CC BY
63
Раздел V
РЕДАКЦИОННЫЙ ПОРТФЕЛЬ
УДК: 612.017.1: 576.8.097.1
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ СОЛЕЙ АГОНИСТА ГАМКб РЕЦЕПТОРОВ БАКЛОФЕНА ПРИ ИММУНОДЕФИЦИТЕ, ВЫЗВАННОМ ЦИКЛОФОСФАМИДОМ
Среди актуальных проблем экспериментальной и клинической иммунологии большое внимание уделяется вопросам психонейроиммунологии [4]. Важность разработки этого направления обусловлена тем, что изменения иммунологического реагирования (иммунодепрессия или иммуностимуляция) могут быть результатом нарушений регуляторных механизмов мозга. В основе нарушений психоэмоционального статуса организма лежит иммунный дисбаланс [5]. Поэтому внимание привлекают медиаторные механизмы регуляции иммунного ответа, в частности с вовлечением Г АМК-ергической системы [1]. Центральное и периферическое действие ГАМК (у-аминомасляной кислоты) опосредовано ионо-тропными ГАМКа и метаботропными ГАМКб рецепторами [3, 6]. Реализация иммуномодулирующего действия ГАМК-ергической системы осуществляется через ГАМКА-бензодиазепин-рецептор ионофорный комплекс [1, 2]. Доказано, что независимо от того, через какую из субъединиц комплекса достигается его активация, - происходит рост иммунологической реактивности. В регуляции иммунного ответа практически не изучена роль ГАМКб рецепторов, известным агонистом которых является баклофен.
Цель работы - оценка иммунокорригирующих свойств баклофена и его солей с лимонной кислотой (шифр соединения - РГПУ-184), янтарной кислоты (РГПУ-185), никотиновой кислоты (РГПУ-186), яблочной кислоты (РГПУ-188) и глутаминовой кислоты (РГПУ-190) при экспериментальном иммунодефиците.
Методика. Исследование выполнено на 240 мышах линии СВА обоего пола 3-4-месячного возраста массой 18-20 г. Животных распределяли на группы по 10 особей для каждого эксперимента. Для иммунизации использовали корпускулярный тимусзависимый антиген - эритроциты барана (ЭБ). Иммунологическую недостаточность моделировали внутри-брюшинным введением алкилирующего соединения из группы цитостатиков - циклофосфамида (ЦФА) в дозе 150 мг/кг (с учетом ЬЭ50=190 мг/кг) [7]. Животные опытных групп получали однократно внутрибрюшинно в день иммунизации (через 1 час после введения ЦФА) баклофен в дозе 10 мг/кг или его производные: РГПУ-184 (13,8 мг/кг), РГПУ-185 (9 мг/кг), РГПУ-186 (9,2 мг/кг), РГПУ-188 (9,4 мг/кг) и РГПУ-190 (9,6 мг/кг), составляющие 1/60 от ЬЭ50.
При выполнении трех серий эксперимента сформированы следующие группы: 1-я группа - контрольная, представленная иммунизированными животными, получавшими дистиллированную воду (0,5 мл). 2-я группа - контрольная с моделью ЦФА-иммуносупрессии. В опытных группах 3-8 животные получали на фоне иммуносупрессии баклофен или его производные.
Изучение влияния баклофена и его производных на клеточное звено первичного иммунного ответа на ЭБ проводили на основе реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) - 1 серия, на гуморальное звено - на основе реакции прямой гемагглютинации (РПГА) - 2 серия [8]. С целью изучения влияния фармакологических веществ на пролиферативные процессы в иммунокомпетентных органах сформировали 3 серию для определения массы и клеточности тимуса и селезенки [8].
При постановке РГЗТ иммунизацию проводили подкожным введением оптимальной дозы ЭБ (2 х108) в 100 мкл, а на 5-е сутки вводили под апоневротическую пластинку правой задней конеч-
Астраханская ГМА, каф. фармакологии, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121ms1506@mail.ru Волгоградский ГМУ,"каф. Фармакол. и биофармации ФУВ, 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1тел.: (8442) 97-81-80, fibfuv@mail.ru
ности разрешающую дозу - 10 ЭБ в 50 мкл физиологического раствора («опытная лапка»), в левую лапку соответственно 50 мкл растворителя («контрольная лапка»). Учет интенсивности местной реакции проводили через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена. После выведения животных из опыта взвешивали на торсионных весах обе задние лапки и подсчитывали индекс реакции ГЗТ (ИР) по формуле: — -— ,
ИР = —2--к х100%
Мк
где Мо - масса «опытной» лапы, Мк - масса «контрольной».
При изучении формирования гуморального звена иммунного ответа под влиянием баклофена и его производных иммунизацию проводили однократно внутрибрюшинно 5х108 ЭБ в объеме 100 мкл физ.раствора через 1-2 часа после введения изучаемого вещества. Через 7 дней после иммунизации животных выводили из эксперимента с использованием хлороформа, получали сыворотку. Для инактивации комплемента сыворотку прогревали при 1 56°С в течение 30 мин. Реакцию гемагглютинации проводили в 96-луночных планшетах; для подавления неспецифического связывания антител реакцию ставили в 50 мкл разводящей жидкости (0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на физ.растворе), в которой последовательно двукратно разводили исследуемые сыворотки. После разведения сывороток в лунки вносили по 25 мкл 1% взвеси ЭБ. Предварительный учет результатов РПГ А производили через 1 час инкубации при 1 37°С, затем планшеты переставляли в холодильник при 1 + 4°С и через 18 часов реакцию учитывали окончательно. Титр антител (наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация ЭБ) выражали в среднегеометрических показателях.
Для определения изменений массы и клеточности органов иммунной системы выведение иммунизированных ЭБ (5х108 ЭБ в объеме 100 мкл физ.раствора) животных из опыта проводили через сутки после введения изучаемых веществ. Извлекали тимус и селезенку. Лимфоидные органы взвешивали, готовили клеточные суспензии в среде 199 из расчета для селезенки 50 мг/мл, для тимуса - 10 мг/мл, фильтровали, отмывали двукратно средой 199 от частиц жировой ткани (по 10 мин при 1500 об), после чего ресуспендировали в среде 199 до исходной концентрации. Суспензии лимфоидных органов для подсчета предварительно смешивали с 3% уксусной кислотой (1:1), подкрашенной метиленовой синью, и подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в камере Гаряева. Количество ЯСК выражали в абсолютных и относительных (по отношению к массе лимфоидного органа) значениях. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директивах Европейского Сообщества (86/609/ЕС) и одобренных Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ физиологии СО РАМН. Полученные результаты подвергали статистической обработке: достоверность различий между сравниваемыми показателями оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента.
Результаты. В ходе экспериментальных исследований установлено, что моделирование иммунологической недостаточности у мышей линии СВА (2-я группа) сопровождалось снижением индекса РГЗТ на 28% (р1<0,05), подавлением выработки антиэритроцитарных антител на 58% (р1<0,001), инволюцией тимуса и селезенки соответственно на 20% и 17% (р1<0,01 и р1<0,05), а также снижением пролиферации ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке более чем на 20% (р1<0,05) по сравнению с показателями в 1-ой контрольной группе. Исследование иммунокорригирующих свойств ГАМК-ергических соединений в отношении гуморального звена иммунного ответа показало, что баклофен и вещества под шифрами РГПУ-185 и РГПУ-188 способствуют восстановлению титра антител в РПГА (показатели сходны с 1-ой контрольной группой), статистически достоверно увеличивая показатель более чем на 40 % по сравнению с группой животных с моделью иммуносупрессии (р2<0,001). Производные баклофена - РГПУ-184 и
М.А. САМОТРУЕВА . И.Н. ТЮРЕНКОВ
РГПУ-186 - устраняют циклофосфановую депрессию (р2<0,05), но уровень антиэритроцитарных антител остается ниже (на 30%) значений в 1-ой контрольной группе (рі>0,05). Химическое соединение РГПУ-190 статистически значимого влияния на процесс образования антител не оказывает (р2>0,05).
Таблица
Влияние баклофена и его производных на показатели иммунологической реактивности при ЦФА-иммуносупрессии
Статистические показатели относительно контроля 1 (11 и р1 ) и контроля 2 (12
Как видно из представленных в табл. результатов, бак-лофен, а также изучаемые химические соединения РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186 и РГПУ-190 в условиях иммуносупрессии не только статистически достоверно восстанавливают (от р2<0,05 до р2<0,001) клеточную реакцию иммунного ответа, но и стимулируют (р1<0,05) процесс образования клона анти-генспецифических Т-лимфоцитов, что проявляется увеличением индекса РГЗТ. Производное баклофена под лабораторным шифром РГПУ-188 также устраняет супрессивное действие циклофосфамида на формирование РГЗТ (р2<0,05), но стимулирующего действия не проявляет (р1<0,05).
Баклофен и все изучаемые производные в используемых дозах устраняют ингибирующее влияние циклофосфамида на лимфопролиферативные процессы в органах иммунной системы: показатели массы селезенки (более чем на 30%) и тимуса (более чем на 20%) статистически достоверно превышают таковые у мышей с моделью иммунодепрессии (р2<0,05). Производные баклофена под шифрами РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190 проявляют в отношении массы селезенки также значимый стимулирующий эффект, что выражается в достоверном увеличении показателя по сравнению с 1-й контрольной группой (р1<0,05). Следует отметить, что действие баклофена и всех изучаемых в данной работе производных на фоне циклофосфа-мидных нарушений направлено на стимуляцию процессов формирования ядросодержащих клеток в лимфоидных органах, что проявляется в статистически достоверном увеличении тимоцитов (более чем на 40%) и спленоцитов (более чем на 30%) в сравнении с контролем (от р1<0,05 до р1<0,001).
Как показал анализ полученных в ходе эксперимента результатов, применение баклофена и его производных под лабораторными шифрами РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190, способствует устранению фармако-индуцированной иммунологической недостаточности, что свидетельствует о наличии у изучаемых соединений иммунокорригирующих свойств, которые, вероятно, обусловлены
(учитывая механизм действия оригинального препарата) воздействием на ГАМКБ-рецепторы иммунокомпетентных органов и активацией ГАМК-ергической системы.
Литература
1.Девойно Л. и др. // Нейроиммунол.- 2005.- №1.— С.1-8.
2.Идова Г.В. Механизмы нейроиммуномодуляции серото-нинергической, допаминергической и ГАМК-ергической системами: Дис. ... д.б.н.— Новосибирск, 1993.
3.Калуев А.В. // Нейронауки.— 2006.— №2 (4).— С. 29—42.
4.Насонова В.А. и др. // Вест. РАН.— 1994.— № 1.— С. 4—7.
5.Полетаев А.Б. и др.Регуляторная метасистема (иммуно-нейроэндокринная регуляция гомеостаза).— М.:Медицина, 2002.
6.Семъянов А.В. // Нейрофизиол.— 2002.— № 1.— С. 82—92.
7.Турищев В.Е. Влияние циклофосфана и глицифона на кинетику первичного иммунного ответа: Дис. к.м.н.— Казань, 1987.
8.Хаитов РМ. и др. // Рук-во по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева.— М., 2005.— С. 501—514.
УДК 616.157
ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И САХАРОЛИТИЧЕ-СКИХ ФЕРМЕНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭКСТРАКТА ШУНГИТА
Н. В. СЕРЕГИНА, Т. В. ЧЕСТНОВА*
В настоящее время происходят качественные изменения этиологической структуры инфекционных заболеваний, заключающиеся в превалировании условнопатогенных микроорганизмов, среди которых доминируют бактерии, представители семейства Pseudomonadaceae. Из них особенно актуальна Pseudomonas aeruginosa, которая выделяется при гнойновоспалительных процессах различной локализации. Механизмы патогенетического действия условнопатогенных бактерий разнообразны и до конца не ясны [1]. Проблема патогенности всегда была в центре интересов микробиологов. С современной науке устарел принцип, выделяющий один фактор патогенности Pseudomonas aeruginosa, определяющий явление однозначно. Число «основных факторов» часто насчитывает более десяти [1]. Практика показывает, что необходимо выделять группу факторов патогенности, создающих условия для протекания и развития инфекционного процесса. В других работах, посвященных этой проблеме, представлен материал о таких факторах патогенности, как адгезины, гемолизины и секреторные ферменты. Было доказано бактерицидное действие гетероциклических соединений, входящих в состав ацетонового экстракта.
Цель работы - изучение протеазной активности и сахаро-литических свойств Pseudomonas aeruginosa, определение влияния ацетонового экстракта органической массы шунгитовой породы (ОМШП) на ферментативные свойства бактерии.
Протеолитические и сахаролитические ферменты играют важную роль в патогенезе синегнойной инфекции. Расщепляя белковые молекулы и сахара на низкомолекулярные продукты, эти ферменты обеспечивают микробным клеткам питательные вещества, необходимые для роста и размножения. Ферменты не обладающие достаточно высокой токсической активностью, вызывают лишь местные поражения в тканях, однако именно эти поражения способствуют проникновению Pseudomonas aeruginosa в макроорганизм, его колонизации и развитию инфекционного процесса [2]. По типу катализируемых реакций протеазы относят к классу гидролаз. Гидролитические ферменты являются модельными объектами для изучения взаимосвязи между структурой белка и функцией фермента, гидролизующего его.
Материалы и методы. Изучены 20 клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из ран, больных гнойновоспалительными заболеваниями (16) и от больных с воспалительными процессами мочевыводящих путей (4). Протеолитиче-ские свойства изучались на примере желатиназы. Мы использовали классический метод определения желатиназы - разжижение желатина. Производили посев уколом в столбик застывшего при
ИР ГЗТ, M±m, % Титр антител в РГПА, M m, lg Масса селезенки, M±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг селезенки, M±m,x105 Масса тимуса, M±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг тимуса, M±m,x104
дист. вода 11,4±0,5 1,2±0,06 102,3±3,2 2,7±0,2 38,5±1,0 3,5±0,2
ЦФА 8,2±0,6 t1=4,2 Pi<0,05 0,5±0,03 t1=10,4 P1<0,001 84,8±3,4 t1=3,7 Pi<0,05 2±0,2 t1=2,5 P1<0,05 31±1,4 t1=4,4 P1<0,01 2,8±0,2 t1=2,5 P1<0,05
баклофен +ЦФА 19,1±3,1 t1=2,5 P1<0,05 t2=3,5 P2<0,05 1,05±0,16 t1=0,6 P1>0,05 ^1>0,05 t2=3,4 P2<0,05 118,3±13,4 t1=1,2 P1>0,05 t2=2,4 P1<0,05 4,3±0,6 t1=2,5 P1<0,05 t2=3,7 P2<0,05 44,7±3,8 t1=1,6 P1>0,05 t2=3,4 P2<0,05 14,4±3,9 t1=2,8 P2<0,05 t2=3,0 P2<0,05
РГПУ- 184 +ЦФА 25,8±3,0 t1=4,7 P1<0,01 t2=5,7 P2<0,001 0,83±0,12 t1=2,8 P1<0,05 t2=2,8 P2<0,05 123±11,0 t1=1,8 P1>0,05 t2=3,3 P2<0,05 6,3±0,9 t1=4,0 P1<0,01 t2=4,6 P2<0,01 43,7±3,3 t1=1,5 P1>0,05 t2=3,5 P2<0,05 7±0,6 t1=5,6 P1>0,001 t2=6,7 P2<0,001
РГПУ- 185 +ЦФА 26,5±4,4 t1=3,4 P1<0,05 t2=4,2 P2<0,01 1,2±0,03 t1=0 t2=17,5 P2<0,001 124,6±11,0 t1=1,95 P1>0,05 t2=3,5 P2<0,05 § 4 о 4 41,1±3,2 t1=0,8 P1>0,05 t2=3,0 P2<0,05 6,1±0,9 t1=2,9 P1>0,05 t2=3,7 P2<0,05
РГПУ- 186 +ЦФА 31,7±2,4 t1=8,5 P1<0,001 t2=9,8 P2<0,001 0,87±0,13 t1=2,4 P1>0,05 t2=2,8 P2<0,05 149,3±8,4 t1=5,3 P1<0,001 t2=7,2 P2<0,001 9,0±0,9 t1=7,0 P1<0,001 t2=10 P2<0,001 42,3±2,7 t1=1,3 P1>0,05 t2=3,8 P2<0,05 9,4±1,0 t1=5,9 P1>0,001 t2=6,6 P2<0,001
РГПУ- 188 +ЦФА 17,2±2,9 t1=2,0 P1>0,05 t2=3,1 P2<0,05 1,1±0,06 t1=1,25 P1>0,05 t2=8,9 P2<0,001 140,7±10,6 t1=3,5 P1<0,05 t2=5,1 P2<0,001 5,9±0,8 t1=4 P1<0,05 t2=4,9 P2<0,01 32,6±2,3 t1=2,4 P1>0,05 t2=0,6 P2>0,05 4,8±0,6 t1=2,0 P1>0,05 t2=4,4 P2<0,01
РГПУ- 190 +ЦФА 18,1±1,8 t1=3,6 P1<0,05 t2=5,2 P2<0,001 0,75±0,12 t1=3,5 P1<0,05 t2=2,1 P2>0,05 129±10,0 t1=2,5 P1>0,05 t2=4,2 P,<0,01 7±1,0 t1=4,3 P1<0,01 t2=5,0 P2<0,001 39,5±2,0 t1=0,5 P1>0,05 t2=3,7 P2<0,05 8±0,8 t1=5,5 P1<0,001 t2=6,3 P2<0,001
* ТулГУ, мединститут
