Изучение генетического разнообразия ротавирусов группы а, циркулирующих на территории Одесской области Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЕПІДЕМІОЛОГІЯ

© П. С. Малахов

УДК 613. 32:616. 36 - 002. 1 - 036. 22 (477. 74)

П. С. Малахов

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ОДЕССКОЙ ОБЛАСТИ

Одесская городская санитарно-эпидемиологическая станция (г. Одесса)

Данная работа является фрагментом научной темы «Комплексная гигиеническая оценка факторов риска для здоровья населения в современных социально-экологических условиях (на примере Одесской области)», № гос. регистрации 0106и010824.

Вступление. Среди возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ) ротавирусам (РВ) принадлежит ведущая роль [2]. К настоящему времени в мире накоплена обширная информация о значительном генетическом и антигенном многообразии РВ. Среди РВ человека группы А различают 100 серотипов (детерминируются гликопротеином УР7), 9 «Р» - серотипов (детерминируются протеазо- чувствительным белком VP4) и 0 [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов РВ, за счет существования различных комбинаций 0 и [Р] [10].

В 2006 годутолько в странах Европейского Союза было зарегистрировано 3,6 млн. случаев ротави-русной инфекции (РВИ), 87 тыс. госпитализаций, 213 летальных исходов [8]. В Украине большинство случав ОКИ до сих пор остаются нерасшифрованными, в связи с тем, что обследование пациентов с симптомами гастроэнтеритов проводится преимущественно на наличие бактериальных патогенов с использованием стандартных микробиологических методов, за редким исключением этот перечень дополняется исследованием клинического материала экспресс-тестами или применяют коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов РВ группы А. В настоящее время для диагностики РВИ чаще других применяются такие методы детекции как иммуноферментный анализ (ИФА) с моно- и поликлональными антителами к РВ группы А и реакция латекс-агглютинации (РЛА). Данные лабораторные методы используются как для диагностики в стационаре, так и для эпидемиологического мониторинга. При помощи указанных методов далеко не всегда удается установить рота-вирусную природу заболеваний ввиду низкой чувствительности, которая при ИФА составляет 107-108 вирусных частиц/мл, а при РЛА - 109/мл. Специфичность данных тест-систем ограничена наиболее

распространенной группой А РВ, в то время как возможны случаи РВИ, вызванные РВ группы В и С. Известно, что инфицирующая доза возбудителя составляет менее чем 104 вирусных частиц/мл. Следовательно, остается актуальным вопрос разработки таких методов детекции, которые позволяли бы выявить РВ разной групповой принадлежности и в дозе ниже инфицирующей [1, 2, 5].

Наиболее перспективным подходом к прямому выявлению вирусов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который основан на амплификации нуклеиновых кислот ¡п у^го с помощью двух олигонуклеотидных затравок - праймеров, специфически распознающих нуклеотидные последовательности ДНК или РНК микроорганизмов. В настоящее время разработаны тест-системы для выявления РНК РВ методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» в реальном времени [5]. Методы 0/Р-генотипирования РВ с использованием ОТ-ПЦР стали применяться в качестве современного «инструмента» при изучении циркуляции возбудителя среди людей в разных регионах мира.

Одним из основных направлений эпидемиологического надзора за РВИ является изучение циркуляции доминирующих штаммов РВ. К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серо-типов и генотипов возбудителя, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируе-мых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов [7, 12]. Знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией РВ разных 0[Р] типов имеет значение для разработки универсальной и оценки эффективности уже разработанных вакцин. Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [7].

Целью настоящей работы явилось изучение генетического разнообразия РВ, циркулирующих в одесском регионе, и определение динамики

Таблица 1

Список пар праймеров, использованных для идентификации [Р]0-комбинаций генотипов изолятов ротавирусов группы А

Генотипы Последовательность праймера 5’ - 3’ Длина ампликона, п. н. Литературные источники

Серотипо-специфический генотипо-специфический

G1 tagctccttttaatgtatgg tcttgtcaaagcaaataatg 158 13

G2 gttagaaatgattctccact 244

G3 gtccagttgcagtgttagc 466

G4 gggtcgatggaaaattct 403

G9 tataaagtccattgcac 110

P[4] tggcttcgctcatttatadaca ctattgttagaggttagagtc 483 11, 13

P[6] tgttgattagttggattcaa 267

P[8] tctacttggataacgtgc 345

P[8] субтип 1 сса ttt att tga ate gtt a 410 4

P[8] субтип 2 cca ttt atc tga ate att t

P[9] tgagacatgcaattggac 471 11, 13

P[10] atcatagttagtagtcgg 583

частоты встречаемых генотипов на протяжении двухлетнего периода исследований.

Объект и методы исследования. Нами проанализированы результаты исследований, проведенных Одесской областной вирусологической лабораторией в 2009-2010 гг Для исследования использовались образцы фекалий детей, находившихся на стационарном лечении в городской клинической инфекционной больнице с диагнозом ОКИ. Обнаружение антигенов РВ проводилось методами: ИФА и ПЦР с использованием тест-систем производства «Вектор-Бест» г Новосибирск, «Ампли-Сенс» (Россия). Образцы, в которых содержался антиген РВ группы А, были отобраны методом случайной выборки. Исследования проводились методом мультиплексной ОТ-ПЦР с целью генетической идентификации выделенных РВ в Региональной ре-ференс-лаборатории Европейского регионального бюро ВОЗ (г Минск, Беларусь).

Экстракцию РНК из копрофильтратов выполняли при помощи перхлората натрия согласно методике [3]. Концентрацию РНК определяли на флуориметре

ТКО «Hoefer-100». Реакцию ОТ осуществляли с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase (“СибЭнзим”, РФ) в присутствии в качестве затравки случайных праймеров длиной в шесть нуклеотидов (random hexamer). Амплификацию кДНК, полученную в результате ОТ, проводили в реакционной смеси соответствующих праймеров. Сверху реакционного раствора наслаивали по 30 мкл минерального масла. Последовательности пар праймеров, использованных для идентификации комбинаций G и P генотипов изолятов РВ группы А, показаны в табл.1.

Воспроизводимость результатов амплификации подтверждалась в двух повторностях исследования. Продукты амплификации фракционировали электрофорезом в 2% агарозном геле в 1хТВЕ буфере. Электрофорез в агарозном геле проводили при постоянном напряжении 140 V на протяжении 1,5-2 часов в аппарате для горизонтального гель-электрофореза «Helicon» (РФ). Продукты амплификации в геле окрашивали бромистым этидием. Видеоизображения и размеры амплифицированных фрагментов получали при помощи видеосистемы «ImageMaster VDS» (“AmershamPharmaciaBiotech”, США) согласно инструкции. Калибровку молекулярной массы полученных ам-пликонов осуществляли с использованием стандарта pUC19 DNA/MspI (501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 110, 67, 34, 26).

Статистическую обработку полученных результатов выполняли согласно общепринятых методик [6].

Результаты исследований и их обсуждение. С целью генетической идентификации выделенные в образцах фекалий ротавирусы были

Таблица 2

[Р]0-комбинации генотипов изолятов ротавирусов группы А, выделенных от больных в Одесской области

в 2009 году

Генотипы G1 G2 G3 G9 н/т* Всего Частота генотипа,%

P[4] 30 30 20,00±4,90

P[8] 52 41 8 101 67,30±5,74

н/т* 19 19 12,70±4,07

Всего 52 30 41 8 19 150 100

Частота генотипа,% 34,70 ±5,83 20,00 ±4,90 27,30 ±5,46 5,30 ±2,75 12,70 ±4,07 100

Примечание: * - нетипируемые изоляты.

ЕПіДЕМЮЛО ГІ МІ

Рис. 1. ОТ-ПЦР типирование РВ группы А человека. (А) типированиейгенотипов: М — маркер молекулярной массьірІЮІ 9 ОМА//\ИзрІ;1—генотпп С9; 2,3—генотип 02; 4,5 — гено—ип й1;6,7 — генотип04;8—генотип03.

(П) типированиеРгенитс—оа:М- маркер молеі^иьрной і9і«і^сыриО19 ОНА/Мврі; 1,2 — генотип Р [4];3,4,6,

7 — генотип Р [8]; 5 — генотип Р [8].

исследованы методом мультиплексной ОТ-ПЦР В результате ПЦР гнсоиза с па|эамитрасе1еров,гпеци—>аеных длярс—енцои гено-типог й иП, выявлено пеьирасличныр [РсО-к—мбинац—и, виюча-ющих гнсььииьі 01-4, й9 и генотипы Р[4, 8] -трбл. Н; 3-. Средп циркулировавших в 2009 г на территории Одесской области рота-ас—ег—Еї г|эупьыо п°)торнадолооируоы реноо/срй1 130^^(1отп3%)

(табл . 2). Ге ноти пы й и Р, детектируемы е на территории Одесской области показаны на рис. 1.

Рис. 2. Распределение комбинаций [Р]й генотипов РВ группы А (в %), изолированных от заболевших на территории Одесской об ласти в 2009 году.

Р[8^3

Рис. 3. Распределение комбинаций [Р]й генотипов РВ группы А (в %), изолированных от заболевших на территории Одесской об ластив2010году.

Вторым по частоте обнаружения был генотип й3 (27,30±5,46%), далее следовали генотипы й2 (20,00±4,90%) и й9 (5,30±2,75%). Среди Р-генотипов доминировал Р[8] (67,30±5,74%). Генотип Р[4] был выявлен в 20,00±4,90% случаев. При проведении [Р]й - типи-рования РВ в 12,70±4,07% случаев нам не удалось установить [Р] и й генотипы изолята вируса с помощью набора праймеров. Спектр идентифицированных в 2009 году РВ был представлен четырьмя [Р]й-комбинациями (рис. 2). Преобладали генотипы Р[8]й1 (34,70±5,83%) и Р[8]й3 (27,30±5,46%). Далее следовали генотипы Р[4]й2 (20,00±4,90%) и Р[8]й9 (5,30±2,75%).

Среди циркулировавших в 2010 году на территории Одесской области РВ группы А (табл. 3) преобладали вирусы генотипа й3 (55,10±6,25%). Далее в порядке уменьшения частоты генотипа следовали й4 (22,10±5,22%), й2 (15,80±4,60%), й9 (3,20±2,20%) и й1 (1,90±1,72%). Среди Р генотипов детектировали только Р[4] и Р[8]. Доминировал генотип Р[8] (82,30±4,80%). Генотип Р[4] был выявлен в 15,80±4,60% случаев.

Спектр идентифицированных в 2010 году РВ был представлен пятью [Р]й-комбинациями (рис. 3). Преобладал генотип Р[8] й3 (55,10±6,25%). Далее следовали генотипы Р[8] й4 (22,10±5,22%), Р[4] й2 (15,80±4,60%), Р[8] й9 (3,20±2,20%) и Р[8] й1 (1,90±1,72%). Не были идентифицированы по [Р]й типам 1,90±1,72% изолятов, что позволило отнести их к редко встречающимся штаммам возбудителя.

В динамике доля генотипа Р[8] й1 уменьшилась с 34,70±5,83% в эпидемический сезон 2009 г. до

Таблица 3

[Р]0-комбинации генотипов изолятов РВ группы А, выделенных от больных в Одесской

области в 2010 году

Генотипы G1 G2 G3 G4 G9 н/т* Всего Частота генотипа

P[4] 25 25 15,8±4,60

P[8] 3 87 35 5 130 82,3±4,80

н/т* 3 3 1,9±1,72

Всего 3 25 87 35 5 3 158 100

Частота генотипа,% 1,90±1,72 15,80±4,60 55,10±6,25 22,10±5,22 3,20±2,20 1,90±1,72 100

Примечание: * - нетипируемые изоляты.

1,90±1,72% в эпидемический сезон 2010 г (р<0,05) и, напротив, возросла значимость генотипа P[8]

G3 с 27,30±5,46% до 55,10±6,25% (р<0,05). Также отмечено появление нового генотипа P[8] G4 22,10±5,22% в 2010 году, тогда как в 2009 году данная комбинация генотипа не детектировалась.

Выводы

1. На территории Одесской области в эпидемический сезон 2009 г. циркулировали ротавирусы группы А четырех [Р] G типов с преобладанием генотипа P[8] G1 (34,70% изолятов).

2. В эпидемический сезон 2010 г. на территории Одесской области циркулировали ротавирусы группы А пяти [Р] G типов с преобладанием генотипа P[8] G3 (55,10% изолятов).

Литература

1. Диагностика ротавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции / А. А. Мухина, Г. А. Шипулин, А. Г. Боковой [и др.] // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2002. - № 2. - С. 43-47.

2. Молекулярные методы диагностики в изучении циркуляции различных генотипов ротавирусов среди детей в Украине /И. В. Дзюблик, О. В. Обертинская, С. А. Соловьев [и др.] / «Молекулярная диагностика - 2010»: Материалы VII Всероссийской науч. -практ. конф. с междунар. участием. - Москва, 2010. - С. 42-44.

3. Патент № 2313792. Российская Федерация. Способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции. / Н. А. Новикова, Л. Н. Голицина, Н. В. Епифанова [и др.].

4. Патент № 2264469. Российская Федерация. Способ идентификации субтипов ротавируса P[8] генотипа / О. Ф. Федорова, Н. А. Новикова, Н. В. Епифанова.

5. Разработка методик детекции возбудителей острых кишечных инфекций на основе мультиплексной ПЦР с ги-бридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации «по конечной точке»/ А. Т. Подколзин, Н. Ю. Абрамычева, Е. Б. Фенске [и др.] // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч. -практ. Конференции, (Новосибирск, 2005 г.) Новосибирск. - 2005. - С. 216-221.

6. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика / П. Ф. Рокицкий. - М. : Колос, 1973. - 327 с.

7. Фёдорова О. Ф. Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов автореф. дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук. / О. Ф. Федорова. - Н. -Новгород. -2006. - 25 с.

8. Burden of rotavirus desease in European union countries /M. Soriano-Gabarro, J. Mrucowicz, T. Vesicari [et al.] // Pediatric Ivfect. Dis. -2006. -Vol. 25. -P 7-11.

9. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India / В. K. Das, J. R. Gentsch, H. G. Cicirello ^t al.] // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32, № 7. - P. 1820-1822.

10. Detection and serotyping of rotaviruses in stool specimens by using reverse transcription and polymerase chain reaction amplification /H. Ushijima, H. Koike, A. Mukoyama [et al.] // J. Med. Virol. 1992. - Vol. 38, N 4. - P. 292-297.

11. Genotype Profiles of Rotavirus Strains from Children in a Suburban Community in Guinea-Bissau, Western Africa / T. K. Fischer, H. Steinsland, K. Molbak fet al.]//J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38, № 1. - Р. 264-267.

12. Golantsova N. E. Discrete domains the rotavirus VP5 direct peripheral membrane association and permeability / N. E. Go-lantsova, E. E. Gorbunova, E. R. Mackow // J. Virol. -2004. Vol. 78. - P 2037-44.

13. Identification of group A rotavirus gene 4 type by polymerase chain reaction / J. R. Gentsch, R. I. Glass, P. A. Woods ^t al.] // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P 1365-1373.

3. За период наблюдения произошла смена доминирующих геновариантов: снизилась доля Р[8] й1 с 34,70% в эпидемический сезон 2009 г до 1,90% в эпидемический сезон 2010 г (р<0,05) и, напротив, увеличилась доля Р[8] й3 с 27,30% до 55,10% (р<0,05). В 2010 году отмечено появление генотипа Р[8] й4 22,10%, который не выявлялся в 2009 г Перспективы дальнейших исследований. Планируется продолжение исследований по изучению генетического разнообразия циркулирующих в южных регионах ротавирусов с целью разработки профилактических противоэпидемических мероприятий в отношении ротавирусной инфекции (вакцинопрофилактика).

удк 613. 32:616. 36 - 002. 1 - 036. 22 (477. 74)

ВИВЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНОГО РОЗМАЇТТЯ РОТАВІРУСІВ ГРУПИ А, ЩО ЦИРКУЛЮЮТЬ НА ТЕРИТОРІЇ ОДЕСЬКОЇ ОБЛАСТІ

Малахов П. С.

Резюме. Вивчено генетичне розмаїття ротавірусів групи А, що циркулювали на території одеського регіону в сезони епідемічного підйому захворюваності на ротавірусну інфекцію в 2009-2010 рр. В 2009 р. циркулювали ротавіруси групи А чотирьох [Р] G типів з переважанням генотипу P[8] G1 (34,70% ізолятів). В епідемічний сезон 2010 р. - циркулювали ротавіруси групи А п’яти [Р] G типів з переважанням генотипу P[8] G3 (55,10% ізолятів). За період спостереження відбулась зміна домінуючих геноваріантів: знизилась доля P[8] G1 з 34,70% в епідемічний сезон 2009 р. до 1,90% в 2010 р. (р<0,05) та, навпаки, збільшилась доля P[8] G3 з 27,30% до 55,10% (р<0,05). В 2010 році відмічено появу нового генотипу P[8] G4 22,10%, який раніше не виявлявся.

Ключові слова: ротавіруси, генотипування, домінуючі генетичні варіанти.

УДК 613. 32:616. 36 - 002. 1 - 036. 22 (477. 74)

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ОДЕССКОЙ ОБЛАСТИ

Малахов П. С.

Резюме. Изучено генетическое разнообразие ротавирусов группы А, циркулировавших на территории одесского региона в сезоны эпидемического подъема заболеваемости ротавирусной инфекцией в 20092010 гг В 2009 г циркулировали ротавирусы группы А четырех [Р] G типов с преобладанием генотипа P[8] G1 (34,70% изолятов). В эпидемический сезон 2010 г - циркулировали ротавирусы группы А пяти [Р] G типов с преобладанием генотипа P[8] G3 (55,10% изолятов). За период наблюдения произошла смена доминирующих геновариантов: снизилась доля P[8] G1 с 34,70% в 2009 г до 1,90% в 2010 г (р<0,05) и, напротив, увеличилась доля P[8] G3 с 27,30% до 55,10% (р<0,05). В 2010 году отмечено появление нового генотипа P[8] G4 22,10%, который ранее не выявлялся.

Ключевые слова: ротавирусы, генотипирование, доминирующие генетические варианты.

UDC 613. 32:616. 36 - 002. 1 - 036. 22 (477. 74)

Studying Genetic Diversity Rva A, Circulating in the Odessa Area

Malakhov P. S.

Summary. Studied the genetic diversity of group A rotaviruses that have circulated in the Odessa region in seasons epidemic rise of incidence of rotavirus infection in 2009-2010. In 2009, the group A rotaviruses circulating four [P] G types, with a predominance of genotype P [8] G1 (34,70% of isolates). In the epidemic season 2010 -Group A rotaviruses circulating five [P] G type with a predominance of genotype P [8] G3 (55,10% of isolates). During follow-up there was a change of the dominant genovariants: the share of P [8] G1 with 34,70% in 2009 to 1,90% in 2010 (p <0,05) and, on the contrary, the share of P [8] G3 from 27,30% to 55,10% (p <0,05). In 2010 marked the emergence of a new genotype P [8] G4 22,10%, which has not previously been detected.

Key words: rotaviruses, genotyping, dominant genetic variants.

Стаття надійшла 24. 01. 2013 р.

Рецензент - проф. Дубинська Г. М.