CC BY
38
УДК 615.37: 615.03
© М.А. Самотруева, И.Н. Тюренков, Д.Л. Теплый,
Т.К. Сережникова, М.М. Магомедов, С.В. Прилучный, 2011
М.А. Самотруева1, И.Н. Тюренков2, Д.Л. Теплый3, Т.К. Сережникова1,4, М.М. Магомедов1, С.В. Прилучный1
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ФЕНОТРОПИЛА И ЕГО ОРГАНИЧЕСКИХ СОЛЕЙ
1ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 2ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России 3ГОУ ВПО Астраханский государственный университет Территориальный центр медицины катастроф АО
В данной работе на мышах линии СВА установлено, что при иммунодепрессии, вызванной циклофосфамидом, фенотропил (25 мг/кг) и его органические соли: соединения под лабораторными шифрами РГПУ-138 (55,4 мг/кг), РГПУ-154 (62,8 мг/кг), РГПУ-155 (57 мг/кг) и РГПУ-140 (45 мг/кг) - восстанавливают клеточную и гуморальную иммунореактивность, а также лимфопролиферативные процессы в иммунокомпетентных органах, что свидетельствует о наличии выраженных иммунокорригирующих свойств.
Ключевые слова: фенотропил и его органические соли, иммунодепрессия, циклофосфамид, иммунокоррекция, нейроиммунология.
M.A. Samotrueva, I.N. Tyurenkov, D.L. Teply, T.K. Serejnikova, M.M. Magomedov, S.V. Priluchnyi IMMUNOMODULLING EFFECTS OF PHENOTROPIL AND ITS ORGANIC SALTS
The mice of line SVA were used in the experiment. There were found out that immunodepressions caused by cyclophosphamide, phenotropil (25 mg/kg) and its organic salts: combinations of laboratory figures RGPU-138 (55,4 mg/kg), RGPU-154 (62,8 mg/kg), RGPU-155 (57 mg/kg) and RGPU-140 (45 mg/kg) may restore cellular and humoral immunoreactivity, lymphoprolipherative processes in the immunocompetent organs to show the presence of expressed immunocorrecting properties.
Key words: phenotropil, its organic salts, immunodepression, cyclophosphamide, immunocorrection, neuroimmunology.
С позиций современных наук - нейроиммунофармакологии и нейроиммунофизиологии - значимую роль в реализации нейроиммунных взаимодействий в условиях нормы и патологии играют нейромедиаторы головного мозга, что делает актуальным поиск в ряду производных нейромедиаторных аминокислот новых средств, обладающих иммуномодулирующей активностью [4, 6, 8, 10, 11].
Фенотропил (№карбамоил-метил-4-фенил-2-пироллидон) - циклическое производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), обладающее широким спектром фармакологических свойств. Установлено ноотропное, нейропротекторное, антигипоксическое, вегетостабилизирующее, антиастеническое, психостимулирующее, анксиолитическое, антидепрессивное, иммунотропное и др. действие [1, 2, 3]. Являясь оригинальным отечественным препаратом, может служить основой для создания новых химических соединений.
Настоящее исследование посвящено сравнительному изучению иммуномодулирующей активности фенотропила и его новых органических солей - соединений под лабораторными шифрами РГПУ-138, РГПУ-154 , РГПУ-155 и РГПУ-140 на модели экспериментальной иммунодепрессии.
Материалы и методы.
Исследование выполнено на 200 мышах линии СВА обоего пола 3-4 месячного возраста, полученных из питомника филиала «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми «Международной конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986).
Экспериментальные животные были разделены на следующие группы (n=10): контроль № 1 представлен животными, получавшими в качестве «плацебо» однократно внутрибрюшинно физиологический раствор в эквиобъеме; в контроле № 2 использованы мыши с моделью иммунодепрессии, вызванной путем внутрибрюшинного введения циклофосфамида (ЦФА, «Деко», Россия) в дозе 100 мг/кг; опытные группы (№ 1 - № 5) - иммунодепрессированные животные, получавшие однократно внутрибрюшинно фенотропил (25 мг/кг), РГПУ-138 (55,4 мг/кг), РГПУ-154 (62,8 мг/кг), РГПУ-155 (57 мг/кг) или РГПУ-140 (45 мг/кг) соответственно. Изучаемые вещества вводили через 1 час после иммунодепрессанта ЦФА.
Изучение влияния веществ на клеточное звено иммуногенеза в условиях иммунологической недостаточности проводили на основе реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) [7]. Иммунизацию животных всех групп проводили однократным подкожным введением эритроцитов барана
(ЭБ) (1х107в объеме 100 мкл). Разрешающую дозу антигена (1х108 эритроцитов барана в объеме 20 мкл) вводили на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей («опытная» лапа), в контрлатеральную («контрольную» лапу) - физиологический раствор. Учет интенсивности местной реакции проводили через 24 ч, подсчитывая индекс реакции ГЗТ (ИР) по формуле: ИР = (Мо-Мк) / Мк х 100%, где Мо - масса «опытной» лапы, Мк - масса «контрольной» лапы.
Изучение влияния веществ на гуморальное звено иммуногенеза в условиях иммуносупрессии осуществляли на основе реакции прямой гемагглютинации (РПГА) [7]. Иммунизацию проводили однократно внутрибрюшинно 5х108 ЭБ. Через 7 дней после иммунизации животных выводили из эксперимента с использованием хлороформа, получали сыворотку. Для инактивации комплемента сыворотку прогревали при 1=56°С в течение 30 мин. РПГА для подавления неспецифического связывания антител проводили в 50 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумин («Sigma»), в которой последовательно двукратно разводили исследуемые сыворотки, с добавлением 25 мкл 1% взвеси ЭБ. Предварительный учет результатов РПГА производили через 1 час инкубации при 1=37°С, окончательно реакцию учитывали через 18 часов при t=4°C Титр антител выражали в среднегеометрических показателях.
При постановке РГЗТ и РПГА животным контрольной группы № 2 и опытных групп циклофосфамид вводили через 1 час после иммунизации ЭБ.
Для определения изменений массы и клеточности иммунокомпетентных органов в условиях иммуносупрессии выведение животных из опыта проводили через сутки после введения изучаемых веществ. Извлеченные тимус и селезенку взвешивали, готовили клеточные суспензии в среде 199 из расчета для селезенки 50 мг/мл, для тимуса - 10 мг/мл, фильтровали, отмывали двукратно средой 199 от частиц жировой ткани (по 10 мин при 1500 об/мин), после чего ресуспендировали в среде 199 до исходной концентрации. Суспензии лимфоидных органов для подсчета предварительно смешивали с 3% уксусной кислотой (1:1), подкрашенной метиленовой синью, и подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в камере Горяева.
Исследование проводилось в соответствии с существующими международными этическими и научными стандартами качества планирования и проведения исследований на животных [9]. Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Для определения вероятных изменений между показателями опытных и контрольных животных использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение.
Однократное внутрибрюшинное введение ЦФА в дозе 100 мг/кг сопровождается снижением индекса клеточно-опосредованной реакции замедленного типа и уровня антиэритроцитарных антител в РПГА, а также подавлением лимфопролиферативных процессов в тимусе и селезенке (все показатели у мышей в контрольной группе № 2 статистически достоверно ниже параметров иммунореактивности у животных, получавших физиологический раствор) (pi<0,05) (рис. 1).
Исследование иммуномодулирующих свойств фенотропила и его солей в отношении гуморального звена иммуногенеза в условиях воздействия иммунодепрессанта показало, что фенотропил и РГПУ-154 способствуют восстановлению антителообразования (показатели сходны с 1-ой контрольной группой), статистически достоверно увеличивая титр антител в РПГА более чем в 3 раза по сравнению с группой животных с моделью иммуносупрессии (p2<0,05). РГПУ-138 и РГПУ-155 также устраняют циклофосфановую депрессию, увеличивая титр гемагглютининов по сравнению с контролем № 2 более чем в 2,5 раза (p2<0,05). Наименьшую активность проявило соединение РГПУ-140, под влиянием которого титр антител в РПГА увеличился по сравнению с контролем № 2 лишь на 50 %, не достигнув показателей в контроле № 1 (p2>0,05, p1<0,05).
Изучение клеточной иммунореактивности под влиянием фенотропила и РГПУ-138 в условиях иммуносупрессии показало, что указанные вещества не только восстанавливают клеточную реакцию иммунного ответа, повышая ИР ГЗТ по сравнению с контрольной группой № 2 более чем в 2 раза (p2<0,05), но и стимулируют процесс образования клона антигенспецифических Т-лимфоцитов, что проявляется увеличением показателя более чем на 50% по сравнению с группой животных, получавших физиологический раствор (p1<0,05). Максимальное значение клеточной стимуляции отмечается при введении РГПУ-138: ИР ГЗТ превышает показатель в группе животных, получавших эталонный препарат более чем на 40%. РГПУ-154 и РГПУ-155 также устраняют супрессивное действие циклофосфамида на формирование РГЗТ (p2<0,05), показатель клеточного звена иммунитета достигает фоновых значений в контрольной группе № 1. РГПУ-140 на клеточное звено иммуногенеза влияние не оказало.
Изучаемые ГАМК-ергические вещества вызывают также изменения морфометрических показателей органов иммунной системы у лабораторных животных с иммунной недостаточностью. Фенотропил и его соли - РГПУ-138, РГПУ-155, РГПУ-140 - устраняют ингибирующее действие циклофосфамида на пролиферативные процессы в селезенке: масса селезенки мышей опытных групп превышает таковой показатель в группе животных с моделью иммунной недостаточности более чем на 50% (p2<0,05), достигая значения интактных животных. На фоне введения РГПУ-154 масса селезенки увеличилась лишь на 22 %
(p2>0,05), не достигнув показателей «нормы» в контрольной группе № 1. Количество спленоцитов под влиянием РГПУ-155 и РГПУ-140 подвержено более значимым изменениям, нежели под влиянием других изучаемых в данной работе веществ; при этом отмечается увеличение количества ЯСК в 1 мг селезенки животных опытных групп по сравнению с контролем № 2 более чем в 2 раза (p2<0,05). Наиболее выраженные корригирующие свойства в отношении пролиферативных процессов в тимусе проявляет эталонный препарат - фенотропил: наблюдается существенное увеличение массы органа и количества тимоцитов в сравнении с иммунодепрессированными животными в контроле № 2 (p2<0,05). Химические соединения под лабораторными шифрами РГПУ -138, РГПУ-155 и РГПУ-140 оказывают неравнозначное действие на тимус: РГПУ-155 достоверно увеличивает массу тимуса (p2<0,05), вызывая незначительные, но положительные изменения клеточного состава (p2>0,05); РГПУ-138 и РГПУ-140 увеличивают количество кариоцитов более чем на 20 %, однако, мало влияют на массу органа (p2>0,05). Соединение РГПУ-154 влияния на процессы пролиферации в тимусе не оказывает.
Л
1 2
< и
S 0,8
и
§ 0,6 -I
н s
H
fr
s H
3 4
6 7
2
3
4
5
6
7
5
Рис. 1 Влияние фенотропила и его органических солей на формирование РГЗТ, РПГА, а также на массу и клеточность иммунокомпетентных органов в условиях иммунодепрессии
1 - контроль № 1 (физ. раствор); 2 - контроль № 2 (ЦФА, 100 мг/кг); 3 - фенотропил (25 мг/кг) + ЦФА (100 мг/кг); 4 - РГПУ-138 (55,4 мг/кг) + ЦФА (100 мг/кг); 5 - РГПУ-154 (62,8 мг/кг) + ЦФА (100 мг/кг); 6 - РГПУ-155 (57 мг/кг) + ЦФА (100 мг/кг); 7 - РГПУ-140 (45 мг/кг) + ЦФА (100 мг/кг)
ЦФА - циклофосфамид; ИР ГЗТ - индекс реакции гиперчувствительности замедленного типа; РПГА - реакция пассивной гемагглютинации
* - р < 0,05 по сравнению с контролем № 1; А - р < 0,05 по сравнению с контролем № 2.
Сравнительный анализ активности фенотропила и его новых органических солей показал, что в качестве объекта для дальнейших иммунофармакологических исследований интерес вызывает соединение РГПУ-138, демонстрирующий в отношении клеточного звена иммуногенеза наиболее выраженный эффект, превышающий действие эталонного препарата более чем на 40%.
Полученные результаты согласуются с данными литературы об иммунотропной активности многих ГАМК-ергических средств, в том числе и фенотропила. В цикле работ Л.В. Девойно с соавторами было показано, что ГАМК-позитивные вещества, способствующие активации ГАМК-ергической системы, вызывают повышение иммунологической реактивности в связи с наличием на мембране иммунокомпетентных клеток (преимущественно, лимфоцитов) специфических рецепторов к нейромедиаторам [4, 5]. В клинической работе М.М. Герасимовой продемонстрировано, что фенотропил восстанавливает иммунологические показатели у пациентов, перенесших ишемический инсульт, что является важным фактором нейроиммунопротективного действия этого препарата [3]. В наших экспериментах фенотропил и его новые органические соли проявили выраженное влияние на гуморальное и клеточное звенья иммуногенеза, а также на лимфопролиферативные процессы в иммунокомпетентных органах на модели циклофосфамидной иммунодепрессии, что свидетельствует об иммунокорригирующем действии веществ.
Таким образом, наличие у фенотропила и его органических солей выраженных иммунокорригирующих свойств указывает на возможность использования их при нейроиммунных расстройствах, связанных с развитием иммунодефицитных состояний, спровоцированных психоэмоциональными травмами, а также делает актуальным дальнейшую разработку химических соединений под лабораторными шифрами РГПУ-138, РГПУ-154, РГПУ-155 и РГПУ-140 в плане создания новых нейроиммуномодуляторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахапкина В.И., Воронина Т. А. Спектр фармакологических эффектов фенотропила // Фарматека. -2005. - № 13. - Т. 108. - С. 19-25.
2. Белоусов Ю.Б., Мухина М.А. Фенотропил - ноотропный препарат нового поколения // Качественная клиническая практика. - 2005. - № 3. - С. 1-12.
3. Герасимова М.М., Чичановская А.В., Слезкина А. А.. Клинико-иммунологические аспекты влияния фенотропила на последствия церебрального инсульта // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2005. - № 5. - С. 63-64.
4. Девойно Л.В., Идова Г.В., Белецкая И.О. Роль гипофиза в иммуномодулирующем влиянии ГАМК-ергической системы // Физиологический журнал им. М.И. Сеченова. - 1990. - № 6. - С. 808-812.
5. Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю. Нейромедиаторные системы в психонейроиммуномодуляции: допамин, серотонин, ГАМК, нейропептиды. - Новосибирск, 1993. - 237 с.
6. Корнева Е. А. Введение в иммунофизиологию. - СПб., 2003. - 48 с.
7. Хаитов Р.М., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебров А.И. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - М., 2005. - 840 с.
8. Alves G.J., Palermo-Neto J. Neuroimmunomodulation: the cross-talk between nervous and immune systems // Rev. Bras. Psiquiatr. - 2007. - Vol. 29 (4). - Р. 363-369.
9. Directive 2004/10/EC on the principles of GLP.
10. Fleshner M, Laudenslager ML. Psychoneuroimmunology: then and now // Behav. Cogn. Neurosci Rev. -2004. - № 2. - Р. 114-130.
11. Irwin M.R. Human psychoneuroimmunology: 20 years of discovery // Brain Behav. Immun. - 2008. -Vol. 22 (2). - Р. 129-139.
Самотруева Марина Александровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакогнозии с курсом фармацевтической технологии и биотехнологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.
Тюренков Иван Николаевич, профессор, доктор медицинских наук, зав. кафедрой фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.
Теплый Давид Львович, профессор, доктор биологических наук, зав. кафедрой физиологии и морфологии человека и животных ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет», 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1
Сережникова Татьяна Константиновна, соискатель кафедры фармакогнозии с курсом фармацевтической технологии и биотехнологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, анестезиолог-реаниматолог «Территориальный центр медицины катастроф АО».
Магомедов Магомед Мухтарахмедович, врач-интерн кафедры неврологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.
Прилучный Сергей Викторович, врач-ординатор кафедры биохимии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.
