CC BY
71
ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ПЕРОРАЛЬНЫХ НИЗКОДОЗОВЫХ АЛЛЕРГОВАКЦИН АВ-1П И АВ-2П
ВЫХРИСТЕНКО Л.Р.*, ЯНЧЕНКО В.В.*, ДУДКО Н.В.**, ЦЫМАНОВИЧ С.Г.**
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет»,
Научно-производственное республиканское унитарное предприятие
«Диалек»*
Резюме. Представлены результаты исследований качества низкодозовых пероральных аллерговакцин АВ-1П и АВ-2П. В состав пероральных аллерговакцин включены аллерген домашней пыли. бытовые или эпидермальные аллергены и инертный носитель. доза в 1 таблетке равна 5 PNU (protein nitrogen unit). Проведенные исследования подтвердили подлинность и качество новых лекарственных средств. разработанных для специфической аллерговакцинации пациентов с атопической бронхиальной астмой и/или аллергическим ринитом.
Ключевые слова: аллерген, пероральная аллерговакцина, специфическая аллерговакцинация.
Abstract. We present the results of our research of quality low-dose oral allergovaccine AV-1P and AV-2P. In composition of oral allergovaccines are enclosed house dust allergen. home or epidermal allergens and inert carrier. The research confirmed authenticity and quality of new drags. New allergovaccine is intended for specific allergovaccination of patient with atopic bronchial asthma and/or allergic rhinitis.
Key words: allergen, oral allergovaccine, specific allergovaccination.
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210602, Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, тел.: (8021) 225-380; факс (8021) 372107, 225-380, e-mail: all-vgmu@mail.ru. - Выхристенко Л.Р.
Введение
Специфическая аллерговакцинация (САВ) способна изменить характер реагирования организма больного на причинно-значимый аллерген. тогда как современные фармакологические средства позволяют лишь «контролировать» астму. не влияя при этом на течение заболевания. Различают парентеральные и мукозальные (сублингвальный. пероральный. интраназальный и др.) методы введения аллергенов. Эффективность парентеральной (подкожной) САВ доказана в многочисленных исследованиях. тогда как сублингвальный и. особенно. пероральный метод САВ нуждаются в дальнейшем изучении. В то же время известно. что пероральный метод аллерговакцинации является самым безопасным. что упрощает режим лечения и способствует проведению ускоренных курсов [2. 3. 5]. В качестве пероральных аллерговакцин применяются водно-солевые экстракты аллергенов. капсулы и таблетки с кишечно-растворимой оболочкой. глицериновые аллергены. разрабатываются вакцины. конъюгированные с адъювантами. носителями. иммуномодуляторами. рекомбинантные и синтетические пептиды [3]. Недостатком пероральных аллерговакцин считают их быстрое разрушение под действием желудочного сока и ферментов. вследствие чего для достижения иммунологической толерантности к аллергену требуется прием его высоких доз. Имеются экспериментальные и клинические работы. доказывающие возможность формирование низкодозовой толерантности к аллергену [1. 3. 4]. однако влияние курсовой дозы аллергена на эффективность пероральной САВ изучено недостаточно.
Нами разработаны низкодозовые пероральные аллерговакцины АВ-1П и АВ-2П. основной составной частью которых является аллерген домашней пыли. бытовые или эпидермальные аллергены. в качестве носителя используется микрокристаллическая целлюлоза. Ранее было доказано. что АВ-1П и АВ-2П безопасны. поскольку ЛД50 для препаратов определить не удалось. они не вызывали у животных каких-либо токсических реакций при длительном введении в больших дозах. не оказывали иммунотоксических эффектов. обладали иммунологической активностью.
Целью наших исследований являлось изучение подлинности и качества низкодозовых пероральных аллерговакцин. предназначенных для специфической аллерговакцинации.
Методы
Пероральная аллерговакцина АВ-1П имела следующий состав на 1 таблетку 0.120 г (5 PNU. protein nitrogen unit- международная единица количественного определения аллергенов или 0.00005 мг белкового азота): аллерген домашней пыли - 0.2 мкл; аллерген пера подушки - 0.1 мкл; аллерген пылевого клеща - 0.1 мкл; аллерген библиотечной пыли - 0.1 мкл;
микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ - инертный носитель) - до 120 мг.
АВ-2П имела следующий состав на 1 таблетку 0.120 г (5 PNU): аллерген домашней пыли - 0.2 мкл; аллерген шерсти кошки - 0.1 мкл; аллерген шерсти собаки - 0.1 мкл; аллерген шерсти овцы - 0.1 мкл; МКЦ - до 0.120 г.
Оценка качества фармацевтических субстанций пероральных аллерговакцин. Бытовые и эпидермальные аллергены. включенные в состав пероральных аллерговакцин. произведены ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова (Российская федерация). Входной контроль качества аллергенов ОАО «Биомед» включал визуальный контроль. определение рН. стерильности. токсичности. специфической активности. содержания белкового азота. фенола. солей. Исследование проведено в РУП «Диалек» в соответствии с фармакопейной статьей (ФС) предприятия ОАО «Биомед».
Изучение специфической активности аллергенов проведено в соответствии с ФС предприятия-производителя на базе учреждения здравоохранения «Витебская областная клиническая больница». Объект исследования: испытуемые в возрасте от 18 до 45 лет. в анамнезе у которых имелось указание на связь заболевания (бронхиальная аллергическая астма. аллергический ринит) с повышенной чувствительностью к аллергенам. входящим в состав АВ-1П или АВ-2П (опытные группы. по 5 пациентов в каждой). а также испытуемые. не имеющие повышенную чувствительность к данным аллергенам (контрольные группы. по 5 пациентов). Постановку кожного теста и учет реакции проводили в соответствии с инструкцией. утвержденной Главным Государственным санитарным врачом Российской федерации Г.Г. Онищенко 07 июля 2001 г. Аллерген считали специфически активным при выявлении положительных кожных проб не менее чем у 3-х из 5-ти пациентов и. если не было выявлено ни одной положительной реакции на испытуемый аллерген у 5-ти испытуемых контрольной группы. При регистрации положительных реакций у меньшего количества лиц. проводили постановку проб еще 5-ти пациентам. Положительные реакции должны быть выявлены не менее чем у 5-ти из 10 испытуемых.
Оценка качества препаратов пероральных низкодозовых аллерговакцин АВ-1П и АВ-2П. В рамках осуществления фармацевтической разработки пероральных аллерговакцин подготовлены проекты 2-х фармакопейных статей предприятия «Диалек». в соответствии с которыми был проведен контроль качества препаратов. Использовали визуальный метод контроля (Государственная Фармакопея Республики Беларусь - ГФ РБ с. 651). изучали показатели: подлинность (ФС РБ). средняя масса таблетки (ГФ РБ 2.9.5.). распадаемость (ГФ РБ 2.9.1.). потеря в массе при высушивании (ГФ РБ 2.2.32). количественное определение (специфическая активность. ФС РБ). микробиологическая чистота (ГФ РБ 2.6.12.. ГФ РБ 2.6.13.). соответствие упаковки. маркировки. транспортирования. хранения и срока годности разделам проекта ФС РБ.
Пероральные низкодозовые аллерговакцины по содержанию фармакологически действующих веществ и способу приготовления могут быть отнесены к гомеопатическим препаратам. Так как общее количество аллергенов в пересчете на белковый азот составляет 0.00005 мг белка в одной таблетке. проведение количественного определения содержания действующих веществ-аллергенов общепринятыми методами анализа (метод Лоури. биуретовый метод. метод Бредфорда. спектрофотометрический и др.) невозможно.
Определение подлинности (специфической активности) АВ-1П и АВ-2П проводили иммуноферментным методом. Определяли связывание специфических IgE антител из сыворотки крови больного аллергией с сорбированными на планшете аллергенами. Результат оценивали по уменьшению количества этих антител в сыворотке крови после взаимодействия сыворотки с таблеткой аллерговакцины. Рассчитывали коэффициент сорбции специфических антител. который должен быть не менее 25%.
Испытуемый раствор: к измельченной таблетке лекарственного средства добавляли 0.5 мл сыворотки крови больного аллергией. разведенной 1:2 раствором 8.7 г/л натрия хлорида Р. с количеством специфических IgE не менее 3 класса (3+. уровень антител 3.5-100 МЕ/мл). определенных предварительно иммуноферментным методом.
Раствор сравнения: к измельченной таблетке плацебо. не содержащей аллергенов. добавляли аналогичную сыворотку. Испытуемый раствор и раствор сравнения инкубировали 30 мин при 370С при помешивании. После чего центрифугировали при 1000 обор/мин. Затем отсасывали надосадок и определяли в нем наличие антител к аллергенам. входящим в состав АВ-1П и АВ-2. Одновременно испытывали 3 сыворотки разных больных и соответственно по 3 таблетки аллерговакцины и плацебо.
Коэффициент сорбции специфических антител (КС) высчитывали по формуле:
КС = (А-В) / Ах100.
где А - оптическая плотность раствора в лунке. в которой определяли антитела к аллергену после сорбции сыворотки с плацебо;
В - оптическая плотность раствора в лунке. в которой определяли антитела к аллергену после сорбции сыворотки с аллерговакциной.
Статистическую обработку полученных при исследованиях цифровых данных осуществляли на компьютере с использованием статистических программ Microsoft Excel 7.0 и t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Качество фармацевтических субстанций, являющихся составной частью пероральных аллерговакцин АВ-1П и АВ- 2П
Изучено качество промышленных аллергенов по показателям прозрачность. цветность. рН. стерильность. токсичность. содержание белкового азота. фенола. солей. Выявлено. что исследуемые препараты соответствуют требованиям нормативной документации.
Результаты аллергологического кожного тестирования
продемонстрировали. что все аллергены. входящие в состав пероральных аллерговакцин АВ-1П и АВ-2П. вызывали положительную кожную реакцию не менее одного «+» при скарификационном их нанесении у 3-5-ти пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой. имеющих в анамнезе повышенную чувствительность к тестируемому аллергену. что соответствует критериям оценки аллергена как специфически активного. Ни один из тестируемых аллергенов не вызывал ложноположительных реакций. поскольку в контрольной группе пациентов. не имеющих повышенной чувствительности к
аллергенам, кожные пробы были отрицательными. Подтверждена безопасность аллергенов. так как ни у одного испытуемого опытной и контрольной группы не было гиперергических кожных или общих реакций. Сделан вывод. что представленные ОАО «Биомед» образцы аллергенов могут использоваться для специфической диагностики и иммунотерапии. поскольку являются безопасным иммунобиологическим лекарственным средством.
Контроль качества лекарственных средств «Аллерговакцина пероральная низкодозовая АВ-1П» «Аллерговакцина пероральная
низкодозовая АВ-2П», таблетки для внутреннего применения
Выявлено соответствие качества тестируемых лекарственных средств проекту ФС по разделам «Описание». «Средняя масса». «Распадаемость». «Потеря в массе при высушивании». «Микробиологическая чистота».
Результаты исследования стабильности подтвердили. что пероральные аллерговакцины являются стабильными в течение двух лет при хранении в условиях. предусмотренных проектом ФС.
Присутствие МКЦ в аллерговакцинах доказано изменением окраски лекарственного средства в реакции с раствором цинка хлорида йодированного Р - таблетки белого с сероватым оттенком цвета приобретают фиолетовоголубой цвет. и наличием кристаллических частиц белого цвета в микропрепарате суспензии лекарственного средства.
В таблице 1 и таблице 2 представлены результаты сорбции таблеткой аллерговакцины АВ-1П и АВ-2П специфических антител из сыворотки крови пациентов. сенсибилизированных к аллергенам. входящим в состав аллерговакцин. В пробах с таблеткой аллерговакцины АВ-1П и АВ-2П наблюдалось снижение количества специфического ]^Е сыворотки крови к соответствующим аллергенам на 25% и более по сравнению с плацебо. что указывает на наличие в таблетках аллерговакцин аллергенов и доказывает специфическую активность тестируемого образца лекарственного средства.
Таблица 1
Специфическая активность пероральной низкодозовой ____________аллерговакцины АВ-1П __________________________
Тест-системы Оптическая плотность раство ра Коэффициент сорбции, %
Опы т 1 Опы т 2 Опы т 3 Пла- цебо 1 Пла- цебо 2 Пла- цебо 3
1 2 3 M+ sd
Аллерген из домашней пыли 0.323 0.429 0.584 0.655 0.821 0.994 50.7 47.7 41.2 46.5+ 4.9
Аллерген из клеща Бегша1;орка§о1ё еБ р1егопуБ8тш 0.433 0.529 0.418 0.782 0.693 0.837 44.6 23.7 50.1 39.5+ 13.9
Аллерген из пера подушки 0.321 0.426 0.512 0.786 0.829 0.684 59.1 48.6 25.1 44.3+ 17.4
Аллерген из библиотечной пыли 0.412 0.527 0.602 0.597 0.736 0.922 30.9 28.4 34.7 31.3+ 3.2
Примечание: М - среднее значение; Бё - стандартное отклонение.
Таблица 2
Специфическая активность пероральной низкодозовой ____________аллерговакцины АВ-2П __________________________
Тест-системы О птическая плотность раствора Коэффициент сорбции, %
Опы т 1 Опы т 2 Опы т 3 Пла- цебо 1 Пла- цебо 2 Пла- цебо 3
1 2 3 М+ Бё
Аллерген из домашней пыли 0.452 0.498 0.617 0.706 0.659 0.892 35.7 24.4 30.8 30.3+ 5.7
Аллерген из шерсти собаки 0.267 0.453 0.362 0.577 0.592 0.717 53.7 23.5 49.5 42.2+ 16.4
Аллерген из шерсти кошки 0.458 0.562 0.388 0.614 0.793 0.685 25.4 29.1 43.4 32.6+ 9.5
Аллерген из шерсти овцы 0.366 0.545 0.422 0.782 0.826 0.802 53.2 34.0 47.4 44.9+ 9.9
Примечание: М - среднее значение; Бё - стандартное отклонение.
Заключение
1. Аллергены промышленного производства. входящие в состав пероральных аллерговакцин АВ-1П и АВ-2П. подтвердили заявляемую производителем ОАО «Биомед» биологическую активность.
2. Лекарственные средства «Аллерговакцина пероральная низкодозовая АВ-1П» и «Аллерговакцина пероральная низкодозовая АВ-2П» обладают специфической активностью. поскольку таблетки препаратов сорбируют специфические 1^Е из сыворотки крови сенсибилизированных к аллергенам пациентов в предусмотренных фармакопейной статьей параметрах.
3. Качество лекарственных средств «Аллерговакцина пероральная
низкодозовая АВ-1П» и «Аллерговакцина пероральная низкодозовая АВ-2П» по разделам «Описание». «Средняя масса». «Распадаемость». «Потеря в массе при высушивании». «Микробиологическая чистота». «Срок годности»
соответствует проекту фармакопейной статьи.
4. Пероральные аллерговакцины АВ-1П и АВ-2П могут использоваться в качестве лекарственных средств для специфической аллерговакцинации в условиях клинических испытаний.
Литература
1. Chamg, Y. C. Inhibition of allergen-induced airway inflammation and hyperreactivity by recombinant lactic-acid bacteria / Y. C. Charng, C. C. Lin . C. H. Hsu // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. N 33. - P. 5931-5936.
2. Passalacqua. G. Alternative routes for specific allergen immunotherapy / G. Passalacqua. G. W. Canonica // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. - 1996. - N 6. - Р. 81-87.
3. Roth-Walter. F. Oral immunotherapy against type I allergy / F. Roth-Walter. E. Jensen-Jarolim // Journal of World Allergy Organization. - 2007. - Vol. 2. N 2. - P. 38-44.
4. Clinical efficacy of microencapsulated timothy grass pollen extract in grass-allergic individuals / E. C. TePas [et al.] // Ann Allergy Asthma Immunol. -2004. - Vol. 92. N 1. - P. 1-2.
5. WHO Position Paper. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases // J. Allergy. - 1998. - Vol. 53. N 44. - P. 1-42.
