микроорганизмы, окисление, восстановление.

The performance of several redox mediators (methylene blue, neutral red. and gallocyanine) in the bioelectrochemical system glucose-Escherichia coli cells was estimated by means of the rotating disk electrode technique. The diffusion coefficients of the mediators under study were evaluated. Methylene blue and gallocyanine are shown to be effective reversible electron carriers for the Escherichia co//-based bioanode.

Key words: microbial electrocatalysis. bioanode. mediator, microorganisms, oxidation, reduction.

ВВЕДЕНИЕ

При исследовании поведения микроорганизмов в электрохимических системах было обнаружено, что может иметь место перенос электронов от микроорганизма па электрод посредством диффузионно-подвижных промежуточных низкомолекулярных переносчиков электронов - экзогенных медиаторов [1]. Медиаторпый механизм транспорта электронов широко используется для проведения электрохимических ферментативных реакций.

В настоящей работе проведено изучение основных закономерностей электрохимического поведения медиаторов - метилепового синего из класса тиазипов, нейтрального красного из класса азипов и галлоциапипа из класса оксазипов. Выбор этих медиаторов продиктован их минимальной токсичностью для микроорганизмов Escherichia coli и соответствующей величиной их редокс-потепциала [1].

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Клетки Escherichia coli пттамма К-12 выращивались па твёрдой питательной среде LB с последующим пересевом па жидкую питательную среду LB. Культивирование проводилось в конической колбе па круговой качалке при температуре 37°С в аэробных условиях. После двепадцатичасо-вого культивирования биомассу трижды цептри-

© КАЗАРИНОВ И. А., КУЗЬМИЧЕВА Е. В., ИГР

фугировали (5000 об/мин, 5 минут) с последующим ресуспепзировапием в фосфатном буфере (рН 7.0) [2].

Для проведения электрохимических измерений использовалась стеклянная трёхэлектродпая ячейка с разделенными анодным и катодным пространствами, снабженная наружной стеклянной рубашкой для термостатировапия. Эксперименты проводились при температуре 37°С в атмосфере аргона. Вращающиеся дисковые электроды были выбраны в качестве рабочих электродов, которые представляли собой диски из стеклоуглерода площадью 0.071 см2. Вспомогательный электрод был выполнен из платиновой проволоки, скрученной в спираль. Потепциометрические измерения проводились относительно насыщенного хлоридпосере-бряпого электрода сравнения, потенциал которого составлял +0.201 В относительно нормального водородного электрода. Рабочим электролитом служил фосфатный буферный раствор с добавкой хлорида натрия в качестве фонового электролита.

В качестве медиаторов применяли окислительно-восстановительные индикаторы - метилеповый синий (чда), нейтральный красный (чда) и галлоциапип (чда). В качестве субстрата был использован моногидрат глюкозы С6Н1206-Н20 (хч). Снятие поляризационных кривых и амперометри-ческие измерения проводились с помощью потеп-циостата 1РС-согпраа, соединённого с персональным компьютером.

ВА А. А. ,2011

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Электрохимическое поведение метиленово-го синего, нейтрального красного и галлоцианина было изучено первоначально с помощью метода циклической вольтамперометрии. Циклические вольтамперные кривые были сняты при различных скоростях вращения на стеклографитовом дисковом электроде для различных концентраций исследуемых медиаторов. В качестве примера на рис. 1 -3 приведены циклические вольтамперограммы сте-клографитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите, который содержит в качестве редокс-медиаторов метиленовый синий, нейтральный красный и галлоцианин при различных скоростях вращения дискового электрода. Из циклических вольт-амперных кривых видно, что при потенциалах максимума тока катодного восстановления метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина, равных -0.23, -0.60 и -0.26 В соответственно, величина предельного катодного тока их восстановления зависит от скорости вращения дискового электрода. Анализ зависимости плотности предельного тока процессов восстановления исследуемых медиаторов при различных концентрациях от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода показал, что электрохимические реакции восстановления исследуемых медиаторов на электроде протекают в режиме диффузионной кинетики, следовательно, лимитирующей стадией является доставка медиаторов в окисленной форме к поверхности электрода. По уравнению Левича [3], определены коэффициенты диффузии исследуемых медиаторов, которые близки между собой и составляют (1.3±0.1)-10-6, (1.1±0.2)-10-6 и (1.5±0.1)-10-6 СМ-/С для метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина соответственно. При потенциалах максимума анодного окисления метиленового синего, нейтрального красного и галлоцианина, равных -0.06, -0.48 и -0.15 В соответственно, величина предельного анодного тока их окисления не зависит от скорости вращения дискового электрода, следовательно, лимитирующая стадия не связана с подводом исследуемых медиаторов в восстановленном состоянии к поверхности электрода. Из циклических вольт-амперных кривых для процессов анодного окисления и катодного восстановления исследуемых медиаторов определены значения анодных и катодных электрохимических емкостей (таблица).

5" -ю

Рис. 1. I Циклические вольт-амперные кривые стеклогра-фитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 1.25-10"3 моль/л метиленового синего и 2-10~3 моль/л глюкозы при различных скоростях вращения (рад/с): I - 178.0; 2 - 240.6; 3 - 293.1; 4 - 345.2; 5 - 397.6. Скорость развёртки потенциала 10 мВ/с

Рис. 2.1 Циклические вольт-амперные кривые стеклографи-тового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 1.25 • 10_3 моль/л нейтрального красного и 2-10-3 моль/л глюкозы при различных скоростях вращения (рад/с); I- 178.0; 2 - 240.6; 3 - 293.1; 4 - 345.2; 5 - 397.6. Скорость развёртки потенциала 10 мВ/с

1500

1 \ 1000 -

/ Ж00" £, мВ

-аоо -——^ Я" " ^400 -20« ( 200 400

_/ -500 - 5 -1000 -I

Рис. 3. Циклические вольт-амперные кривые стеклогра-фитового вращающегося дискового электрода, снятые в рабочем электролите (рН 7.0), содержащем 5-Ю-4 моль/л галлоцианина и 2-10-3 моль/л глюкозы при различных скоростях враще-

ния (рад/с); 1 - 178.0; 2- 240.6; 3 - 293.1; 4-Скорость развёртки потенциала 10 мВ/с

345.2; 5-397.6.

Установлено, что метиленовый синий и галлоцианин на стеклографитовом электроде работают обратимо, а нейтральный красный является необратимо работающим окислительно-

восстановительным медиатором. Об этом также свидетельствует и близость потенциалов анодных и катодных максимумов тока, наблюдавшихся па вольтамперпьтх кривых для метилепового синего и галлоциапипа.

Значения анодных и катодных электрохимических ёмкостей, рассчитанных из циклических вольт-амперных кривых для процессов анодного окисления и катодного восстановления метилепового синего, нейтрального красного, галлоцианина в фосфатном буферном растворе на стеклографитовом дисковом электроде при скорости вращения электрода 13.34 рад/с

Концентрация медиатора С-10-', моль/л Анодная ёмкость Од, мКл Катодная ёмкость Ок, мКл

Метиленовый синий

0.5 12.7 16.1

1.0 13.0 16.4

1.25 16.5 18.2

1.5 18.4 19.4

Нейтральный красный

0.5 3.3 14.3

1.0 4.1 16.2

1.25 4.4 16.8

Галлоцианин

0.25 15.5 17.2

0.5 16.0 17.8

0.75 17.0 18.7

Для оценки эффективности работы исследуемых редокс-медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза - клетки Escherichia coli были проведены амперометрические измерения процесса окисления глюкозы бактериальными клетками па вращающемся дисковом электроде при различных концентрациях субстрата и исследуемых медиаторов в рабочем электролите.

На рис. 4 приведены потепциостатические кривые анодного окисления метилепового синего па платиновом дисковом электроде при различных скоростях вращения. Видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит начинается резкое возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение концентрации восстановленной формы метилепового си-пего в объёме раствора, о чем свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. В данном случае /, ¿-зависимости проходят через максимум, после чего наблюдается постепенное снижение плотности тока во времени с выходом па постоянное значение, что, по всей видимости, связано со снижением концентрации окисленной формы медиатора в объёме раствора. Величина плотности тока максимума возрастает при увеличении скорости вращения дискового электрода, и общая

скорость процесса зависит от объёмной концентрации медиатора и субстрата в растворе [2].

/', мкА/см2

Время,с

Рис. 4. Потенциостатические кривые анодного окисления метиленового синего на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5-10 4 моль/л медиатора, 4.6-103 моль/л глюкозы и 2 мг вл.массы/мл клеток при различных скоростях вращения (рад/с): / - 36.6; 2 - 54.5; 3 - 80.6; 4 - 104.6; 5-151.8 при потенциале +0.250 В

Анализ зависимости плотности тока максимума анодного окисления метилепового синего от корпя квадратного из скорости вращения дискового электрода для различных концентраций медиатора и глюкозы показал, что процесс окисления метилепового синего па электроде протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля [2]. Это позволило определить кинетические характеристики электродной реакции - порядок реакции р и гетерогенную константу скорости к. Порядок реакции по медиатору и глюкозе равен единице, а среднее значение гетерогенной константы скорости процесса анодного окисления метилепового синего при его различной объёмной концентрации составляет 1.74-103 см/с.

На рис. 5 приведены потепциостатические кривые анодного окисления галлоциапипа при его различной концентрации па стеклографитовом вращающемся дисковом электроде. Видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит наблюдается медленное возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение концентрации восстановленной формы галлоциапипа в объёме раствора, о чем свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. Плотность тока достигает максимального значения за время 2500-3000 с, что примерно в 10 раз продолжительнее, чем для метилепового синего. При достижении максимальной плотности тока раствор галлоциапипа полностью меняет окраску от синей до светло-розовой, что свидетельствует о его полном восстановлении. Из анализа зависимости предельной плотпо-

сти тока процесса анодного окисления галлоцианина от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации медиатора видно, что электрохимическая реакция окисления галлоцианина на стеклографитовом электроде протекает в режиме диффузионной кинетики, следовательно, лимитирующей стадией является доставка медиатора в восстановленной форме к поверхности электрода.

На рис. 5 приведены потенциостатические кривые анодного окисления галлоцианина при его различной концентрации на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде. Видно, что при добавлении бактериальных клеток в рабочий электролит наблюдается медленное возрастание плотности анодного тока, поскольку происходит увеличение концентрации восстановленной формы галлоцианина в объёме раствора, о чем свидетельствует постепенное обесцвечивание электролита. Плотность тока достигает максимального зна-чения за время 2500-3000 с, что примерно в 10 раз продолжительнее, чем для метиленового синего. При дости-жении максимальной плотности тока раствор галлоцианина полностью меняет окраску от синей до светло-розовой, что свидетельствует о его полном восстановлении. Из анализа зависимости предельной плотности тока процесса анодного окисления галлоцианина от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации медиатора видно, что электрохимическая реакция окисления галло-цианина на стеклографитовом электроде протекает в режиме диффузионной кинетики, следовательно, лимити-рующей стадией является доставка медиатора в восстановленной форме к поверхности электрода.

/, мкА/см2

Рис. 5. Потснциостатичсскис кривые анодного окисления галлоцианина на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 1-10~3 моль/л глюкозы и 2 мг вл.массы/мл клеток при различной концентрации галлоцианина (моль/л): / 1.25-10-4;2 2.5-104;.5 5 -10 4 7.5-Ю-4; 5 МО--'. Скорость вращения 36.6 рад/с. при потенциале +0.250 В

На рис. 6 приведена потенциостатическая кривая анодного окисления нейтрального красного на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде. Видно, что при введении бактериальных клеток в рабочий электролит, не происходит возрастания плотности анодного тока. Это связано, по всей видимости, с неудовлетворительной работой нейтрального красного как медиатора, осуществляющего перенос электронов от микроорганизма на электрод. По имеющимся в литературе сведениям [4], окисленная форма нейтрального красного легко проникает через липидный слой мембраны клетки и взаимодействует с электронами, полученными в результате метаболизма (окисления) глюкозы. Однако выход восстановленной формы медиатора из клетки в электрохимическую систему затруднен, в связи с чем в липидных слоях мембраны бактериальной клетки происходит его накопление.

/', мкА/см2 20 -

Ч-1-1-■-1-1-1-1-1-■-1-1-1—

О 200 400 600 800 1000 1200

Время,с

Рис. 6. Потенциостатическая кривая анодного окисления нейтрального красного на стеклографитовом вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 5 -10-4 моль/л нейтрального красного. 1 -10~3 моль/л глюкозы и 2 мг вл.массы/мл клеток. Скорость вращения дискового электрода 36.6 рад/с. потенциал +0.250 В

Изучение поведения экзогенных медиаторов в биоэлектрохимической системе показало, что метиленовый синий и галлоцианин являются эффективными окислительно-восстановительными системами в условиях работы микробного медиа-торного анода на основе клеток Escherichia coli.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что электрохимические реакции восстановления исследуемых медиаторов на стеклографитовом электроде в фосфатном буферном растворе (рН 7.0) протекают в режиме диффузионной кинетики. Определены их коэффициенты диффузии, которые близки между собой и составляют (1.3±0.1)-10-6 см-/с, (1.1±0.2)-10-6 см-/с и (1.5±0.!)• 106 см2/с для метиленового синего,

нейтрального красного и галлоцианипа соответственно.

2. Изучено повеление исследуемых медиаторов в биоэлектрохимической системе глюкоза-медиатор- Escherichia coli и показано, что метиле-повый синий и галлоциапип являются эффективными окислительно-восстановительными медиаторами при реализации микробного медиаторпого анода па основе клеток Escherichia coli.

3. Показано, что процесс окисления мети-лепового синего па биоаподе протекает в режиме сметанного диффузионно-кинетического контроля, а процесс окисления галлоцианипа - в режиме диффузионной кинетики.

4. Определены кинетические характеристики реакции окисления метилепового синего па биоаподе - порядок реакции и гетерогенная константа скорости. Показано, что порядок реакции по медиатору и глюкозе равен единице, а среднее значение гетерогенной константы скорости процесса

анодного окисления метилепового синего при его различной объёмной концентрации составляет 1.74-10 3 см/с.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России за 2009-2013 годы», государственный контракт № П-2273).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Shukia Л. К., Sures h P.. Berchmans S., Rajendran A. // Current Science. 2004. Vol. 87. P. 455-468.

2. Кузьмччева E. В., Степанов Л. H., Казаринов И. Л., Игнатов О. В. // Элсктрохим. энергетика. 2007. Т. 7. Л» 4. С. 200-204.

3. Плесков Ю. В.. Филиновский В. Ю. Вращающийся дисковый электрод. М. : Наука. 1972.

4. Choi К. Kim N.. Kim S.. Jung S. // Bull. Korean Cbem. Soc. Vol. 24. Л» 4. P. 437-440.