CC BY
56
УДК 630:576.8:632
действие дельта-эндотоксина тшив твтшк НА ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ1
Изучено влияние перорального введения растворов дельтаэндотоксина B. thuringiensis на белых мышей. Показано, что высокие дозы дельта-эндотоксина (свыше 100 мг/кг веса) приводили к изменению характера поведения животных: снижению физической активности, аппетита, уменьшению количества поедаемого корма. Появлялись признаки дисбактериоза - изменение консистенции стула, вздутие живота.
Ключевые слова: дельта-эндотоксин B. thuringiensis, биоинсектициды, токсическое действие, дисбактериоз.
Введение
В последние время на основе споро-кристаллического комплекса и отдельных параспоральных белков (Cry-белков, дельта-эндотоксинов) широко распространенной в природе почвенной бактерии B. Липид1епз1з выпускается большое разнообразие биоинсектицидов, которые широко применяются для защиты растений в лесных биоценозах, агроценозах и лесо-парковых городских насаждениях. Cry-гены введены в целый ряд растений для защиты их от вредных насекомых (генно-модифицированные Bt-растения).
Сведения об экологических последствиях применения биоинсектицидов на основе различных компонентов В. Лжтд1ет1з и их действие в отношении нецелевых объектов носят весьма противоречивый характер. Известно однако, что определенные штаммы данного микроорганизма содержат гены, ответственные за образование энтеротоксинов, вызывающих отравление с диарейным синдромом. Кроме того, в опытах на лабораторных животных по оценке острой токсичности компонентов различных штаммов В. Лжтд1ет1з доказан либо большой процент летальности, либо серьезные патологические изменения в их тканях и органах [1, 2]. В этой связи работа по оценке влияния дельта-эндотоксинов на теплокровных животных при перо-ральном введении является весьма актуальной.
Известно, что при попадании токсичных белков в желудочно-кишечный тракт животных меняется состав и свойства кишечной микрофлоры, нарушаются ее функции - развивается дисбактериоз [3].
Целью исследования явилось изучить действие различных доз дельтаэндотоксинов В. 1Ьигтд1еп5\з subsp. ки^аМ на белых мышей при пероральном введении.
Материалы и методы исследований
В работе был использован штамм 2-52 В. №игтд1епз1з subsp. киг$1аЫ, продуцирующий кристаллы дельта - эндотоксина класса Сгу1А, полученный из коллекции культур микроорганизмов Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) г. Пушкин Ленинградской области. Культуру выращивали на питательной среде № 14 при температуре 27°С, на 3-4 сутки культивирования при спорообразовании в пределах 80-90% выделяли параспоральные кристаллы дельта - эндотоксинов, отделяя кристаллы от спор. Для активации протоксинов до активных токсинов с участием протеиназы бактерии-продуцента растворы инкубировали в течение 1-2-х су-
Е.Г. Климентова Л.К. Каменек АЛ. Купцова
Ульяновский государственный университет, 432700, г. Ульяновск, улЛ.Толстого, 42
e-mail: [email protected]
1 Работа поддерживается грантом ФЦП, гос. контракт № 02.740.11.5230.
ток при комнатной температуре. После этого белки кристаллов осаждали, отделяли от супернатанта центрифугированием и перерастворяли в 0,02М фосфатном буфере при рН 7,8.
Затем готовили растворов белков нужной концентрации в этом буфере, концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм (8280). Полученные растворы использовали для перорального введения подопытным животным.
В эксперименте использовали белых беспородных мышей - самок. Содержание, питание, уход за животными осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755) при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания. Первая группа животных ежедневно в одно и то же время (в первой половине дня) получала перорально внутрижелудочно с помощью зонда в течение 28 суток дельта - эндотоксины в количестве 25 мг/кг веса, вторая - 50 мг/кг веса (группы А и В) и третья группа -100 мг/кг веса (группа С), что составило 0,0075 - 0,03 мг на особь. Контролем послужила группа животных, получающая пищу без добавления токсинов.
Для исключения влияния на микрофлору кишечника животных неспецифических факторов, связанных со стрессом, все животные контрольной группы подвергались тем же манипуляциям, что и животные, получающие растворы дельтаэндотоксинов. Чистый физиологический раствор особям контрольной группы вводили внутрижелудочно в том же объёме, в котором вводили раствор токсинов животным опытным группам.
В течение всего времени проведения эксперимента следили за количеством поедаемого животными корма, контролировали их вес, поведение и отслеживали возможные симптомы проявления дисбактериоза.
Результаты исследования и их обсуждение. В табл. 1 представлены результаты изменения характера поведения и появление симптомов дисбактериоза у мышей в зависимости от доз вводимых растворов дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 и сроков их применения.
Таблица 1
Характер поведения и симптомы проявления дисбактериоза у мышей после введения растворов дельта — эндотоксинов B. Thuringiensis
Признак Контро- льная группа животных Дозы дельта - эндотоксинов, вводимые животным экспериментальных групп, мг/кг веса
25 (группа А) | 50 (группа В) | 100 (группа С)
Сроки наблюдения, сутки
7 I 14 I 21 | 28 | 7 I 14 I 21 | 28 | 7 I 14 I 21 | 28
В каждой группе по 30 особей
Физическая активность + + + + 28 + + + 27 23 20 18 16
Снижение физической активности и аппетита - - - - 2 - - - 3 7 10 12 14
из них:
Стул без изменений + + + + + + + + + 23 20 18 16
Диарея, вздутие живота - - - - - - - - - 4 7 8 10
Запор - - - - - - - - - 3 2 2 2
+ признак наблюдался у всех особей в группе; - признак отсутствовал у всех особей в группе.
В контрольной группе животных симптомы проявления дисбактериоза не отмечались. В экспериментальных группах А и В в течение 3-х недель после начала введения растворов дельта-эндотоксина признаков дисбактериоза также не наблю-
далось. Мыши поедали без остатка весь предложенный корм и были активны в поведении.
На 28 сутки после начала эксперимента в данных группах животных у 2-3 особей из 30, т.е. у 6,7-10,0% особей, отмечались изменения в характере поведения: снижение физической активности и аппетита. Однако явно выраженных признаков дисбактериоза не наблюдалось.
Дисбиотические признаки у животных экспериментальной группы С появились уже к концу первой недели после начала эксперимента и сохранялись у некоторых особей в течение всего периода наблюдений, постепенно усиливаясь. Так, у 7 особей (13,4%) отмечались следующие симптомы дисбактериоза: диарея, вздутие живота, изменение консистенции стула, запоры и т.д. Изменился и характер поведения: мыши стали «вялыми», малоподвижными, корм поедали неохотно и не полностью.
К 14-ым суткам после начала эксперимента у мышей в группе С, снижение физической активности, аппетита и диарея и вздутие живота отмечалась уже у 7 животных, или в 23,3% случаях, запоры или чередование диареи и запора - у 1-2 особей, в 3,4 ■ 6,7% случаях. На 21-е сутки количество животных с явными признаками дисбактериоза увеличилось до 12, т.е. 40% мышей страдали от диареи и других проявлений данного недуга. К концу эксперимента, на 28-е сутки, число мышей с признаками заболевания составило 14, или 46,7% от общего числа, почти половина от общего числа животных в эксперименте.
Следует отметить, что такие признаки, как снижение физической активности и наличие диареи четко коррелировали с уменьшением количества поедаемого корма и снижением веса у лабораторных животных в группе С (рис. 1., 2.).
Как видно из данных, представленных на рисунках, среднее количество корма, поедаемого 1 животным экспериментальных групп А и В, было сравнимо с таковым в контрольной группе и составило в среднем 10,4-11,0 г в сутки. В группе С среднее количество поедаемого корма сократилось к 28 - м суткам с 11,0 до 8,1 грамма.
12
и
О. 10
о •
ш 8
и 6
s
4
2
3
о ' 0
1 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки 28 сутки
-•- контроль -Животные группы А
А Животные группы В -Животные группы С
Рис. 1. Среднее количество корма, поедаемого 1 животным в сутки
Средний вес контрольных животных увеличился с 26, 0 до 26,5 граммов на 28-е сутки, а в группе А, где животные получали дозу растворов дельта-эндотоксинов 25 мг/кг веса, средний вес мышей также несколько увеличился и составил 26,2 г. В группе В средний вес мышей незначительно уменьшился и составил к концу эксперимента 25,5 г, но это уменьшение оказалось статистически недостоверным. Напротив, снижение веса мышей в группе С, получавших высокие дозы растворов дельтаэндотоксина (100 мг/кг веса), было статистически значимым, и составило в среднем 23,1 г на 28-е сутки по сравнению с 26,0 г в начале эксперимента.
+ контроль —•— Животные группы А
Животные группы В • Животные группы С
Рис. 2. Средний вес 1 животного, г.
Разнообразие клинических форм заболевания при введении растворов дельтаэндотоксинов B. thuringiensis мышам равного веса и возраста (при прочих равных условиях эксперимента) служат указанием на индивидуальную чувствительность животных к токсическим метаболитам бацилл этой группы. Не исключено, что подопытные мыши в ходе своего индивидуального развития могли в той или иной степени контактировать с подобными микробами или их метаболитами. Такой контакт мог привести либо к развитию устойчивости, либо к их сенсибилизации. Безусловно, проявление дисбактериоза зависело, возможно, от наличия других заболеваний и инфекций у животных.
Таким образом, пероральное введение растворов дельта-эндотоксинов B. thuringiensis вызывают у белых мышей специфический патологический процесс с признаками развивающегося дисбактериоза. Механизм развития заболевания в данном случае остается неясным, хотя вполне возможно, что он связан с повреждением микрофлоры кишечника под действием бактериальных токсинов, так как именно кишечная микробиота в виде биопленки препятствует проникновению их в макроорганизм. При этом происходит снижение популяционного уровня облигатных микроорганизмов с нормальной ферментативной активностью, обладающих высокой антагонистической активностью и создаются условия для избыточной колонизации кишечника условно-патогенными и патогенными штаммами бактерий и развития дисбактериоза [4, 5].
Данные, полученные при исследовании влияния белковых дельтаэндотоксинов на теплокровных животных, необходимы для разработки или уточнения способов и доз экологически безопасного применения биоинсектицидов на основе B. thuringiensis, а также при использовании трансгенных растений, синтезирующих Cry-белки.
Список литературы
1. Damgaard P.H., Larsen H.D., Hansen B.M., Bresciani J., Jorgensen K. Enterotoxin-producing strains of Bacillus thuringiensis isolated from food // Letters in Applied Microbiology Volume 23. - 2008. - P. 146-150.
2. Oshodi R.O., Macnaughtan P. BK preparation: Asute inhalation toxicity study in rats. Volume 6. Danbury. - CT: Novo Nordisk. 1990.
3. Барановский А.Ю., Кондрашин Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. - Санкт-Петербург: Питер, 2000. - 209 с.
4. Бондаренко В. М., Воробьев А. А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиол. - 2004. - № 1. - С. 84-92.
5. McFarland L. Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic associated diarrhea // Diagn. Dis. - 1998. - Vol. 16. - P. 292-307.
EFFECT OF BACIUUS THURINGIENSIS DELTA-ENDOTOXIN ON WARM-BLOODED ANIMALS
E.G. Klimentova L.K. Kamenek A.A. Kuptsova
Ulyanovsk State University, 432700 Ulyanovsk, ul.L.Tolstogo, 42
e-mail: [email protected]
Studied of the oral application of solutions of B. thuringiensis del-ta-endotoxin on white mice. It is shown that high doses of delta-endotoxin (over 100 mg / kg) led to a change in the nature of animal behavior: decreased physical activity, appetite, reduce the number of edible forage. There are signs of dysbiosis - change stool consistency, bloating.
Key words: delta-endotoxin B. thuringiensis, bioinsecticides, toxicity, bacteria overgrowth.
