CC BY
65
ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ НА ИММУНИТЕТ НАНОЧАСТИЦ ОКИСЛОВ МЕТАЛЛОВ Cu и Fe
Руссу Леонид Иванович
научный сотрудник лаборатории культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии МЗ
РФ, г. Москва E-mail: plano 77@bk. ru Суетина Ирина Александровна канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории культур тканей
ФГБУ НИИ вирусологии МЗ РФ, г. Москва
E-mail: cells@rambler.ru Потапова Людмила Анатольевна канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории культур тканей ФГБУ НИИ
вирусологии МЗ РФ, г. Москва E-mail: lap2010@yandex.ru Остроумов Сергей Андреевич д-р биол. наук, проф. МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва
E-mail: ar55@yandex. ru Мезенцева Марина Владимировна д-р биол. наук, зав. лабораторией культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии МЗ
РФ, г. Москва E-mail: marmez@mail.ru
IN VITRO STUDY OF THE POTENTIAL ACTION ON IMMUNITY BY
METAL OXIDE NANOPARTICLES
Leonid Russu
research scientist of the laboratory of Cell cultures D.I. Ivanovsky Institute of
Virology, Moscow Irina Suetina
candidate of biological science, Research scientist of the laboratory of Cell cultures
D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow
Ludmila Potapova
candidate of medical science, Research scientist of the laboratory of Cell cultures
D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow
Sergey Ostroumov
doctor of biological science, professor, Moscow State University
Marina Mezentseva
D octor of biological science, Head of the laboratory of Cell cultures D.I. Ivanovsky
Institute of Virology, Moscow
АННОТАЦИЯ
Исследование in vitro проводили для изучения потенциального влияния наночастиц окислов металлов Cu и Fe на синтез цитокинов. Исследование in vitro воздействия наночастиц металлов на синтез цитокинов проводили на
перевиваемой линии клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Наши исследования являются первыми шагами, показывающими перспективность использования препаратов на основе наночастиц окислов Cu и Fe для коррекции иммунопатологических состояний при разных формах патологии.
ABSTRACT
In vitro studies were carried out to investigate the potential impacts of nanoparticles of metal oxides Cu and Fe on the synthesis of cytokines. In vitro studies of the impact of nanoparticles on the synthesis of cytokines were carried out on the endothelial cell line human embryo fibroblasts (HEF) using the methods of reverse transcription and polymerase chain reaction. Our research are the first steps, showing prospects of the use of preparations on the basis of nanoparticles oxides Cu and Fe for correction of immunopathological conditions various forms of pathology.
Ключевые слова: наночастицы окислов металлов Cu и Fe, фибробласты эмбриона человека, цитокины
Keywords: metal oxide nanoparticles, human embryo fibroblasts, cytokines
В настоящее время одним из приоритетных направлений стало создание наноконструкций, способных управлять биосистемами на молекулярном уровне [7]. Многими учеными изучается возможность применения наночастиц металлов для борьбы с бактериями и вирусами. Обсуждается вопрос использования их при опухолевых процессах [1, 2, 4, 5, 9].
Целью нашего исследования было изучение потенциального влияния наночастиц окислов металлов Cu и Fe на синтез цитокинов in vitro для прогнозирования их воздействия на параметры иммунитета.
Материалы и методы. Было проведено исследование синтеза цитокинов на уровне их транскрипции in vitro в клеточной культуре перевиваемых клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ, получены из музея клеточных культур
ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского МЗ РФ) через 48 часов после введения наночастиц Cu (CuO; Los Alamos, NM, USA, < 50 nm) в разведениях 1/4000 и 1/16000 и Fe (Fe2O3 alpha; Los Alamos, NM, USA, 20—50 нм) в разведениях 1/32 и 1/1000. Экспрессия генов интерлейкина (ИЛ)-^, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, фактора некроза опухолей (ФНО)-a, интерферона (ИФН)-а, ИФН-ß, ИФН-g, ИФН41, ИФН-Х2, ИФН-Х3 оценивалась по активности их мРНК цитокинов. Определение активности мРНК цитокинов в клетках проводили с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). В качестве положительного контроля использовали ß-актин. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Ргоmegа (G 1758) [10].
Для определения цитотоксичности препарата ОУНТ с помощью МТТ-метода [3] на культуре клеток ФЭЧ изучаемые препараты раститровывали после образования клеточного монослоя в двукратных разведениях от 1/2 до 1/1024 с помощью внесения его по 100 мкл в лунку 96-луночной плашки с 2-мя повторами на точку и инкубировали в течение 24 часов в СО2 термостате при 37 °С. Учет опыта проводился через 24 часа после внесения препаратов.
Результаты и обсуждение. Определение влияния наночастиц CuO и Fe2O3 alpha на ростовую активность клеток ФЭЧ с помощью МТТ-метода показало, что препараты не вызывали угнетение ростовой активности и жизнеспособности клеток в разведениях 1/16000—1/4000.
Показано, что в клетках человека под действием наночастиц окислов металлов CuO и Fe2O3 alpha не происходило активации экспрессии генов ИФН-а, ИФН-ß, ИФН4Л, ИФН-Х2, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-17 а также не изменялась активность конститутивно присутствующей мРНК ИЛ-8.
Отмечено, что наночастицы CuO в концентрации 1/4000, но не 1/16000, подавляли экспрессию гена ИФН-Х3 (ИФН III-типа, схожий по антивирусным свойствам с ИФН-а [14]). При этом препарат в концентрации 1/4000
способствовал активации транскрипции ИЛ-18, в условиях организма, продуцируемого моноцитами/макрофагами, участвующего в синтезе ИФН-у. При разведении препарата до 1/16000 в клетках была отмечена активация экспрессии генов ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а, в условиях организма являющихся показателями функциональной активности и ^17 [12].
Таблица 1.
Изменение экспрессии генов цитокинов под действием наночастиц СиО и
Fe2Ü3
Препараты Наличие (+) или отсутствие (-) мРНК цитокинов
ИФН-Y ИЛ-1Р ИЛ-2 ИЛ-6 ИЛ-10 ИЛ-18 ФНО-а
CuO 1/4000 - - - - - + -
CuO 1/6000 - - + + - - +
Fe2O3 alpha 1/4000 - - - + - - -
Fe2O3 alpha 1/6000 + + + + + - +
Контроль клеток - - - - - - -
Показано, что наночастицы Fe2O3 alfa в концентрации 1/16000 в клетках активировали ИФН-у и ИЛ-2, обусловливающих в организме человека и животных клеточный иммунитет, а также — ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-а. Следует отметить, что ИЛ-10 является антивоспалительным цитокином, участвующим в организме человека и животных в выработке антител и продуцируемым Treg лимфоцитами. Эти клетки в организме экспрессируют FOXP3 — транскрипционный фактор, регулирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвующих в супрессии иммунного ответа. Для регуляции иммуного ответа Treg клетки выделяют цитокины ИФН-у, ИЛ-10, TGF-в, ИЛ-35 [13].
Известно, что Т-хелперы (Th0) могут дифференцироваться в направлении Th17 под воздействием ИЛ1р, ИЛ-6, TGFP, ИЛ-23. Эти цитокины активируют экспрессию транскрипционного фактора ROR-y, выполняющего ключевую роль в реализации программы дифференциации Th17, хотя и другие транскрипционные факторы STAT3, IRF4 и BATF также играют важную роль в поддержании функций Th17. Эти клетки характеризуются экспрессией ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-17, ИЛ-22 и принимают участие в защите от внеклеточных патогенов, в регуляции противоопухолевого иммунитета. Также Th17 ассоциированны с различными аутоиммунными процессами, в том числе с аллергическими реакциями [6, 8, 11, 15]. В наших экспериментах показано, что наночастицы Fe2O3 активировали транскрипцию ИЛ1р, ИЛ-6 и ФНО-а, участвующих в синтезе ИЛ-17. При этом мРНК ИЛ-17 не экспрессировалась в клетках. Возможно, этот процесс происходил позднее срока наблюдения..
Т. о. исходя из данных, полученных in vitro, можно предположить, что наночастицы Fe2O3 alfa в условиях организма будут способны активировать Th1, Th17 и Treg лимфоциты. А наночастицы CuO, вероятно, можно будет использовать для регуляции функции макрофагального звена иммунитета, а также Th1 и Th17. Это может свидетельствовать об усилении противоинфекционного иммунитета под действием наночастиц окислов железа и меди в условиях организма. Наши исследования являются первыми шагами, показывающими перспективность использования препаратов на основе наночастиц окислов Cu и Fe для коррекции иммунопатологических состояний при разных формах патологии.
Список литературы
1. Анисимова Н.Ю., Сенатов Ф.С, Миляева С.И., Киселевский М.В. Исследование сорбционных свойств ферримагнитных наночастиц // Фундаментальные исследования, — 2011. — № 11 (часть 2): — с. 263-65
2. Бабушкина И.В., Бородулин В.Б., Коршунов Г.В., Пучиньян Д.М. Изучение антибактериального действия наночастиц меди и железа на
клинические штаммы Staphylococcus aureus // Саратовский научно-медицинский журнал, — 2010. — № 6 (1): — с. 11—14.
3. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. // М.:Медицина, 2005, — 832 с.
4. Шалашная Е.В., Горошинская И.А., Качесова П.С., Жукова Г.В., Евстратова О.Ф., Бартенева Т.А., Нескубина И.В., Бородулин В. Структурно-функциональные и биохимические изменения в органах иммунной системы при противоопухолевом действии наночастиц меди в эксперименте // БЭБиМ, — 2011 г. — № 152(11): — с. 552-57.
5. Яновский Ю.Г. Сравнительные исследования сорбционной эффективности и структуры поверхности нано- и микроразмерных магнитоуправляемых частиц для их использования в медицине и биологии // Технологии живых систем, — 2007. — № 4 (5—6): — с. 73—84.
6. Bettelli E, Korn T, Kuchroo VK. Th17: the third member of the effector T cell trilogy. Curr. Opin. Immunol., 2007.-19 (6): 652-7.
7. Ernest H., Shetty R. Impact of nanotechnology on biomedical sciences: Review of current concepts on convergence of nanotechnology with biology // J. of Nanobiotechnol. 2005. [Электронный ресурс]. Режим доступа. — URL: http://www.azonano.com/oars.asp
8. Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, Turner H, Murphy TL, Murphy KM, Weaver CT. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages // Nat. Immunol., — 2005. — № 6 (11): 1123-32.
9. Kulacki KJ, Cardinale BJ, Keller AA, Bier R, Dickson H. How do stream organisms respond to, and influence, the concentration of titanium dioxide nanoparticles? A mesocosm study with algae and herbivores // Environ Toxicol Chem., — 2012. — № 31(10):2414-22.
10. Mezentseva M.V., Suetina IA., Russu L.I., Firsova E.L., Gushhina Е.А. Effect of Single-walled Carbon Nanotubes on the Biological Properties of the Cell
Cultures of Human Embryonic Fibroblasts. 3rd International Scientific and Practical Conference "Science and Society" ISPC, — 2013. — V. 3. — Р. 175— 84.
11. Reiner SL. Development in motion: helper T cells at work. Cell, 2007.-129 (1): 33-6.
12. Stockinger B, Veldhoen M. Differentiation and function of Th17 T cells. Curr. Opin. Immunol., 2007.-19 (3): 281-6.
13. Tang Q, Bluestone JA.The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation. Nat Immunol., — 2008. — № 9(3):239-44.
14. Vilcek J. Novel interferons. Nat. Immunol., — 2003. — № 4 (1): 8-9.
15. Weaver CT, Harrington LE, Mangan PR, Gavrieli M, Murphy KM. Th17: an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties // Immunity, — 2006. — № 24 (6): 677-88.
