Научная статья на тему 'Изучение иммунокорригирующей активности солей агониста гамкбрецепторов баклофена при иммунодефиците, вызванном циклофосфамидом'

Изучение иммунокорригирующей активности солей агониста гамкбрецепторов баклофена при иммунодефиците, вызванном циклофосфамидом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
152
56
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Самотруева М. А., Тюренков И. Н.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Изучение иммунокорригирующей активности солей агониста гамкбрецепторов баклофена при иммунодефиците, вызванном циклофосфамидом»

Раздел V

РЕДАКЦИОННЫЙ ПОРТФЕЛЬ

УДК: 612.017.1: 576.8.097.1

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ СОЛЕЙ АГОНИСТА ГАМКб РЕЦЕПТОРОВ БАКЛОФЕНА ПРИ ИММУНОДЕФИЦИТЕ, ВЫЗВАННОМ ЦИКЛОФОСФАМИДОМ

Среди актуальных проблем экспериментальной и клинической иммунологии большое внимание уделяется вопросам психонейроиммунологии [4]. Важность разработки этого направления обусловлена тем, что изменения иммунологического реагирования (иммунодепрессия или иммуностимуляция) могут быть результатом нарушений регуляторных механизмов мозга. В основе нарушений психоэмоционального статуса организма лежит иммунный дисбаланс [5]. Поэтому внимание привлекают медиаторные механизмы регуляции иммунного ответа, в частности с вовлечением Г АМК-ергической системы [1]. Центральное и периферическое действие ГАМК (у-аминомасляной кислоты) опосредовано ионо-тропными ГАМКа и метаботропными ГАМКб рецепторами [3, 6]. Реализация иммуномодулирующего действия ГАМК-ергической системы осуществляется через ГАМКА-бензодиазепин-рецептор ионофорный комплекс [1, 2]. Доказано, что независимо от того, через какую из субъединиц комплекса достигается его активация, - происходит рост иммунологической реактивности. В регуляции иммунного ответа практически не изучена роль ГАМКб рецепторов, известным агонистом которых является баклофен.

Цель работы - оценка иммунокорригирующих свойств баклофена и его солей с лимонной кислотой (шифр соединения - РГПУ-184), янтарной кислоты (РГПУ-185), никотиновой кислоты (РГПУ-186), яблочной кислоты (РГПУ-188) и глутаминовой кислоты (РГПУ-190) при экспериментальном иммунодефиците.

Методика. Исследование выполнено на 240 мышах линии СВА обоего пола 3-4-месячного возраста массой 18-20 г. Животных распределяли на группы по 10 особей для каждого эксперимента. Для иммунизации использовали корпускулярный тимусзависимый антиген - эритроциты барана (ЭБ). Иммунологическую недостаточность моделировали внутри-брюшинным введением алкилирующего соединения из группы цитостатиков - циклофосфамида (ЦФА) в дозе 150 мг/кг (с учетом ЬЭ50=190 мг/кг) [7]. Животные опытных групп получали однократно внутрибрюшинно в день иммунизации (через 1 час после введения ЦФА) баклофен в дозе 10 мг/кг или его производные: РГПУ-184 (13,8 мг/кг), РГПУ-185 (9 мг/кг), РГПУ-186 (9,2 мг/кг), РГПУ-188 (9,4 мг/кг) и РГПУ-190 (9,6 мг/кг), составляющие 1/60 от ЬЭ50.

При выполнении трех серий эксперимента сформированы следующие группы: 1-я группа - контрольная, представленная иммунизированными животными, получавшими дистиллированную воду (0,5 мл). 2-я группа - контрольная с моделью ЦФА-иммуносупрессии. В опытных группах 3-8 животные получали на фоне иммуносупрессии баклофен или его производные.

Изучение влияния баклофена и его производных на клеточное звено первичного иммунного ответа на ЭБ проводили на основе реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) - 1 серия, на гуморальное звено - на основе реакции прямой гемагглютинации (РПГА) - 2 серия [8]. С целью изучения влияния фармакологических веществ на пролиферативные процессы в иммунокомпетентных органах сформировали 3 серию для определения массы и клеточности тимуса и селезенки [8].

При постановке РГЗТ иммунизацию проводили подкожным введением оптимальной дозы ЭБ (2 х108) в 100 мкл, а на 5-е сутки вводили под апоневротическую пластинку правой задней конеч-

Астраханская ГМА, каф. фармакологии, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121ms1506@mail.ru Волгоградский ГМУ,"каф. Фармакол. и биофармации ФУВ, 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1тел.: (8442) 97-81-80, fibfuv@mail.ru

ности разрешающую дозу - 10 ЭБ в 50 мкл физиологического раствора («опытная лапка»), в левую лапку соответственно 50 мкл растворителя («контрольная лапка»). Учет интенсивности местной реакции проводили через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена. После выведения животных из опыта взвешивали на торсионных весах обе задние лапки и подсчитывали индекс реакции ГЗТ (ИР) по формуле: — -— ,

ИР = —2--к х100%

Мк

где Мо - масса «опытной» лапы, Мк - масса «контрольной».

При изучении формирования гуморального звена иммунного ответа под влиянием баклофена и его производных иммунизацию проводили однократно внутрибрюшинно 5х108 ЭБ в объеме 100 мкл физ.раствора через 1-2 часа после введения изучаемого вещества. Через 7 дней после иммунизации животных выводили из эксперимента с использованием хлороформа, получали сыворотку. Для инактивации комплемента сыворотку прогревали при 1 56°С в течение 30 мин. Реакцию гемагглютинации проводили в 96-луночных планшетах; для подавления неспецифического связывания антител реакцию ставили в 50 мкл разводящей жидкости (0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на физ.растворе), в которой последовательно двукратно разводили исследуемые сыворотки. После разведения сывороток в лунки вносили по 25 мкл 1% взвеси ЭБ. Предварительный учет результатов РПГ А производили через 1 час инкубации при 1 37°С, затем планшеты переставляли в холодильник при 1 + 4°С и через 18 часов реакцию учитывали окончательно. Титр антител (наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация ЭБ) выражали в среднегеометрических показателях.

Для определения изменений массы и клеточности органов иммунной системы выведение иммунизированных ЭБ (5х108 ЭБ в объеме 100 мкл физ.раствора) животных из опыта проводили через сутки после введения изучаемых веществ. Извлекали тимус и селезенку. Лимфоидные органы взвешивали, готовили клеточные суспензии в среде 199 из расчета для селезенки 50 мг/мл, для тимуса - 10 мг/мл, фильтровали, отмывали двукратно средой 199 от частиц жировой ткани (по 10 мин при 1500 об), после чего ресуспендировали в среде 199 до исходной концентрации. Суспензии лимфоидных органов для подсчета предварительно смешивали с 3% уксусной кислотой (1:1), подкрашенной метиленовой синью, и подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в камере Гаряева. Количество ЯСК выражали в абсолютных и относительных (по отношению к массе лимфоидного органа) значениях. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директивах Европейского Сообщества (86/609/ЕС) и одобренных Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ физиологии СО РАМН. Полученные результаты подвергали статистической обработке: достоверность различий между сравниваемыми показателями оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента.

Результаты. В ходе экспериментальных исследований установлено, что моделирование иммунологической недостаточности у мышей линии СВА (2-я группа) сопровождалось снижением индекса РГЗТ на 28% (р1<0,05), подавлением выработки антиэритроцитарных антител на 58% (р1<0,001), инволюцией тимуса и селезенки соответственно на 20% и 17% (р1<0,01 и р1<0,05), а также снижением пролиферации ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке более чем на 20% (р1<0,05) по сравнению с показателями в 1-ой контрольной группе. Исследование иммунокорригирующих свойств ГАМК-ергических соединений в отношении гуморального звена иммунного ответа показало, что баклофен и вещества под шифрами РГПУ-185 и РГПУ-188 способствуют восстановлению титра антител в РПГА (показатели сходны с 1-ой контрольной группой), статистически достоверно увеличивая показатель более чем на 40 % по сравнению с группой животных с моделью иммуносупрессии (р2<0,001). Производные баклофена - РГПУ-184 и

М.А. САМОТРУЕВА . И.Н. ТЮРЕНКОВ

РГПУ-186 - устраняют циклофосфановую депрессию (р2<0,05), но уровень антиэритроцитарных антител остается ниже (на 30%) значений в 1-ой контрольной группе (рі>0,05). Химическое соединение РГПУ-190 статистически значимого влияния на процесс образования антител не оказывает (р2>0,05).

Таблица

Влияние баклофена и его производных на показатели иммунологической реактивности при ЦФА-иммуносупрессии

Статистические показатели относительно контроля 1 (11 и р1 ) и контроля 2 (12

Как видно из представленных в табл. результатов, бак-лофен, а также изучаемые химические соединения РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186 и РГПУ-190 в условиях иммуносупрессии не только статистически достоверно восстанавливают (от р2<0,05 до р2<0,001) клеточную реакцию иммунного ответа, но и стимулируют (р1<0,05) процесс образования клона анти-генспецифических Т-лимфоцитов, что проявляется увеличением индекса РГЗТ. Производное баклофена под лабораторным шифром РГПУ-188 также устраняет супрессивное действие циклофосфамида на формирование РГЗТ (р2<0,05), но стимулирующего действия не проявляет (р1<0,05).

Баклофен и все изучаемые производные в используемых дозах устраняют ингибирующее влияние циклофосфамида на лимфопролиферативные процессы в органах иммунной системы: показатели массы селезенки (более чем на 30%) и тимуса (более чем на 20%) статистически достоверно превышают таковые у мышей с моделью иммунодепрессии (р2<0,05). Производные баклофена под шифрами РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190 проявляют в отношении массы селезенки также значимый стимулирующий эффект, что выражается в достоверном увеличении показателя по сравнению с 1-й контрольной группой (р1<0,05). Следует отметить, что действие баклофена и всех изучаемых в данной работе производных на фоне циклофосфа-мидных нарушений направлено на стимуляцию процессов формирования ядросодержащих клеток в лимфоидных органах, что проявляется в статистически достоверном увеличении тимоцитов (более чем на 40%) и спленоцитов (более чем на 30%) в сравнении с контролем (от р1<0,05 до р1<0,001).

Как показал анализ полученных в ходе эксперимента результатов, применение баклофена и его производных под лабораторными шифрами РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190, способствует устранению фармако-индуцированной иммунологической недостаточности, что свидетельствует о наличии у изучаемых соединений иммунокорригирующих свойств, которые, вероятно, обусловлены

(учитывая механизм действия оригинального препарата) воздействием на ГАМКБ-рецепторы иммунокомпетентных органов и активацией ГАМК-ергической системы.

Литература

1.Девойно Л. и др. // Нейроиммунол.- 2005.- №1.— С.1-8.

2.Идова Г.В. Механизмы нейроиммуномодуляции серото-нинергической, допаминергической и ГАМК-ергической системами: Дис. ... д.б.н.— Новосибирск, 1993.

3.Калуев А.В. // Нейронауки.— 2006.— №2 (4).— С. 29—42.

4.Насонова В.А. и др. // Вест. РАН.— 1994.— № 1.— С. 4—7.

5.Полетаев А.Б. и др.Регуляторная метасистема (иммуно-нейроэндокринная регуляция гомеостаза).— М.:Медицина, 2002.

6.Семъянов А.В. // Нейрофизиол.— 2002.— № 1.— С. 82—92.

7.Турищев В.Е. Влияние циклофосфана и глицифона на кинетику первичного иммунного ответа: Дис. к.м.н.— Казань, 1987.

8.Хаитов РМ. и др. // Рук-во по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева.— М., 2005.— С. 501—514.

УДК 616.157

ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И САХАРОЛИТИЧЕ-СКИХ ФЕРМЕНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭКСТРАКТА ШУНГИТА

Н. В. СЕРЕГИНА, Т. В. ЧЕСТНОВА*

В настоящее время происходят качественные изменения этиологической структуры инфекционных заболеваний, заключающиеся в превалировании условнопатогенных микроорганизмов, среди которых доминируют бактерии, представители семейства Pseudomonadaceae. Из них особенно актуальна Pseudomonas aeruginosa, которая выделяется при гнойновоспалительных процессах различной локализации. Механизмы патогенетического действия условнопатогенных бактерий разнообразны и до конца не ясны [1]. Проблема патогенности всегда была в центре интересов микробиологов. С современной науке устарел принцип, выделяющий один фактор патогенности Pseudomonas aeruginosa, определяющий явление однозначно. Число «основных факторов» часто насчитывает более десяти [1]. Практика показывает, что необходимо выделять группу факторов патогенности, создающих условия для протекания и развития инфекционного процесса. В других работах, посвященных этой проблеме, представлен материал о таких факторах патогенности, как адгезины, гемолизины и секреторные ферменты. Было доказано бактерицидное действие гетероциклических соединений, входящих в состав ацетонового экстракта.

Цель работы - изучение протеазной активности и сахаро-литических свойств Pseudomonas aeruginosa, определение влияния ацетонового экстракта органической массы шунгитовой породы (ОМШП) на ферментативные свойства бактерии.

Протеолитические и сахаролитические ферменты играют важную роль в патогенезе синегнойной инфекции. Расщепляя белковые молекулы и сахара на низкомолекулярные продукты, эти ферменты обеспечивают микробным клеткам питательные вещества, необходимые для роста и размножения. Ферменты не обладающие достаточно высокой токсической активностью, вызывают лишь местные поражения в тканях, однако именно эти поражения способствуют проникновению Pseudomonas aeruginosa в макроорганизм, его колонизации и развитию инфекционного процесса [2]. По типу катализируемых реакций протеазы относят к классу гидролаз. Гидролитические ферменты являются модельными объектами для изучения взаимосвязи между структурой белка и функцией фермента, гидролизующего его.

Материалы и методы. Изучены 20 клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из ран, больных гнойновоспалительными заболеваниями (16) и от больных с воспалительными процессами мочевыводящих путей (4). Протеолитиче-ские свойства изучались на примере желатиназы. Мы использовали классический метод определения желатиназы - разжижение желатина. Производили посев уколом в столбик застывшего при

ИР ГЗТ, M±m, % Титр антител в РГПА, M m, lg Масса селезенки, M±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг селезенки, M±m,x105 Масса тимуса, M±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг тимуса, M±m,x104

дист. вода 11,4±0,5 1,2±0,06 102,3±3,2 2,7±0,2 38,5±1,0 3,5±0,2

ЦФА 8,2±0,6 t1=4,2 Pi<0,05 0,5±0,03 t1=10,4 P1<0,001 84,8±3,4 t1=3,7 Pi<0,05 2±0,2 t1=2,5 P1<0,05 31±1,4 t1=4,4 P1<0,01 2,8±0,2 t1=2,5 P1<0,05

баклофен +ЦФА 19,1±3,1 t1=2,5 P1<0,05 t2=3,5 P2<0,05 1,05±0,16 t1=0,6 P1>0,05 ^1>0,05 t2=3,4 P2<0,05 118,3±13,4 t1=1,2 P1>0,05 t2=2,4 P1<0,05 4,3±0,6 t1=2,5 P1<0,05 t2=3,7 P2<0,05 44,7±3,8 t1=1,6 P1>0,05 t2=3,4 P2<0,05 14,4±3,9 t1=2,8 P2<0,05 t2=3,0 P2<0,05

РГПУ- 184 +ЦФА 25,8±3,0 t1=4,7 P1<0,01 t2=5,7 P2<0,001 0,83±0,12 t1=2,8 P1<0,05 t2=2,8 P2<0,05 123±11,0 t1=1,8 P1>0,05 t2=3,3 P2<0,05 6,3±0,9 t1=4,0 P1<0,01 t2=4,6 P2<0,01 43,7±3,3 t1=1,5 P1>0,05 t2=3,5 P2<0,05 7±0,6 t1=5,6 P1>0,001 t2=6,7 P2<0,001

РГПУ- 185 +ЦФА 26,5±4,4 t1=3,4 P1<0,05 t2=4,2 P2<0,01 1,2±0,03 t1=0 t2=17,5 P2<0,001 124,6±11,0 t1=1,95 P1>0,05 t2=3,5 P2<0,05 § 4 о 4 41,1±3,2 t1=0,8 P1>0,05 t2=3,0 P2<0,05 6,1±0,9 t1=2,9 P1>0,05 t2=3,7 P2<0,05

РГПУ- 186 +ЦФА 31,7±2,4 t1=8,5 P1<0,001 t2=9,8 P2<0,001 0,87±0,13 t1=2,4 P1>0,05 t2=2,8 P2<0,05 149,3±8,4 t1=5,3 P1<0,001 t2=7,2 P2<0,001 9,0±0,9 t1=7,0 P1<0,001 t2=10 P2<0,001 42,3±2,7 t1=1,3 P1>0,05 t2=3,8 P2<0,05 9,4±1,0 t1=5,9 P1>0,001 t2=6,6 P2<0,001

РГПУ- 188 +ЦФА 17,2±2,9 t1=2,0 P1>0,05 t2=3,1 P2<0,05 1,1±0,06 t1=1,25 P1>0,05 t2=8,9 P2<0,001 140,7±10,6 t1=3,5 P1<0,05 t2=5,1 P2<0,001 5,9±0,8 t1=4 P1<0,05 t2=4,9 P2<0,01 32,6±2,3 t1=2,4 P1>0,05 t2=0,6 P2>0,05 4,8±0,6 t1=2,0 P1>0,05 t2=4,4 P2<0,01

РГПУ- 190 +ЦФА 18,1±1,8 t1=3,6 P1<0,05 t2=5,2 P2<0,001 0,75±0,12 t1=3,5 P1<0,05 t2=2,1 P2>0,05 129±10,0 t1=2,5 P1>0,05 t2=4,2 P,<0,01 7±1,0 t1=4,3 P1<0,01 t2=5,0 P2<0,001 39,5±2,0 t1=0,5 P1>0,05 t2=3,7 P2<0,05 8±0,8 t1=5,5 P1<0,001 t2=6,3 P2<0,001

* ТулГУ, мединститут

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.