CC BY
5
Литература
1. Захарченко М. П., Хавинсон В. X., Нагибович О. А. и др. // Гиг. и сан. - 2001. - № 6. - С. 27-31.
2. Методы оценки неспецифической резистентности человека по иммунологическим показателям при массовых гигиенических исследованиях населения: Метод, указания. — М., 1988.
3. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. // Иммунология. — 1994. — № 6. — С. 6—9.
4. Петрова И. В., Шинкаренко Н. И., Лещенко Г. М. и др. // Гиг. и сан. - 1993. - № 10. - С. 59-61.
5. Петрова И. В., Мольков Ю. Н., Лещенко Г. М. и др. // Материалы 9-го Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей, — М., 2001. — Т. 2. — С. 433-436.
Поступила 26.03.04
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2004 УДК 615.9:575:576.3].07
И. Е. Сидорова, Ю. А. Ревазова, В. В. Сафронов
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У ЛИЦ, ИМЕВШИХ КОНТАКТ С ТОКСИЧНЫМИ ХИМИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Центр медико-биологических и экологических проблем РАЕН, Москва
Изучение роли индивидуальной чувствительности человека к действию неблагоприятных факторов окружающей среды в донозологической диагностике представляется весьма актуальным [19, 22]. Полиморфизм ферментов, ответственных за метаболизм мутагенов и канцерогенов, определяет способность организма активировать или детоксицировать генотоксические агенты, влияет на внутреннюю (поглощенную) и биологически эффективную дозы агентов [8, 21].
Среди ферментов I фазы метаболизма (трансформация неактивных мутагенов/канцерогенов в их генетически активные формы) особое внимание исследователей привлекает семейство цитохромов Р-450 (изоформы СУР1А1, СУР1А2, СУР2А6, СУР2Е1, СУР206 и СУРЗА4). Они принимают участие в метаболизме многих мутагенов и канцерогенов, в частности полициклических ароматических углеводородов, гетероциклических аминов, афлатоксинов, нитрозоаминов и др. [1-4, 6, 9, 12— 17, 21, 23].
Среди ферментов II фазы (конъюгации) необходимо упомянуть глютатион-Б-трансферазы (СБТ), катализирующие реакцию глютамата с различными алифатическими, ароматическими и гетероциклическими радикалами различных веществ, загрязняющие атмосферу в городах и играющие роль в резистентности клеток к пере-кисному окислению жиров, алкилированию белков и повреждениям ДНК [18, 22].
Было предпринято исследование уровня цитогенети-ческих нарушений (хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах периферической крови и микроядер (МЯ) в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости) и генетического полиморфизма (ГП) ферментов, участвующих в I и II фазах детоксикации, у лиц, имевших контакт с высокотоксичными химическими соединениями, и в группе сравнения.
В обследовании участвовали 77 мужчин в возрасте от 30 до 50 лет, из них 39 в анамнезе имели контакт с высокотоксичными химическими веществами; 38 человек составили группу сравнения. У всех обследованных определяли ГП по системам СУР1А1, СУР2Е1, Р(Ж54, ОБТМ1, ОБТИ и проводили цитогенетиче-ский анализ уровня в лимфоцитах периферической крови [3] и частоты МЯ в эпителиоцитах слизистой оболочки рта [10, 11].
В качестве материала для генотипирования использовали ДНК, извлеченную из лимфоцитов. С этой целью 5 мл венозной крови отбирали в шприц-контейнер, который помещали в сумку-холодильник и доставляли в лабораторию в течение 24 ч.
Оценка аллельных вариантов ферментов детоксикации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) включала определение уровня ферментов I фазы детоксикации — цитохрома, параоксаназы (СУР1А1,
CYP2E1, PON54) и ферментов II фазы детоксикации — глутатион-Б-трансферазы Ml и TI (GSTM1 и GSTT1).
Для идентификации аллелей генов CYP1A1, CYP2E1, PON54 проводили рестрикцию продуктов амплификации с помощью эндонуклеаз HincII, Taq I, Ncol соответственно (фирма "Fermentas"). Для этого 10 мкл амплификата смешивали с 5 мкл трехкратного буфера для рестриктазы, рекомендуемого производителем и содержащего 5 ЕД фермента. Рестрицировали образец при оптимальной для каждого фермента температуре в течение 8 ч.
Разделение продуктов ПЦР и продуктов рестрикции проводили в вертикальном 7% полиакриламидном геле, приготовленном на однократном трис-боратном буфере (lxTBE).
При анализе генов GSTM1 и GSTT1 на наличие делений использовали мультиплексную ПЦР. В ампли-фикационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Такой подход, во-первых, вдвое сокращал время генотипирования. Во-вторых,отсутствие в конкретной пробе только одного из фрагментов позволяло утверждать, что это является результатом истинной делеции в данном гене, а не следствием некорректно проведенной амплификации.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерной программы "Statistica 5". Разницу в структуре данных определяли по критерию х2-
Для генов GSTT1 и GSTM1 генотип 0/0 означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента размером 215 и 315 пар оснований соответственно и то, что данный индивидуум гомозиготен по делеции. Присутствие фрагмента свидетельствует о том, что данный пациент либо гетерозиготен, либо гомозиготен по отсутствию делеции в указанных генах.
Для гена CYPIAI генотип ILE/ILE проявляется в наличии двух фрагментов размером 144 и 48 пар оснований и указывает на гомозиготность по нормальному аллелю. Генотип I LE/VAL проявляется в присутствии 3 фрагментов размером 144, 125 и 48 пар оснований и означает ге-терозиготность по мутантному аллелю.
Для гена PON54 генотип L/L означает гомозиготу по нормальному аллелю и проявляется в наличии одной полосы размером 135 пар оснований. Присутствие полос 135, 110 и 25 соответствует гетерозиготе по мутации.
Результаты цитогенетических исследований и определенные ГП по системам детоксикации приведены в табл. 1.
Результаты генотипирования по полиморфным локусам генов GSTM1, GSTT1, CYP1A1, PON54, CYP2E1
Таблица 1
№ п/п CYP1A1 CYP2E1 PON54 GSTM1 GSTT1 МЯ, % XA, %
1 ILE/ILE N/N L/M + + 1,5 н/д*
2 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 0,5 н/д*
3 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 2,5 3
4 ILE/ILE N/N L/L 0/0 0/0 5 н/д*
5 ILE/ILE N/M L/M + + 1,5 н/д*
6 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 2,5 4
7 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 2
8 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 1 6,5
9 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 0,5 4
10 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 2 6
11 ILE/ILE N/N L/M + + 0 н/д*
12 ILE/ILE N/N M/M 0/0 + н/д н/д*
13 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 1
14 ILE/ILE N/N L/M + + 1,5 4
15 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 3 2
16 ILE/ILE N/N L/L + + 0,5 0
17 ILE/ILE N/N L/L + + 3,5 4
18 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 1,5 3
19 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 0,5 3
20 ILE/ILE N/N L/L 0/0 0/0 1 1
21 ILE/ILE N/N L/M + 0/0 0,5 1
22 ILE/ILE N/N L/L + + 0,5 1
23 ILE/ILE N/N L/M + + 1 0
24 ILE/VAL N/N L/M 0/0 + 1,5 1
25 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 1
26 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 2 4
27 ILE/ILE N/N L/M + + 2,5 0
28 ILE/ILE N/N L/L + + 0 4,6
29 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 0 2
30 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 2 3
31 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 2 1,09
32 ILE/ILE N/N L/L + + 1,5 5
33 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 0,5 2
"34 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 0 2
35 ILE/ILE N/N L/L + + 1,5 6
36 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 2
37 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 0 5
38 ILE/ILE N/N M/M 0/0 + 1 4
39 ILE/ILE N/N M/M + + 2,5 3
40 ILE/VAL N/N L/L 0/0 + 1,5 8
41 ILE/VAL N/N M/M 0/0 + 0,5 2
42 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 0,5 7
43 ILE/ILE N/N M/M 0/0 + 0,5 3,5
44 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 7,7 1
45 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 2 5
46 ILE/ILE M/M L/M 0/0 0/0 1 3
47 ILE/ILE N/N M/M ' 0/0 + 1,5 2
48 ILE/ILE N/N L/L + + 1 1
49 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 4,5 5
50 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 1 2
51 ILE/ILE N/N L/L + + 2 2
52 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 1 8
53 ILE/ILE N/N L/M + + 1,5 1
54 ILE/ILE N/N L/L + + 2 1
55 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 0,5 3
56 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 2 3
57 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 2
58 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 1,5 5
59 ILE/ILE N/N L/M + 0/0 1,5 3
60 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 1,5 3
61 ILE/ILE N/N L/L + + 0 4
62 ILE/ILE N/N L/L + + н/д 1
63 ILE/ILE N/N L/L 0/0 0/0 н/д н/д
64 ILE/ILE N/N L/M 0/0 0/0 0,5 1
65 ILE/ILE N/N L/L + + 1 1
66 ILE/ILE N/N L/L 0/0 0/0 0 2
67 ILE/ILE N/N L/M + + 2,5 7
№ п/п CYP1A1 CYP2E1 PON54 GSTM1 GSTT1 МЯ, % XA, %
68 ILE/VAL N/N L/L + + 0^5 3
69 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 1,5 5
70 ILE/ILE N/N L/M + + 0,5 2
71 ILE/ILE N/N M/M 0/0 + 0,5 0
72 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 2,5 2
73 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 0 1
74 ILE/ILE N/N L/M 0/0 + 0,5 5
75 ILE/ILE N/N L/L + + 1 5
76 ILE/ILE N/N L/L 0/0 + 1,5 4
77 ILE/ILE N/N L/L + 0/0 0,5 1,5
Примечание, н/д — нет данных. Для CYPIA1: генный полиморфизм CYP1A1 обусловлен точковой мутацией изолейцина (ILE — норма) в валин (VAL — быстрая форма), ILE/VAL — гетерозиготы. Для CYP2E1: N — быстрая форма (норма), M — медленная форма, N/M — гетерозиготы. Для PON 54: аллель L — быстрая форма (норма), M — медленная форма, L/M — гетерозизоты. Для GSTM1 и GSTT1: + нормальная активность фермента, 0/0 — дефект фермента.
Таблица 2
Сводные данные сочетания генетических полиморфизмов и цитогенетических нарушений
Группа Всего обсле- С ГП Без ГП ХА> 3 МЯ > 1 ГП + МЯ > 1 ГП без МЯ > 1 и/или ХА > 3 Нет данных
дованных и/или ХА > 3 ХА МЯ
Экспонированных Сравнения 39 38 23 1 27 16 11 17 19 22 21 16 20 5 5 6 1 1 2
Итог о... 77 50 27 36 43 36 10 7 3
Анализируя частоту ХА, мы обнаружили, что показатель "доля аберрантных клеток" колебался в обеих выборках от 0 до 8%, средние значения составили 2,76 и 3,11% в группе экспонированных и в группе сравнения соответственно. Статистически значимо эти группы не различались. Мы разделили все данные анализа по формальным причинам на 2 группы — меньше 3% и больше или равно 3 %. В табл. 1 значения 3% и больше 3% выделены жирным шрифтом. Доля клеток с МЯ в анализируемых выборках колебалась от 0 до 7,7 промилле. Средние частоты составили 1,29 и 1,34 промилле в группе экспонированных лиц и в группе сравнения соответственно. Статистически значимых различий по этим показателям между группами лиц, имевших контакт с токсическими соединениями и не имевших его в анамнезе, не обнаружено. Все данные по МЯ мы подвергли той же процедуре, разделив весь массив данных на 2 части — меньше 1 промилле и больше или равно 1 промилле, последние в табл. 1 выделены жирным шрифтом.
Сводные данные в обследованных группах о наличии ГП и цитогенетических нарушений приведены в табл. 2.
При рассмотрении всех обследуемых лиц без разделения их на группы получается, что среди 77 человек у 50 выявлены ГП. Среди этих людей у 37 индивидов аномальные ГП сочетаются с высокими уровнями ХА и/или МЯ, у 10 нет.
Сопряженность ХА и ГП для всех обследуемых выглядела следующим образом. Благоприятное сочетание генотипа было у 24 человек, из них ХА < 3 у 16 (66,67%), ХА > 3 у 8 (33,33%), неблагоприятное сочетание генотипа - у 46, из них ХА < 3 у 18 (39,13%), ХА > 3 у 28 (60,87%). Вероятность ошибочного заключения составила р - 0,043.
Нет данных по МЯ у 3 человек (№ 12, 62, 63), по ХА у 7 человек (№ 1, 2, 4, 5, 11, 12, 63).
Определенные частоты ГП среди всех обследованных лиц укладываются в представления зарубежных и отечественных коллег [2, 20, 24]:
СУР1А1—5,19%, СУР2Е 1—1,30%, РСЖ54-9,09%, С8ТМ1—50,65%, С8ТТ1—25,97%.
В последние годы появились публикации по выявлению связи между наличием ГП и мультифакториальны-ми болезнями [5], а также с различными цитогенетиче-скими нарушениями у лиц, контактирующих с потенциальными мутагенами и канцерогенами окружающей сре-
ды. Так, сравнительно недавно была установлена корреляция между частотой ХА и наличием GSTM1 0/0 генотипа [25]. Причем у таких индивидуумов, если они курят, мутагенный и канцерогенный риски выражены особенно сильно.
Известно, что частота встречаемости ГП в популяции не зависит от наличия контактов с токсикантами и гено-токсикантами среды, они характеризуют генотип самого человека, его паспортно-генетические показатели. Хотя возможность индукции ГП возможна при действии мутагенов на зародышевые клетки человека.
Выводы. 1. В ходе исследования не было обнаружено различий в уровнях цитогенетических нарушений у лиц, имевших в анамнезе контакт с высокотоксичными химическими веществами и в группе сравнения.
2. Частота ГП также не различалась в двух исследованных выборках.
3. Для индивидов с наличием ГП по системам деток-сикации ксенобиотиков в обеих группах частота услов-но-высоких уровней цитогенетических нарушений вдвое выше, чем среди лиц с "благополучным" генотипом.
Литература
1. Баранов В. С. // Исследования по генетике. — СПб, 1999. - Вып. 12. - С. 117-123.
2. Баранов В. С., Баранова Е. В., Иващенко Т. Э., Асеев М. В. // Геном человека и гены "предрасположенности" (введение в предиктивную медицину).— СПб, 2000.
3. Бочков Н. П., Катосова Л. Д. // Вестн. РАМН. — 1992. - № 4. - С. 10-14.
4. Горбунова В. Н. Молекулярные основы медицинской генетики. — СПб, 1999.
5. Иващенко Т. Э., Сиделева О. Г., Петрова М. А. и др. / Генетика. - 2000. - Т. 36, № 9. - С. 1-5.
6. Кузьмина Л. П., Тарасова Л. А. // Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века. Материалы Международного симпозиума. — СПб, 2000. — С. 44-46.
7. Ревазова Ю. А., Журков В. С. // Вестн. РАМН. — 2001. - № 10. - С. 77-80.
8. Ревич Б. А. Загрязнение окружающей среды и здоровье населения. Введение в экологическую эпидемиологию. — М. 2001.
9. Фогель Ф., Мотульский А. Генетика человека. Проблемы и подходы. — М., 1990. — Т. 2.
10. Юрченко В. В., Сычева Л. П., Ревазова Ю. А. и др. // Токсикол. вестн. — 2000. — № 3. — С. 2—6.
11. Baranov V. S. // Genetic approaches to Noncommuni-cable Diseases / eds K. Berg et al. — Berlin et al., 1996. P. 105-112.
12. Baranova H., Perriot J., Albuisson E. et al. // / Hum. Genet. - 1997. - P. 822-826.
13. Bolt H. M. // Med. d. Lavoro. - 1994. - Vol. 85, N 1. - P. 37-48.
14. Bonassi S., Hagmar L., Stromberg U. et al. // Cancer Res. 2000. - P. 1619-1625.
15. Brewer J. C. Am. J. Hum. Genet. - 1971. - Vol. 23. — P. 92-94.
16. Caldwell J. Enzymatic basis of Detoxication (Ed. W. B. Jacoby. - New York, 1980. - Vol. 1. P. 85-114.
17. Daly А. К. U J. Med. Genet. - 1995. -Vol. 73. -P. 539-553.
18. Habig W. H. Jakoby W. B. // Meth. Enzymol. - 1981.
- Vol. 77. - P. 218-231.
19. Kalow W. Pharmacogenetics: Heredity and Response to Drugs. Philadelphia, 1962.
20. Nebert D. W. Carvan M. J. I I Toxicol. Indust. Hlth. — 1997. - Vol. 13. - P. 163-192.
21. Nebert D. W. // Am. J. Hum. Genet. - 1997. Vol. 60. P. 265-271.
22. Nicolaides N. C., Holroyd K. L., Ewart S. L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997 - Vol. 94. N 24.
- P. 13175-13180.
23. Norppa H. U Environ. Hlth Perspect. - 1997. -Vol. 105. - Suppl. 4. - P. 829-835.
24. Seidegard J., Vorachek W. R., Pero R. W. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol. 85, N 19. -P. 7293-7297.
25. Sram R. J.// Environ. Hlth Perspect. - 1998. -Vol. 106. - suppl. 1. - P. 231-239.
Поступила 26.03.04
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 204 УДК 613.5:616-056.43-053.2
В. Д. Иванов, А. К. Маковецкая, Л. В. Радыгина, О. В. Высоцкая, Т. Г. Федоскова, И. А. Орлова
ОЦЕНКА СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ ЖИЛОЙ СРЕДЫ В СИСТЕМЕ СОЦИАЛЬНО-ГИГИЕНИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН; ГНЦ-НИИ иммунологии МЗ и СР РФ, Москва
Аллергические заболевания (бронхиальная астма, атопический дерматит, риноконъюнктивит и др.) относятся к категории болезней, распространенность которых среди населения неуклонно возрастает, особенно в экологически неблагоприятных регионах. В последние годы отмечается тяжелое проявление аллергопатологий, быстрое развитие осложнений, приводящих больных к инвалидности, а также увеличение показателей смертности в результате возникновения острых аллергических реакций на медикаменты, химические реагенты и другие факторы окружающей среды [7].
По данным эпидемиологических исследований, проведенных в 90-е годы (Р. М. Хаитов, В. Н. Федосеева, Н. И. Ильина и др.), аллергические заболевания в различных экологически неблагоприятных регионах Российской Федерации выявляются среди 15—35% взрослого и 15—20% детского населения.
Наличие указанной эпидемиологической ситуации требует от гигиенической науки проведения исследований, направленных на изучение и выявление причин аллергических заболеваний в условиях многофакторного воздействия на население окружающей среды.
Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных аллергологов доказано, что домашняя пыль (ДП) является одним из наиболее активных ингаляционных и контактных аллергенов. ДП в жилых помещениях представляет собой фактор окружающей среды [1], способный вызывать у человека появление клинических проявлений IgE-опосредованных заболеваний [4, 6, 7].
Известно, что ДП является по своему составу много-компонентой системой. Клещевые, пыльцевые, эпидер-мальные, бактериальные, инсектные, химические и другие компоненты могут определять аллергенный профиль ДП [2, 4, 6]. Мицелий и споры некоторых условно-патогенных грибов (род Altemaria, Pénicillium) могут загрязнять воздух жилых и общественных помещений, являться одним из компонентов ДП и играть роль этиологического фактора при бронхиальной астме и других аллергических заболеваниях [7]. Состояние гиперчувствительности у пациентов может выявляться как к комплексному аллергену ДП, так и к отдельным ее компонентам.
Цель работы — изучение гиперчувствительности к внутрижилищным (бытовым, грибковым, эпидермаль-ным) аллергенам среди детей, постоянно проживающих
в Юго-Западном административном округе (ЮЗАО) Москвы, страдающих аллергическими заболеваниями более 1 года.
Общепринятыми в клинической аллергологии (сбор анамнеза, постановка кожных тестов) методами, окружным врачом-аллергологом были обследованы 165 детей в возрасте от 3 до 16 лет, постоянно проживающих в ЮЗАО Москвы. Все они обратились к специалисту с жалобами на клинические проявления аллергических заболеваний (дерматит, ринит, конъюнктивит, приступы удушья и др.) в период с января по июль 2003 г. В результате сбора анамнеза, осмотра специалистом, а также с помощью общепринятых в аллергологии клинических методов обследования (в частности, постановки кожных проб) было показано, что 142 человека действительно страдали аллергическими заболеваниями, у 23 человек не было выявлено аллергии, однако наблюдалась сходная симптоматика: проявления нейродермита, пищевая псевдоаллергия, психосоматические расстройства и др. Большинство обследованных (112) ранее уже обращались к аллергологу с жалобами на клинические проявления аллергических заболеваний, 30 пациентам диагноз был поставлен впервые. Эти 30 пациентов (или их родители) были опрошены с помощью "Анкеты комплексного обследования ребенка". Анкета включала 25 позиций, затрагивающих медико-биологические, социальные аспекты, данные по объекту проживания ребенка.
Сыворотки крови 142 обследованных детей, имеющих выраженные симптомы аллергических заболеваний, были исследованы с помощью высокочувствительного метода — иммуноферментного анализа [3]. Изучались уровни общего IgE в сыворотке крови, уровни иммуноглобулинов классов А и М, а также уровни специфических IgE-антител к следующим видам бытовых, эпидер-мальных и грибковых аллергенов, обозначенных нами как комплекс внутрижилищных аллергенов: аллерген домашней пыли, перо подушки, бумажная (библиотечная) пыль, клещи домашней пыли (Dermatophagoides pteron-yssinus, Dermatophagoides farinae), грибковые аллергены (роды Candida, Aspergillus, Altemaria, Cladosporium), смеси шерсти (перхоти и микрочастиц слюны) домашних животных (собака, кошка, овца).
Было показано, что ведущими нозологическими формами среди изученных случаев были атопический дерма-
