CC BY
143
УДК 57.083.132
ИЗУЧЕНИЕ И ПОДБОР РЕЖИМА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ АгОТОВАСТЕЫСНЫООСОССиМ НА ФЕРМЕНТАЦИОННОМ КОМПЛЕКСЕ ОКА МФ — 100
Петенко Александр Иванович д.с-хн., профессор
Гнеуш Анна Николаевна аспирант
Дмитриев Владимир Игоревич Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
Представлены материалы по изучению и подбору режимов культивирования АгоТюЬайегсЬгоососсит, соответственно повышение титра клеток (КОЕ) и повышение выхода микробного полисахарида, что способствует продлению сроков хранения готовой продукции
Ключевые слова: РЕЖИМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ,
АготовАСТЕЯ сжоососсим,
ПОЛИСАХАРИД, ФЕРМЕНТАЦИОННЫЙ КОМПЛЕКС
UDC 57.083.132
THE STUDY AND SELECTION OF MODES OF AZOTOBACTER CHROOCOCCUM CULTIVATION ON OKA MT — 100 BATCH FERMENTATION COMPLEX
Petenko Alexander Ivanovich Dr.Sci.Agr., professor
Gneush Anna Nikolaevna postgraduate student
Dmitriev Vladimir Igorevich KubanStateAgrarianUniversity, Krasnodar, Russia
The article presents the materials of the study and selection of modes of Azotobacterchroococcum cultivation due to increasing the colony formed units (CFU) and improving the synthesis of microbial polysaccharide that prolongs the shelf life of the finished product
Keywords: CU^ATINOBSMO^VIEM’, AZOTOBACTER CHROOCOCCUM, POLYSACCHARIDES,
BATCH FERMENTATION
Интенсификация технологии микробиологического синтеза - изучение и подбор режимов культивирования является одной многоаспектной проблемой получения биомассы микроорганизмов с высоким титром клеток (КОЕ) и наилучшими физико-химическими показателями конечного продукта. Управляемое культивирование может привести к сокращению времени выращивания микроорганизмов и повысить как качественные, так и количественные показатели продукта ферментации.
Объектом исследования является депонированная в ВКПМ под № В-6010 культура Аго^Ьа^егсИгоососсит В 35 входящая в группу аэробных грамотрицательных бактерий фиксирующих молекулярный азот. Молодые клетки Аго1оЬас1егс1/1гоососс111пщзед,ставляют собой короткие, утолщенные палочки с тонкой капсулой, которая иногда отсутствует, из-за чего кокки находятся
достаточно близко друг к другу, представляя парные (диплококки) и тетроидные (тетрококки) образования. По мере старения они теряют свою подвижность, покрываются общей капсулой. В жидких средах с хорошей аэрацией сроки развития азотобактера сокращаются до нескольких суток [1,4,6].
Азот - основной элемент, определяющий урожайность сельскохозяйственных культур. Вместе с тем из большого числа разнообразных соединений азота, встречающихся в почве растения в основном могут использовать минеральные формы этого элемента. Еще в 1901 году М. Бейеринком открыта аэробная бактерия усваивающая молекулярный азот -Аго^ЬаМегсНгоососсит размножающаяся при соответствующих условиях в ризосфере сельскохозяйственных культур, что и дало основу утверждать о возможности данного микроорганизма улучшать азотное питание растений[5].Фиксация молекулярного азота атмосферы азотобактером способствует обогащению почвы и водоемов связанными формами азота легкодоступными для усвоения их микроорганизмами и высшими растениями. Азотобактер способен фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара[2].
Источником азота для азотобактера могут служить так же разнообразные минеральные (соли аммония, азотной и азотистой кислот) и органические (мочевина, различные аминокислоты) соединения. Однако если азотобактер развивается только за счет связанного в среде азота, он не выполняет своей основной функции - фиксации молекулярного азота. По отношению к источникам углерод азотобактер является полифагом, хорошо усваивает разнообразные углеводы (моно- и дисахара, некоторые полисахариды), органические кислоты, многоатомные спирты (глицерин, манниг) и другие вещества[3].Количество и природа внеклеточных выделений, таких как стимуляторы роста растений - гиббереллины, гетероауксины, индолилуксусная кислота и комплекс внеклеточных полисахаридов азотобактера зависит от вида, штамма организма, возраста культуры и от условий её выращивания. Культура Аго^ЬаМегсНгоососситВ 35 в промышленных условияхвыступает активным продуцентом гетерополисахаридов-альгинатов, которые являются аналогом полисахарида агара добываемого из морских
водорослей, что определяет ценность культуры. Углеводный состав гетерополисахарида капсулы исследуемой культуры представлен 87 % глюкозы и 3 % уроновой кислоты, а также большим количеством О-глюкозы, несколько меньшим О-галактозы и незначительным количеством маннозы и глюкуроновой кислоты. Данные литературы подтверждают наличие в составе полисахарида азотобактера дезоксисахара. [7,11].
Количество полисахаридов в процессе культивирования является важным показателем, так как полисахарид защитной капсулы обеспечивает наилучшую сохраняемость биомассы в процессе хранения, является одним из основных источников энергии. Его образование происходит в процессе выращивания культуры, количество зависит от режима культивирования, главным образом от температуры. Кроме того, полисахарид находится не только в капсуле, но и выделяется во внешнюю среду, что обуславливает высокую вязкость культуральной жидкости после культивирования [5,8]. Так же следует учесть способность микробных полисахаридов в адсорбции токсичных метаболитов в желудочно-кишечном тракте сельскохозяйственных животных при использовании культуры в составе кормовых добавок. [10].
Целью работы является изучение и подбор режимов культивирования Аго^Ьа^егсИгоососсит В35, исследование динамики роста титра клеток (КОЕ) и повышенного выхода микробного полисахарида.
Выращивание культуры производилось на ферментационной установке «Ока МФ-100», представленной на рисунке 1.
Рисунок 1 - Ферментационная установке «Ока МФ-100»
1Р! !|Ю I В №Г ’ нИР
Л з.Л в?
\ 1 * ■'"Г и 1 ; Д. \ 1 ;; ■ Щ
Установка предназначена для реализации процессов культивирования микроорганизмов, биосинтеза, биокатализа и биотрансформации биологически активных веществ по энергосберегающей технологии с использованием в качестве продуцентов бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, микроводорослей и тканей.
Установка имеет набор компьютерных программ, обеспечивающих режимы периодического и непрерывного культивирования микроорганизмов.
Культивирование осуществлялось в условиях строгой чистоты культуры, что связано со стерилизацией как основной, так и вспомогательной аппаратуры, а так же всех компонентов, поступающих в ферментер.
Непосредственно процедура непрерывной ферментации проводилась по следующему алгоритму: загрузка среды из исходной емкости в ферментер, стерилизация, охлаждение, посев инокулята через верхний паростерилизуемый разъем, включение аэрирующего воздуха, системы терморегулирования, пульсаторов и контроль за процессом путем отбора проб через нижний паростерилизуемый разъем [8,9].
Хранение музейной ъут>ту\)ъ\А1о№Ьа&егс}\гоососсит В 35 взятой из всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) депонированная под № В-6010осуществляли на плотной питательной среде Виге следующего состава (г/л дистилированой воды): маннит - 10,0; К2НР04 - 0,64; КН2Р04 - 0,16; ШС! - 0,2; ШС! - 0,2; MgS04 х 7Н20 - 0,2; СаС12 - 0,1; со
следующими микроэлементами (мг/л)(х 100 конц): FeSC>4 х 7 Н2О - 2,5; Н3ВО3 2.9; C0SO4X 7 Н20 - 1,2; C11SO4X 7 Н20 - 0,1; МпС12х 4 Н20 - 0,09; Na2Mo04x 2 Н20 -2,5; ZnS04 х 7 Н20 - 1,2 [10].
Активная кислотность для оптимального ростакультуры Azotobacterchroococcum В 35 должна быть в пределах 7,0± 0,2 на начальном этапе роста (0-6 ч.), ас 12 часа культивирования pH поддерживали около 6,0. Для поддержания кислотности в указанных приделах в качестве титранта использовали 5% раствор КОН.
Маточную культуру Azotobacterchroococcum В 35готовили на плотной среде Эшби следующего состава (г/л дистиллированной воды): К2НР04 - 0,2; MgS04 . 7Н20 - 0,2; NaCI - 0,2; КН2Р04 - 0,1; СаСОз - 5,0; маннит (или сахароза) - 20.0; агар - 20,0; вода дистиллированная[3].
После получения маточной культуры проводили подготовку засевной культуры на жидкой среде Эшби на ротационном шейкере в течение72 часов, объем составил 800 мл с начальным титром 6,5х103кл/мл при температуре 30°С.
Для проведения непосредственного процесса ферментации культуры Azotobacterchroococcum В 35 были подобраны 2 среды - мелассно-производственная и Эшби, как наиболее оптимальные для культивирования исследуемой культуры. На основании проведенных ферментаций Azotobacterchroococcum В 35 на разных средах установили, что полученные результаты как на мелассно-производственной, так и на среде Эшби практически не отличаются ни по титру клеток, ни по количеству полисахарида в культуральной жидкости, что и повлияло на выбор мелассно-производственной среды как среды для культивирования микроорганизмов, так как является наиболее выгодной с экономической точки зрения [12].
Процесс ферментации осуществлялся на ферментационной установке «Ока МФ-100» в течение 24 часов. Для периодического анализа и регулировки процесса ферментации проводили отбор проб в стерильных условиях. В отобранных пробах определили такие показатели как редуцирующие вещества (рВ, %)
-титрометрическим методом по Бертрану, количество клеток (КОЕ) - методом высева на плотные среды (метод Коха), количество полисахарида (г\л) -методом спиртоосаждения, показатель активной кислотности(рН) - потенциометрическим методом [2]. Микроскопированием отобранного материала определяли изменение капсулы клеток культуры Аго^ЬаМегсНгоососситВ 35в процессе роста. Следует учесть, что контроль ферментационного процесса проводился непосредственно от взятия музейной культуры до получения конечного продукта ферментации, что представлено в таблице 1.
Таблица 1 - Стадии контроля ферментационного процесса культуры
АюШЬа^егсИгоососситВ 35
№ п/п Стадия Объект контроля Периодичность Метод контроля
1 Выращиван ие посевного материала 1 Физиологическое состояние культуры 20тсутствие посторонней микрофлоры Отбор и анализ проб из пробирок Микроскопирование, методом высева на плотные среды (метод Коха
2 Выращиван ие маточной культуры 1 Физиологическое состояние культуры 2 Отсутствие посторонней микрофлоры В конце стадии выращивания Микроскопирование, метод высева на плотные среды (метод Коха)
3 Подготовка засевной культуры (72 часа) 1 Физиологическое состояние культуры 2 Отсутствие посторонней микрофлоры 0,12,24,36,48,60, 72 часу роста культуры Микроскопирование, метод высева на плотные среды (метод Коха)
4 Процессы ферментац ии (24 часа) редуцирующие вещества (рВ, %) количество клеток (КОЕ) количество полисахарида (г\л) показатель активной кислотности (pH) - 0,6,8,12,16,18,24 часа роста культуры Титрометрический метод по Бертрану, метод высева на плотные среды (метод Коха), метод спиртоосаждения, потенциометрический метод
Количество редуцирующих веществ после 12 часов культивирования резко снижается, что вызвано введением культуры клеток в «экстремальные» для неё условия. Клетки при резком снижении температуры культивирования с 30 до 20°С, начинают активное потребление редуцирующих веществ, с целью увеличения
защитной капсулы клетки. На рисунке 2 представлены изменение количества редуцирующих веществ в процессе культивирования культуры Аю^Ьа^егсИгоососситВ 55[13].
Рисунок 2 - Изменение количества редуцирующих веществ в процессе культивирования Аю^Ьа^егсИгоососситВ 35.
В процессе культивирования Аго^Ьа^егсНгоососситВ 35 наблюдается повышение синтеза полисахарида, динамика роста представлена на рисунке З.Это объясняется тем, что попадая в экстремальные условия клетки накапливают большое количество полисахарида образуя капсулы, а так же выделяют его в среду, чем обусловлена повышенная вязкость культуральной жидкости. Именно количество полисахарида оказывает влияние на увеличение срока годности культуральной жидкости ,а в последствии и биопрепарата[14].
Рисунок 3 -Изменение количества полисахарида в процессе культивирования
Аю^Ьа^егсИгоососситВ 35.
На протяжении всего периода культивирования определяли количество клеток исследуемой культуры микроорганизма, данные представлены в таблице 2, из которой следует, что титр клеток в течение 24 часов культивирования повышался, а резкое снижение температуры не повлияло на данный показатель, что связано с наличием редуцирующих веществ, являющиеся источником энергии для клетки количество через 24 часа ферментации составило 0,6 %
Таблица 2 - Титр Лю^Ьа^егсНгоососситВ 35 при изменении температурного режима в процессе культивирования.
Время культивирования, ч 0 6 8 12 16 18 24
Температура культивирования,°С 30 30 30 30 20 20 20
КОЕ кл\мл 1,6x104 8,1x104 2,5х105 1,2x106 7,2х106 5,2x10 7 7,7х108
Процесс культивирования характеризуется интенсивным использованием источника углерода для построения капсулярного вещества, что подтверждалось нашими микроскопически исследованиями, проведенными на универсальных микроскопах проходящего и отраженного света для медико-биологических исследований серии «AxioImager». Полученные микроизображения культуры представлены на рисунке 3, на которых видна как морфология клеток, так же и наличие полисахаридной защитной капсулы [17]
Рисунок 3 - Микрофотография культуры Аю^Ьа^егсИгоососсит В 55после а) 12 и б) 24 часов культивирования (Ув. бООх)
а) б)
В результате трех последовательных ферментаций были определены оптимальные условия культивирования Аю^Ьа^егсНгоососситВ 35. Температурный оптимум для накопления клеток составил 30°С, а для повышенного получения полисахарида 20°С, аэрация была в пределах 1-2 л/л/мин, обороты мешалки -150 об/мин, значение pH поддерживалось в около 6,0[15,16].
После получения в ферментере биомассы клеток с заданным титром производили асептическую расфасовку культуральной жидкости с клетками в подготовленные асептические емкости. Рекомендуемая температура хранения биопрепарата- +5°С.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о целесообразности применения подобранного режима культивирования как в лабораторном, так и промышленном производствах, что подтверждено пилотным культивированием Аю^Ьа^егсНгоососситВ 55наферментационной установке «Ока МФ-100».
Список литературы:
1. Аркадьева 3. А., Безбородов А. М., Блохина И. Н. Промышленная микробиология. Учеб. Пособие. М., Высш.шк. 1989.-688 с. ISBN 5-06-001482-7, ББК 28.4 П 81, УДК 663.18
2. Беляк В.Б. Биологизация сельскохозяйственного производства. П., «Пензенская правда», 2008.-320 с.
3. Петенко А.И., Кощаев А.Г.,Жолобова И.С., Сазонова НС. Биотехнология кормов и кормовых добавок. Учеб. пособие; Кубанский ГАУ. - Краснодар, 2011. - 454 с.
4 Бирюков В.В., КантереВ.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., Наука, 1985. - 78-93 с.
5. Воробьева Л.И. Техническая микробиология. М., Наука, 1987. 148 с.
6 Зайцева Г.Н., Биохимия Азотобактера. М., Наука, 1965 г., 304 с.
7 Кириченко Е.В.Использование AzotobacterchroococcumnjiK создания комплексных биологических биопрепаратов. /Кириченко Е.В., Коць C^.//Biotechnologia Acta - 2011 - № 3. С. 074-081.
8. Кощаев А. Г. Кормовая добавка на основе ассоциативной микрофлоры: технология получения и использование / А. Г. Кощаев, А. И. Петенко // Биотехнология. - 2007. - № 2. - С. 57-62.
9. Кощаев А. Кормовые добавки на основе живых культур микроорганизмов / А. Кощаев, А. Петенко, А. Калашников // Птицеводство. - 2006. - № 11. - С. 43-45.
10. Матреничева В.В., Иванова А.А., Волкова О.Б. Химико-ферментативная обработка пищевых волокон растительного сырья//Пищевая промышленность, 2004. №8. С 7-12
11 Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М.,Наука, 1975., 341 с.
12 Пат. 2437864, Российская Федерация, MITKC05F3/00, А01СЗ/00, C05F11/08.Способ
микробиологической переработки птичьего помета/ В.И. Дмитриев, И.В.Мартынова. Л.И. Кочкина. Опубл. 27.12.2011. Бюл. № 7.
13. Перт СДж Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978, С.144-165, 249-258. УДК 576.8.093.3+578.085.23.
14. Роуз Э. Химическая микробиология. М.: Мир, 1971, С.259-265. УДК 576.8
15.Самуйленко А.Я. Основы биотехнологии производства биологических препаратов (Теоретические основы, оборудование, технологические линии)/ А.Я Самуйленко, Е.А Рубан. -М., 2000. 567-612 с.
16.Семенова Л. Э.Изучение параметров аэрации-перемешивания на процесс биосинтеза в микробиологических экспериментах. - Антибиотики, 1983, № 1. с 10-14.
17. Хотянович А. В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе: Методические рекомендации Л.: Б., 1991. 60 с.
References
1. Arkad'eva 3. A., Bezborodov А. М., Blohina I. N. Promyshlennaja mikrobiologija. Ucheb. Posobie. М., Vyssh.shk. 1989.-688 s. ISBN 5-06-001482-7, BBK 28.4 P 81, UDK 663.18
2. Beljak V.B. Biologizacija sel'skohozjajstvennogo proizvodstva. P., «Penzenskaja pravda», 2008.-320 s.
3. Petenko A.I., Koshhaev A.G.,Zholobova I.S., Sazonova N.S. Biotehnologija kormov i kormovyh dobavok. Ucheb. posobie; Kubanskij GAU. - Krasnodar, 2011. - 454 s.
4 Birjukov V.V., KantereV.M. Optimizacija periodicheskih processov mikrobiologicheskogo sinteza. М.,
Научный журнал КубГАУ, №94(10), 2013 года Nauka, 1985.-78-93 s.
5. Vorob'eva L.I. Tehnicheskaja mikrobiologija. М., Nauka, 1987. 148 s.
6 Zajceva G.N., Biohimija Azotobaktera. М., Nauka, 1965 g., 304 s.
7 Kirichenko E.V.Ispol'zovanie Azotobacterchroococcumdlja sozdanija kompleksnyh biologicheskih biopreparatov. /Kirichenko E.V., Кос' S.Ja./ZBiotechnologia Acta-2011 - № 3. S. 074-081.
8. Koshhaev A. G. Kormovaja dobavka na osnove associativnoj mikroflory: tehnologija poluchenija ispol'zovanie / A. G. Koshhaev, A. I. Petenko // Biotehnologija. - 2007. - № 2. - S. 57-62.
9. Koshhaev A. Kormovye dobavki na osnove zhivyh kul'tur mikroorganizmov / A. Koshhaev, A. Petenko, A. Kalashnikov // Pticevodstvo. - 2006. - № 11. - S. 43-45.
10. Matrenicheva V.V., Ivanova A.A., Volkova O.B. Himiko-fermentativnaja obrabotka pishhevyh volokon rastitel'nogo syr'ja// Pishhevaja promyshlennost', 2004. №8. S 7-12
11 Mishustin E.N. Mikroorganizmy i produktivnost' zemledelija. М.,Nauka, 1975., 341 s.
12 Pat. 2437864, Rossijskaja Federacija, MPKC05F3/00, A01C3/00, C05Fll/08.Sposob mikrobiologicheskoj pererabotki ptich'ego pometa/ V.I. Dmitriev, I.V.Martynova. L.I. Kochkina. Opubl. 27.12.2011. Bjul. №7.
13. Pert S.Dzh Osnovy kul'tivirovanija mikroorganizmov i kletok. М.: Mir, 1978, S.144-165, 249-258. UDK 576.8.093.3+578.085.23.
14. Rouz Je. Himicheskaja mikrobiologija. М.: Mir, 1971, S.259-265. UDK 576.8 15.Samujlenko A.Ja. Osnovy biotehnologii proizvodstva biologicheskih preparatov (Teoreticheskie osnovy, oborudovanie, tehnologicheskie linii)/ A.Ja Samujlenko, E.A Ruban. - М., 2000. 567-612 s.
16.Semenova L. Je.Izuchenie parametrov ajeracii-peremeshivanija na process biosinteza v mikrobiologicheskih jeksperimentah. - Antibiotiki, 1983, № 1. s 10-14.
17. Hotjanovich A. V. Metody kul'tivirovanija azotfiksirujushhih bakterij, sposoby poluchenija i primenenija preparatov na ih osnove: Metodicheskie rekomendacii L.: B., 1991. 60 s.
