CC BY
65
Климентова Е.Г.
Ульяновский государственный университет E-mail: kloushel@mail.ru
ВЛИЯНИЕ §-ЭНДОТОКСИНА BACILLUSTHURINGIENSIS НА ПЛЕНКООБРАЗУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ И АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
Установлено, что 5-эндотоксины Б. thuringiensissubsp. ки^аМвводимые в течение длительного времени perosлабораторным мышам, приводят к развитию дисбактериоза, при котором происходит изменение способности микроорганизмов к пленкообразованию и адгезивные свойства условно-патогенных микроорганизмов, что создает условия для последующей их инвазии в ткани хозяинаи приводит к развитию инфекций.
Ключевые слова: 5-эндотоксины В. thuringiensis, образование бактериальных биопленок, усиление адгезивности микроорганизмов.
Параспоральные белковые кристаллы - 5-эндотоксины (Cry и Cyt белки) энтомопатоген-ной бактерии B. thuringiensis являются основными действующими компонентами бактериальных инсектицидов и генетически модифицированных растений (ГМР). При употреблении в пищу ГМР и продуктов, обработанных биопестицидами, 5-эндотоксины могут повлиять на микробиоценозы желудочно-кишечного тракта благодаря их выраженному антибиотическому действию в отношении аэробных и анаэробных бактерий [1]. Рядом исследований установлено, что д-эндотоксины B. thuringiensissubsp. kurstaki в дозе от 50 мг/кг веса и выше, вводимые в течение длительного времени peros лабораторным мышам, приводят к развитию дисбактериоза, при котором уменьшается количество доминирующих видов микроорганизмов и появляется значительное число добавочных и транзиторных, в том числе Staphilococcusaureus [2]. Развитие дисбактериоза в кишечнике теплокровных животных связано с изменением биологических свойств бактерий, особенно условно патогенных видов [3], в том числе и способности образовывать биопленки и изменять адгезивные свойства.
Существование бактерий внутри биопленок обеспечивает им много преимуществ по сравнению с изолированными (планктонными) клетками. Особенно важно, что бактерии в биопленках обладают повышенной выживаемостью в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты и антибиотиков [4]. Биопленки - этоподвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества [5]. Они могут состоять изодного вида бактерий или, чтовстречается
более часто, могут быть полимикробными, например, содержать многочисленныеразнообраз-ные виды микроорганизмов, объединенных сложными межклеточными связями ^.Образование биопленок - это одна из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в различных биотопах окружающей среды, в том числе в организме-хозяине. Способность бактерий существовать в составе биопленок повышаетус-тойчивость их к антибактериальным и дезинфицирующим средствам, а также к действию иммунной защиты организма-хозяина. Механизмы регуляции образования биопленок в настоящее время активно изучаются.
Способность бактерий формировать биопленки и изменять адгезивные свойства является существенным фактором патогенности, в связи с этим, выявление данных свойств различных условно-патогенных бактерий в условиях экспериментального дисбактериоза, вызванного применением 5-эндотоксинов B. thuringiensis,является актуальным и необходимым в целях выяснения степени безопасности трансгенных растений в отношении теплокровных животных и человека и сохранения устойчивости экосистем.
Материалы и методы исследования.Мате-риалом для исследования послужили клинические изолятыфакультативно-анаэробных грам-позитивных и грамнегативных микроорганизмов, являющихся представителями условнопатогенной микробиоты кишечника человека.-Биопленкообразующие свойства культур E.coli, Enterococcusspp. и St. aureus, выделенных из прямого отдела толстого кишечника интактных животных (контроль), и от животных с призна-
ками дисбактериоза вследствие перорального введения растворов 5-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki в дозе 100 мг/кг веса на 28 сутки эксперимента.
Полученные клинические изоляты идентифицированы общепринятыми бактериологическими методами по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем («ENTEROtest 24», «STAPHYtest 16»
(LACHEMA, Чехия). Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры на плотную питательную среду, с последующим определением способности формировать биопленки. Образование биоплёнок оценивали общепринятым методом по способности штаммов к адгезии на поверхности 96-луноч-ных полистироловых планшет [7] .Адгезивные свойства культур E.coli, Enterococcusspp. и St. aureus, выделенных в контроле и от животных с дисбактериозом (по 10 произвольно выбранных штаммов) оценивали по методике В.И. Брил-лис и соавт.[8] (1986) с определением среднего показателя адгезии (СПА), коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе (К,%) и индекса адгезивности микроорганизма (ИАМ).
Данные были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц MicrosoftOfficeExcel 2003 и программы «Био-
стат» путем подсчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней величины (m), вероятность значений разницы (p). Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При изучении влияния 5-эндотоксинов B. thuringiensisна биопленкообразованиеусловно-патогенных бактерий-микросимбионтовтол-стого кишечника животных было установлено изменение уровня данного признака у бактерий, выделенных от животных экспериментальных групп по сравнениюс контролем.Среди условно-патогенных микроорганизмов эффект влияния д-эндотоксинов различался: наблюдалось увеличение среднепопуляционного уровня био-пленкообразования среди штаммов St. aureus (разница достовеpна при <0,05) от исходного уровня выраженности признака в контроле за счет перестройки популяции в сторону увеличения доли клонов с высокими и средними значениями изучаемого признака и уменьшения числа клонов с низкой способностью пленкооб-разования (табл.1).
Среднепопуляционный уровень биоплен-кообразованияу штаммов культуры Enterococcusspp., выделенныхот животных с дисбактериозом,был схож с уровнем активности образования биопленки контрольных штаммов, статистически значимые различия отсутствовали.
Таблица 1. Биопленкообразованиебактерий, выделенных из биотопа толстого кишечника мышей
Микроорганизмы Активность образования биопленки, ед. ОП
0,100-0,140 0,141-0,160 0,161-0,2 >0,2
St. aureus Контроль(п= 10) 10±1,5 30±4,3 10±1,2 50±5,7
Животные с дисбактериозом (n=50) 0* 12±2,5* 23±4,4* 65±7,0*
St. aureusHly+(n=15) 0 0 0 100,0
Enterococcusspp. Контроль (n=30) 36±5,5 12±3,2 10±2,1 42±6,5
Животные с дисбактериозом(п=15) 32±6,5 10±2,3 10±3,0 48±5,7
E.coli типичные Контроль (n=50) 32±3,4 14±1,5 8±2,0 48±8,2
Животные с дисбактериозом (n=50) 62±12,0* 23±3,0* 15±2,2* 0*
E.coliHly+lac+ (n=30) 0 0 15,0±4,5 85,0±10,0
E.coliHly+lac- (n=5) 0 0 0 100,0
E.coliHly-lac-(n=12) 0 0 50,0±4,9 50,0±5,8
Примечания: п- число штаммов; * статистически значимые различия с контрольным вариантом (Р<0,05, число повторностей т = 3)
Что касается культуры бактерий E. тй, то под действием растворов параспоральных белков происходит снижение пленкообразования и переход в планктонный рост штаммов с нормальными ферментативными свойствами. Напротив, лактозонегативные и гемолитические штаммы данной культуры отличались повышенной склонностью к биопленкообразованию, вплоть до абсолютного значения (100%) у лактозонегативны-хизолятов, обладающих одновременно способностью к гемолизу эритроцитов. Таким образом, пероральное введение растворов 5-эндотоксинов B. thuringiensisоказалонеоднозначное влияние на изменение способности микроорганизмов к плен-кообразованию в условиях экспериментального дисбактериоза.
Бактериальные биопленки повышают толерантность микроорганизмов - симбионтов к антителам и фагоцитам хозяина, антибиотикам, стрессам окружающей среды, таким, например, как недостаток кислорода, ограничениев пита-нии,антисептики, дезинфектанты. Эта невосприимчивость может способствовать полной резистентности к факторам, которые могли бы легко уничтожить тех же самых микробов в случае их роста в свободном, планктонном состоянии [9]. Находясь в составе полимикробных биопленок, бактерии различных видов могут передавать друг другу защитные свойства, например, антибиотикоустойчивые бактерии способны выделять защитные энзимы или антиби-отик-связывающие протеины, которые могут защищать соседние антибиотикочувствительные бактерии в биопленке [10]. Также они могут передавать другим бактериям гены, отвеча-
ющие за антибиотикорезистентность, передача может происходить даже между различными видами бактерий [11].
Проблема образованиябиопленок условнопатогенными микроорганизмами в различных биотопах в условиях invivo до конца не изучена, пока лишьдоказана связь этого процесса спро-явлением социального поведения бактерий, по-лучившегоназвание «чувство кворума» (QuorumSensing/QS/). Процесс регуляции в такихсистемах осуществляется за счетаутоин-дукторов - специфических сигнальныхмолекул; при достижении вмикробном сообществе критической численности микроорганизмовQS-система стимулирует усиление адгезивныхс-войств потенциального возбудителя и инициирует синтез факторов патогенности [12].
Изучение адгезивных свойств микроорганизмов (табл. 2) показало, что штаммы St. aureus и Enterococcusspp., выделенные от животных, получавших растворы токсина в дозе 100 мг/кг веса, имели более высокие показатели адгезивной активности (СПА и К%; Р<0,05) по сравнению с микроорганизмами, выделенными от контрольной группы животных.
Типичные штаммы эшерихий отличались сниженными по сравнению с контрольной группой показателями адгезии по сравнению с контрольной группой (СПА и К%; Р<0,05), а штаммы с измененными биологическими свойства-ми-гемолитически активные и лактозонегативные, напротив, отличались от контрольных повышенными показателями адгезии: СПАбыл увеличен почти в 3 раза, ИАМ - в 2, 3 раза. Способность гемолитических E.coli активно при-
Таблица 2. Адгезивные свойства бактерий, выделенных из биотопа толстого кишечника мышей
Микроорганизмы СПА К(%) ИАМ
St. aureus Контроль 2,56±0,30 70,40±4, 55 3,60±0,12
Животные с дисбактериозом 3,33*±0,24 81,32*^4,56 4,09±0,27
Enterococcusspp. Контроль 2,30±0,40 62,96±5,13 3,65±0,19
Животные с дисбактериозом 3,56*±0,52 74,24*±5,05 4,77±0,22
E.colг'типичные Контроль 2,16±0,18 65,34±5,27 3,31±0,16
Животные с дисбактериозом 1,72*±0,10 52,32*±3,08 3,27±0,28
E.coliHly+lac- 6,04*±0,60 79,24*±4,30 7,62*±0,53
* Статистически значимые различия с контрольным вариантом (Р<0,05, при п = 10). Микроорганизм считался неадгезивным при ИАМ <1,75; низкоадгезивным - от 1,76 до 2,5; среднеадгезивным - от 2,51 до 4,0; высокоадгезивнымпри ИАМ выше 4,0.
крепляться к поверхности эукариотических клеток доказывает то, что данные микроорганизмы обладают способностью к усилению адгезии в условиях развивающегося под действием д-эндотоксинов B. thuringiensis дисбактериоза, что создает условия для последующей их инвазии в ткани хозяина, что обычно приводит к развитию инфекций; максимальное формирование биопленки, проявлению вирулентности бактериями в микробных ассоциациях и имму-нодефицитным состоянием самого макроорга-низма[13].
Выводы
Пероральное применение высоких доз д-эндотоксинов B. thuringiensis в течение длительного времени привело к развитию дисбактериоза и повлияло на способность к био-пленкообразованию условно-патогенных бак-терий-микросимбионтов толстого кишечника у животных. Было установлено увеличение среднепопуляционного уровня данного признака среди штаммов St. aureus, выделенных от животных экспериментальных групп по сравнению с контролем за счет перестройки популяции в сторону увеличения доли клонов с высокими и средними значениями. У культуры бактерий E. с()Н происходило сни-
жение способности к пленкообразованию у штаммов с нормальными ферментативными свойствами и усиление данного признака у лактозонегативных и гемолитических эшери-хий. Среднепопуляционный уровень биоплен-кообразования у штаммов культуры Enterococcus spp., выделенных от животных с дисбактериозом, был схож с уровнем активности образования биопленки у изолятов, выделенных от контрольных животных.
Было установлено также, что изменение способности к биопленкообразованию некоторых условно-патогенных бактерий в условиях дисбактериоза находилось в прямой зависимости от изменения показателей их адгезии. Так, штаммы культур St. aureus, Enterococcus spp., и E.coli с измененными биологическими свойствами - гемолитически активные и лактозонегативные, отличались от контрольных повышенными показателями адгезии: СПА и ИАМ был значительно увеличен. Те же показатели у типичных штаммов E.coli, были, напротив, снижены.
Эффект действия 5-эндотоксинов B. thuringiensis на изменение биологических свойств условно-патогенных бактерий-симби-онтов толстого кишечника животных требует, безусловно, дальнейшего изучения.
25. 02. 2013
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-97016-р_поволжье_а
Список литературы:
1. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие эндотоксинов четырёх подвидов Badllusthuringiensisна различных прокариот // Микробиология.-1997.-Т.б6. - №1. - С. 25 - 31.
2. Климентова Е.Г., Купцова А.А., Каменек Л.К., Гулий В.В.Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном пероральном введении д-эндотоксина Bacillusthuringiensis //Сельскохозяйственная биология. -2011. - №4. -С. 115-120.
3. Бондаренко В. М., Воробьев А. А.Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиол. - 2004. -№1. - С. 84-92.
4. Lasa I.[et al.] Bacterial biofilms and infection // An. Sist. Sanit. Navar. - 2005. - V.28. - P.163-175.
5. Hall-Stoodley L., Stoodley P.Evolving concepts in biofilm infections // Cell Microbiol. -2009. - Vol. 11, N 7. - P. 1034-1043.
6. Ильина Т.С. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л.Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - №40. - С. 1-12.
7. O’TooleG., KaplanH.B., KolterR.Biofilmformationasmicrobialdevelopment. //AnnRevMicrobiol. - 2000. - 54:49-79.
8. Брилис, В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. - 1986. - №4. - С. 210-212.
9. Flemming H.C.,Neu T.R., Wozniak D.J.The EPS matrix: the «house of biofilm cells» // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, N 22. -P. 7945-7947.
10. Hall-Stoodley L.,Stoodley P.Evolving concepts in biofilm infections // Cell Microbiol. - 2009. - Vol. 11, N 7. - P. 1034-1043.
11. Weigel L.M.[et al.] High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm // Antimicrob. Agents Chemother. - 2007. - Vol. 51, N 1. - P. 231-238.
12. Афиногенова А.Г., ДаровскаяЕ.Н.Микробные биопленки ран. Состояние вопроса //Травмотология и ортопедия России. - 2011. - 3 (61) С.119-125.
13. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации. Тверь: Триада.- 2011. 88 с.
Сведения об авторе:
Климентова Елена Георгиевна, доцент кафедры общей экологии Ульяновского государственного университета, кандидат биологических наук, доцент 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42; e-mail: kloushel@mail.ru
UDC 630:576.8:632 Klimentova E.G.
Ulyanovsk state university, e-mail: kloushel@mail.ru
THE EFFECT OF BACILLUS THURINGIENSIS 8-ENDOTOXIN ON THE LEVELOF PELLICLE FORMING ACTIVITY AND ADHESIVE PROPERTIESOF OPPORTUNISTIC PATHOGENIC BACTERIA
Found that the B. thuringiensis 8-endotoxin subsp. kurstaki introduced in a long time per os laboratory mice, lead to the development of dysbiosis, which is a change to the ability of microorganisms to film formation and adhesion properties of opportunistic pathogens, which creates conditions for the subsequent invasion of the host tissue and causes infections.
Key words: B. thuringiensis 8-endotoxin, the formation of bacterial biofilms, increased adhesiveness of microorganisms.
Bibliography:
ї. Yudina T.G., Burtseva L.I. Effect of endotoxin four Bacillus thuringiensis subspecies in different prokaryotes // Microbiologiya. - ї997.-Т66. - №ї. - S. 25 - Зї.
2. Klimentova E.G., Kuptsova A.A., Kamenek L.K., Guly V.V. Changes in the microflora of the large intestine of mice with longterm oral administration of д-endotoxin of Bacillus thuringiensis / / Selskohozjaistvennaya Biologiya. -20її. - №4. -S. її5-ї20.
3. Bondarenko V.M., Vorobyov A.A. Dysbiosis and preparations with probiotic function / / Zurn. Microbiology. - 2004. - №ї. -S. 84-92.
4. Lasa I. [et al.] Bacterial biofilms and infection / / An. Sist. Sanit. Navar. - 2005. - V.28. - ^63^75.
5. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Evolving concepts in biofilm infections / / Cell Microbiol. -2009. - Vol. її, N 7. - P. ї034-ї043.
6. Ilina T.S., Romanova J.M. AL Gunzburg Biofilms as a mode of existence of bacteria in the environment and in the host: the phenomenon of genetic control and regulation of their development / / Genetics. - 2004. - №40. - S. ї-ї2.
7. O’Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. / / Ann Rev Microbiol. - 2000. - 54:49-79.
8. Brilis V.I., Brilene T.A., JP Lentsner Method for studying the process of adhesive microorganisms / / Laboratornoe delo. -ї986. - №4. - S. 2ї0-2ї2.
9. Flemming H.C., Neu T.R., Wozniak D.J. The EPS matrix: the «house of biofilm cells» / / J. Bacteriol. - 2007. - Vol. ї89, N 22. -P. 7945-7947.
ї0. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Evolving concepts in biofilm infections / / Cell Microbiol. - 2009. - Vol. її, N 7. - P. ї034-ї043. її. Weigel L.M. [Et al.] High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm / / Antimicrob. Agents Chemother. - 2007. - Vol. 5ї, N ї. - P. 23ї-238. ї2. Afinogenov A.G., Darovskoy E.N. Microbial biofilm wounds. State-of / / Traumatologiya i Orthopedija Rossii. - 20її. -3 (6ї) в.її9-ї25.
ї3. Bondarenko V.M. The role of opportunistic bacteria in chronic inflammatory processes of various locations. Tver: Triada. -20її. 88 s.
