CC BY
44
УДК 57.047:579.852.11
ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАМИКРОСТРУКТУРЫ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI ПОД ВЛИЯНИЕМ CRY-БЕЛКОВ ПАРАСПОРАЛЬНЫХ КРИСТАЛЛОВ BACILLUS THURINGIENSIS С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Е.Г. Климентова1, Т.Г. Юдина2, Л.К. Каменек1, Д.А. Васильев3, Н.А. Феоктистова3, Е.В. Рассадина1, Го Даньян4
гФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», 2ФГОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 3ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина»,
4Китайско-российский центр биоинженерии и биотехнологий, Китайско-Российский технопарк, г. Чанчунь, КНР
С помощью трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что под влиянием минимальных ингибирующих концентраций Cry-белков (дельта-эндотоксинов) параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki происходит изменение ультраструктуры клеток E. coli: нарушение гомогенности цитоплазмы (появление зернистости) у значительного числа клеток популяции (35±7,5 %), разрушение клеточных оболочек разной степени, неравномерное увеличение с разных сторон и просветление периплазматического пространства. Различная степень нарушения структуры клеток E. coli в микробной популяции является примером явления диссоциации - морфологической и физиологической неоднородности клеток бактерий - и результатом приспособления их к воздействию неблагоприятных факторов. Это указывает на пластичность микроорганизмов и их способность к адаптации к неоптимальным условиям существования, в частности к действию дельта-эндотоксинов, продуцируемых B. Thuringiensis.
Ключевые слова: дельта-эндотоксины B. thuringiensis, трансмиссионная электронная микроскопия, антибактериальная активность Cry-белков, ультраструктура клеток E. coli.
Введение. Установлено, что дельта-эндотоксины параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis проявляют биологическую активность в отношении ряда насекомых, нематод, клещей (Cry-белки), цитолитическую (Cyt-белки), антиопухолевую, антимикробную и антифунгицидную активность. Cry-белки принято относить к антимикробным белкам и пептидам [6, 8, 9, 10].
Биологически активные белки способны достаточно длительное время сохраняться в природе в виде автономных белковых включений, кристаллов в различных субстратах, поэтому в экологическом аспекте определенную значимость представляет изучение антимикробной активности Cry-белков, в частности их влияния на состав биоценозов, содержащих чувствительные микроорганизмы.
Cry-белки могут оказывать негативное влияние на биоценозы благодаря антимик-
робной активности, что является одной из существенных сторон экологической опасности использования трансгенных растений. Cry-белки, синтезируемые трансгенными Bt-растениями, могут влиять на микроорганизмы-симбионты желудочно-кишечного тракта теплокровных животных и человека, употребляющих в пищу генетически модифицированные растения. Показано, что растворы дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki оказывают антибиотическое действие (определенное методом диффузии в агар) на клетки Е. coli, выделенные из толстого кишечника мышей [2].
Электронная микроскопия дает возможность получить наглядные данные о форме и размере отдельных клеток и их колоний, разных признаках повреждения микроорганизмов антимикробными агентами, в т.ч. и бактериальными токсинами, что необходимо при
изучении механизмов действия токсинов в отношении прокариот, а также для разработки способов применения и анализа экологической безопасности токсинов [11].
Цель исследования. Изучение с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) изменения ультраструктуры клеток Escherichia coli под влиянием Cry-белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Материалы и методы. В работе использовалась культура B. thuringiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52, обладающая способностью образовывать в процессе споруляции кристаллы, содержащие параспоральные белки (дельта-эндотоксины) классов CrylA и Cry2. Культура получена из коллекции ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва). Поверхностное культивирование бактерий осуществляли в термостатах при 27 °С в чашках Петри на ага-ризованной питательной среде (рН 7,2-7,5) следующего состава (%): кукурузный экстракт - 0,7; глюкоза - 1; пептон - 0,5; хлористый натрий - 0,2; магний сульфат - 0,01; натрий кислый фосфорнокислый однозамещен-ный - 0,3; калий кислый фосфорнокислый двузамещенный - 0,3; агар-агар - 15-20.
При достижении спорообразования 8090 % клеток (через 3-4 сут культивирования) выделяли параспоральные кристаллы, отделяя их от спор, а затем получали растворы активированных токсинов согласно описанным методам [4, 6, 8].
Тест-микроорганизмы для определения антимикробного действия растворов Cry-бел-ков выделяли из микробиоты толстого кишечника лабораторных животных (белых мышей) с использованием классических бактериологических методик. Анализ выделенных микроорганизмов проводили согласно определителю Берджи [5] по морфологическим, биохимическим и культуральным признакам.
Клетки Е. coli отмывали в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,8), инкубировали в течение 60 мин с полученным раствором дельта-эндотоксинов в этом же буфере (добавляя 5 мг/мл раствора в инкубационную среду), затем фиксировали в 2,5 % глутаровом альде-
гиде и готовили препараты этих клеток для трансмиссионной электронной микроскопии известным способом [4].
Результаты и обсуждение. Исследование при помощи ТЭМ показало, что под влиянием дельта-эндотоксинов, продуцируемых B. thuringiensis subsp. kurstaki, в минимальной ингибирующей концентрации 5 мг/мл [1] клетки E. coli теряли свою характерную структуру (рис. 16). При подсчете в 10 полях зрения установлено, что количество клеток с гомогенным протопластом значительно сокращалось и наблюдалось появление в поле зрения значительного количества (более 35±7,5 %) клеток, находящихся на разных стадиях нетерминального лизиса.
Кроме того, отмечались явные нарушения их морфологии: изменение зернистости цитоплазмы, разрушение клеточных оболочек разной степени (белая стрелка), подавление бело-ксинтезирующего комплекса, неравномерное увеличение с разных сторон и просветление периплазматического пространства (черные стрелки). В некоторых клетках (15±2,5 %) обнаруживались электронноплотные участки конденсированного содержимого цитоплазмы, в которых отмечались неравномерно распределенные редкие фибриллярные структуры ДНК (рис. 1б, двойная стрелка).
При большем увеличении (рис. 1г) видны деструктивно-дегенеративные изменения клеточной оболочки: цитоплазматическая мембрана не проявлялась, контуры структуры клеточной стенки просматривались нечетко, отсутствовало равномерно выраженное периплазматическое пространство, в некоторых местах частично разрушенной клеточной стенки была заметна утечка содержимого клеток (белая стрелка).
Изменение зернистости цитоплазмы и образование скопления гранул резервных питательных веществ являются результатами приспособления бактериальной клетки к воздействию неблагоприятных факторов, что указывает на ее пластичность и способность к адаптации к неоптимальным условиям существования.
Рис. 1. ТЭМ срезов клеток E. coli с нарушенной ультрамикроструктурой под действием дельта-эндотоксинов классов CryLA и Cry2 (5 мг/мл), продуцируемых B. thuringiensis subsp. kurstaki:
а - контроль, интактные клетки; б - клетки с измененной зернистостостью цитоплазмы, разрушением клеточных оболочек разной степени, неравномерным просветлением периплазматического пространства; в - контроль, ненарушенные клеточные оболочки интактных клеток
с равномерным периплазматическим пространством; г - многочисленные неравномерные впячивания клеточной оболочки, начальный этап ее разрушения, утечка содержимого клеток
Различная степень нарушения структуры клеток E. coli в микробной популяции под действием дельта-эндотоксинов, продуцируемых B. thuringiensis subsp. kurstaki, является примером явления диссоциации - морфологической и физиологической неоднородности клеток популяции бактерий [3]. Диссоцианты в популяции бактериальных клеток могут проявлять различную чувствительность к антимикробным агентам за счет различий в химическом составе клеточных оболочек. Клетки-диссоцианты популяции,
имеющие менее устойчивые клеточные оболочки, будут иметь большую чувствительность к таким концентрациям антибиотических факторов, к которым еще нечувствительны клетки R-диссоциантов [7]. Наблюдаемая нами разная интенсивность повреждения клеток E. coli под влиянием минимальной ингибирующей концентрации Cry-белков B. thuringiensis subsp. kurstaki имеет, по-видимому, такую же причину.
Исследованиями ряда авторов установлено, что в процессе диссоциации одновре-
менно с изменением морфологии клеток меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к воздействию физических и химических факторов внешней среды [3]. Биологическое значение диссоциации состоит в том, что бактерии приобретают определенные селективные преимущества, которые обеспечивают их существование в различных экологических нишах - организме человека, животных или во внешней среде. R-формы бактерий, как правило, обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды.
Бактериостатическое действие дельта-эндотоксина в отношении клеток E. coli состоит, возможно, в способности изучаемых белков связываться с наружной мембраной бактериальных клеток посредством взаимодействия с пориновыми белковыми каналами, встроенными во внешнюю мембрану бактерий. Это приводит к торможению роста клеток бактерий, а при действии большей, летальной, концентрации Cry-белков - к их гибели.
Заключение. Таким образом, в результате нашего исследования было установлено, что клетки E. coli чувствительны к действию Cry-белков B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52. С помощью ТЭМ впервые изучены нарушения микроструктуры этих клеток и проанализированы типичные нарушения. Картина действия Cry-белков параспоральных кристаллов B. thuringiensis в отношении клеток E. coli, выделенных из толстого кишечника теплокровных животных, изученная с помощью ТЭМ, указывает на изменение зернистости цитоплазмы, разрушение клеточных оболочек разной степени, подавление белоксин-тезирующего комплекса, неравномерное увеличение с разных сторон и просветление пе-риплазматического пространства. Ранее проведенными исследованиями показано, что при действии на клетки эшерихий высоких концентраций дельта-эндотоксинов B. thurin-
giensis, превышающих минимальные ингиби-рующие концентрации, происходит практически полный лизис всех клеток в инкубационной смеси [3].
1. Антибактериальная активность белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis / Е. Г. Климентова [и др.] // Вестн. ветеринарии. -2015. - № 2 (73). - С. 37-41.
2. Антибиотическое действие белков пара-споральных кристаллов Bacillus thuringiensis на условно-патогенные бактерии микробиоты толстого кишечника животных / Е. Г. Климентова [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2012. - № 4 (16). - C. 12-16.
3. Милько Е. С. Процесс диссоциации у бактерий / Е. С. Милько, И. Б. Котова, А. И. Нетрусов. - М. : МАКС-Пресс, 2007. - 68 с.
4. Практикум по микробиологии / под ред. А. И. Нетрусова. - М. : Академия, 2005. - 608 с.
5. Хоулт Дж. Определитель бактерий Берджи / Дж. Хоулт, Н. Криг ; пер. с англ. под ред. А. Заварзина. - М. : Мир, 1997.
6. Юдина Т. Г. Антимикробная активность и экологическая роль белковых включений бактерий - представителей родов Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus : дис. ... д-ра биол. наук. в форме науч. доклада / Т. Г. Юдина. - М., 2006. - 81 с.
7. Юдина Т. Г. Чувствительность диссоци-антов Micrococcus luteus к действию 5-эндо-токсинов Bacillus thuringiensis / Т. Г. Юдина, Е. С. Милько, Н. С. Егоров // Микробиология. -1996. - № 66 (3). - С. 365-369.
8. Antibacterial activity of Cry- and Cyt-pro-teins from Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis / T. G. Yudina [et al.] // Can. J. Microbiol. - 2003. -Vol. 49, № 1. - P. 37-44.
9. Bacillus thuringiensis Toxins. An Overview of Their Biocidal Activity / L. Palma [et al.] // Toxins (Basel). - 2014. - № 6 (12). - P. 3296-3325.
10. Characterization of the anti-cancer-cell parasporal proteins of a Bacillus thuringiensis isolate / S. Yamashita [et al.] // Can. J. Microbiol. - 2000. -№ 46. - P. 913-919.
11. Díaz-Visurraga J. Morphological changes induced in bacteria as evaluated by electron microscopy / J. Díaz-Visurraga, G. Cárdenas, A. García // Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. - 2010. - P. 307-315.
STUDY OF CHANGES IN ESCHERICHIA COLI CELLS ULTRAMIKROSTRUKTURY DUE TO CRY-PROTEIN BACILLUS THURINGIENSIS A PARASPORAL CRYSTAL WITH AN ELECTRON MICROSCOPE
E.G. Klimentova1, T.G. Yudina2, L.K. Kamenek1, D.A. Vasilev3, N.A. Feoktistova3, E.V. Rassadina1, Guo Danyan4
Ulyanovsk State University, 2Moscow State University, Ulyanovsk State Agricultural Academy, 4Changchun Sino-Russian Science and Technology Park, China
By using transmission electron microscopy (TEM), it was found that under the influence of the minimum inhibitory concentration Cry proteins (8-endotoxins) parasporal crystals of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki is a change of the ultrastructure of cells E. coli: a violation of the homogeneity of the cytoplasm (the appearance of grain) a significant number of cells in the population (35±7,5 %), the destruction of the cell walls of varying degrees, uneven increase from different sides and enlightenment periplasmic space. Varying degrees of disruption of the structure of E. coli cells in the microbial population is an example of the phenomenon of dissociation - morphological and physiological heterogeneity of the cells of bacteria and is the result of their adaptation to the adverse factors. This indicates the plasticity of microorganisms and their capacity to adapt to non-optimal living conditions, in particular under the action of 8-endotoxins produced by B. thuringiensis.
Keywords: 8-endotoxins of B. thuringiensis, transmission electron microscopy, antibacterial activity of Cry-proteins, cell ultrastructure of E. coli.
