CC BY
99
Изучение фармакодинамики наноразмерной
формы феназепама на основе поли (бутил) цианоакрилатных наночастиц
Балабаньян В. Ю.1, Разживина В. А.1, Максименко О. О.2, Кондрахин Е. А.3,
Ковалев Г. И.3, Воронина Т. А.3
1 — ООО «Технология лекарств», Химки, Московская область
2 — ООО «НПК «Наносистема», Москва
3 — ФГБУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» РАМН, Москва
Резюме
Поли (бутил) цианоакрилатные наночастицы с феназепамом получали методом полимеризации 2-п-бутилцианоакрилата в кислой среде в присутствии стабилизаторов. Размеры наночастиц составили 230-250 нм, степень включения феназепама — 65%. В опытах на экспериментальных животных (крысы, мыши) установлено, что феназепам, включённый в наночастицы, покрытые полисорбатом 80, оказывает выраженное анксиолитическое, антиагрессивное и противосудорожное действие, аналогичное действию феназепаму в субстанции, однако, в отличие от феназепама в субстанции, в терапевтических дозах (0,1-2,0 мг/кг, внб) не обладает седативным и миорелаксантным действием. Анксиолитическое действие наноразмерной формы феназепама ослабляется флумазенилом и бикукул-лином. Изучена возможность прямого влияния наноформы феназепама на связывание [Ы-метил-3Н] -флунитразепа-ма мембранами гиппокампа крыс. Установлены количественные параметры рецепторного связывания феназепама, включённого в поли (бутил) цианоакрилатные наночастицы.
Ключевые слова: феназепам, поли (бутил) цианоакрилатные наночастицы, рецепторное связывание, аполипо-протеины плазмы крови, нанофармакология, наноформа, фармакодинамика, анксиолитик
Введение
Феназепам — отечественный анксиолитик из группы производных бензодиазепина, широко применяющийся в лечебной практике как анксиолитическое, седативное, снотворное и противосудорожное средство уже более 25 лет. Вместе с тем наличие побочных эффектов, выражающихся в ухудшении моторных и мнестических функций, риске возникновения лекарственной зависимости и синдрома отмены, существенно лимитирует применение феназепама в клинической и, особенно, амбулаторной практике. Уменьшить или устранить побочные эффекты феназепама представляется возможным при создании его наноразмерной формы на основе полимерных наночастиц из поли (бутил) цианоакрилата. К настоящему времени можно считать доказанным, что при включении лекарственных веществ (ЛВ) в наночастицы существенно меняется профиль распределения ЛВ, повышается эффективность и продолжительность действия, а также снижаются побочные эффекты и токсичность [1—8].
Экспериментальная часть
Получение поли (бутил) цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА НЧ) с феназепамом и определение их физико-химических характеристик
В исследовании использовали мономер бу-тилцианоакрилата (Sicomet 6000, Sichel-Werke, Hannover, Germany). Наночастицы получали методом кислотной полимеризации в среде, содержащей в качестве стабилизатора декстран (мм 70 кДа) в 0,1М растворе соляной кислоты. К раствору феназепама (76,7 мг) в хлористом метилене (2,27 г) добавили 180 мкл бутилцианоакрилата. Для достижения полного растворения бутилцианоакри-лата использовали перемешиватель Vortex (VWR International, Германия) и ультразвуковую баню. Полученный раствор количественно переносили в водную фазу (36,8 мг безводной лимонной кислоты; 2,35 г полоксамера 188; 20,65 мл воды) и подвергали ультразвуковой гомогенизации на гомогенизаторе (Ultra-Turrax T18 basic, Германия) в течение 1 минуты. Суспензию перемешивали на магнитной
мешалке (Labtex Daihan, Корея) в течение 3 часов для удаления органического растворителя и полимеризации мономера, после чего фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» и лиофилизи-ровали (лиофильная сушка Alpha 2—4 LSC Christ, Германия). В качестве криопротектора использовали маннит. Размер частиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (на-носайзер Nanosizer NanoZS, Malvern Instruments, Великобритания). Содержание феназепама в на-ночастицах определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Helios Zeta UV—VIS, Therma Scientific, США). Перед введением животным ли-офильно высушенные наночастицы ресуспенди-ровали в 0,9% растворе натрия хлорида, а затем инкубировали в течение часа с 1% раствором по-лисорбата 80 (ПС 80).
Изучение фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА НЧ
Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 250—280 г и самцах белых беспородных мышей массой 23—28 г. (питомник «Столбовая» РАМН). Животных содержали в виварии в стандартных клетках при температуре 18—20 °C при свободном доступе к пище и воде.
Анксиолитическое действие веществ изучали в тесте приподнятого крестообразного лабиринта [9]. Методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) основана на естественной боязни открытого пространства, новизне обстановки и страха падения с высоты [10]. Мышь помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 3-х мин регистрировали: число выходов и длительность пребывания в открытых рукавах, число све-шиваний с открытых рукавов и выходов в закрытые рукава.
Антиагрессивное действие феназепама исследовали в тесте «драки» животных [9]. Мышей парами высаживали на электродный пол и раздражали постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком до возникновения драки. Регистрировали напряжение тока, при котором у животных возникала драка.
Седативное действие оценивали с помощью метода «открытого поля» в опытах на крысах и мышах. Регистрировали в течение 3-х мин число пересечённых квадратов, вертикальных стоек и обследованных отверстий.
Миорелаксантное действие веществ изучали с помощью метода вращающегося стержня (rota rod) со скоростью вращения 3 об/мин в эксперименте на крысах и мышах.
Противосудорожное действие оценивали в двух тестах. В тесте антагонизма с коразолом изучали способность феназепама предупреждать тонико-
клонический компонент судорожного припадка у крыс, вызванного коразолом (70 мг/кг, п/к). Влияние веществ на первично-генерализованную эпилептиформную активность по показателям ЭЭГ оценивали в течение 30-ти минут после введения бемегрида (10 мг/кг внб). Регистрировали длительность судорожных разрядов и число разрядов за минуту [9].
Изучение влияния флумазенила и бикукуллина на анксиолитический эффект феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы
Исследования проводили в опытах на крысах в тесте конфликтной ситуации. Феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, вводили группе животных внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг. Затем, с 15-минутым интервалом этим же крысам вводили флумазенил (внутрибрюшинно в дозе 10 мг/ кг) и через 15 минут оценивали анксиолитическое действие, регистрируя количество наказуемых взятий воды. Феназепам, включённый в матрикс ПБЦА наночастиц, вводили группе животных (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг), затем сразу же вводили бикукуллин (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг). Через 30 минут оценивали различие анк-сиолитического действия между этой группой животных и контрольными группами.
Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с помощью компьютерной программы BioStat for Windows. Достоверность различий оценивали с помощью вышеуказанной программы с использованием критериев Стьюден-та и Фишера (при p<0,05).
Изучение рецепторного связывания феназепама,
включённого в ПБЦА НЧ с бензодиазепиновыми рецепторами (БДЗ-рецепторы) мозга в условиях in vitro и ex vivo
Приготовление мембран. Исследуемых животных декапитировали, извлекали головной мозг, отделяли гиппокамп, гомогенизировали в 16 мл ледяного (0-4 °C) 50 mM Tris-HCl буфера (рН 7,4) используя гомогенизатор тефлон-стекло. Полученную суспензию центрифугировали при 42 000 g в течение 25 мин в ультрацентрифуге Optima L-70K (Beckman Coulter). После центрифугирования су-пернатант сливали, осадок ресуспендировали повторной гомогенизацией в том же объёме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл Tris-HCl буфера и использовали по 250 мкл в процедуре связывания [N-метил-Щ] -флунитразепама.
Процедура радиолигандного связывания. Полученную мембранную фракцию головного мозга
инкубировали с [N-метил-3H] -флунитразепамом (удельная активность 81 Ки/ммоль) в течение 30 мин при температуре 0—4 °C. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого феназепама (20 мкМ). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Процесс связывания останавливали путём добавления ледяного буфера и быстрой фильтрацией через сте-кловолоконные фильтры типа GF/B (Whatman) с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объёмом 8 мл.
Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия. Фильтры высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещали в сцинтил-ляционную жидкость (реактив Брея) объёмом 5 мл и использовали для сцинтилляционного счёта. Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на сцинтилляционном счётчике PerkinElmer 2900TR. Эффективность счёта составляла более 45%. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего.
Анализ радиорецепторного связывания. Для обработки результатов радиолигандного связывания и построения кривых связывания радиоактивного лиганда использовали программу Graphpad Prism 4 Demo. При анализе насыщения и получения характеристик связывания Bmax (величина отражает количество мест связывания лиганда на соответствующих рецепторах в исследуемой структуре мозга) и Kd (отражает аффинитет лиганда к местам связывания на рецепторном комплексе) измеряли специфическое связывание в диапазоне концентраций меченого лиганда от 0.01 до 20 нМ. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Неспецифическое связывание определяли в присутствии немеченого лиганда (20 мкМ). Для построения кривых вытеснения радиоактивных лиган-дов каждая концентрация исследуемого вещества была взята в 3-х повторностях. Результаты представлены в виде «mean±S.E.M».
Результаты исследования
Получение ПБЦА НЧ с фе-назепамом. Наночастицы были приготовлены методом кислотной полимеризации в среде, содержащей
80 -| 706050403020100
ru -L-
декстран 70000 в качестве стабилизатора. Показано, что оптимальная скорость перемешивания при полимеризации — 500 об/мин, оптимальным стабилизатором является декстран-70 в диапазоне концентраций от 0,5 до 2,5%. Выявлена зависимость между уровнем рН полимеризационной среды и размерами ПБЦА НЧ — размер ПБЦА НЧ увеличивается при снижении рН от 3 до 1,9. Показано, что наносуспензия с феназепамом остаётся стабильной в течение 24 часов.
Методом фотонной корреляционной спектроскопии установлено, что размеры ПБЦА НЧ с феназепамом лежат в пределах от 230 до 250 нм. Включение феназепама в НЧ составило 65%.
Изучение фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА НЧ, в сравнении с феназепамом в субстанции. Анксиолитическое действие было изучено в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) в опытах на мышах. Установлено, что феназепам в субстанции оказывал отчётливый дозозависимый анксиолитический эффект (табл. 1). В дозе 0,1 мг/кг он увеличивал время, проведённое в открытых рукавах в 6,3 раза, в дозе 0,5 мг/кг — в 7,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг — в 11,2 раза (рис. 1).
НаноФен также оказывал выраженный, зависимый от дозы анксиолитический эффект (табл. 1). В дозе 0,1 мг/кг (внб) он увеличивал время, проведённое в открытых рукавах в 7,6 раза, в дозе 0,5 мг/ кг — в 10,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг — в 13,7 раза (рис. 1).
Таким образом, по выраженности анксиолити-ческого эффекта НаноФен даже несколько превос-
ru -L-
l" ru-L
0,1 мг/кг
0,5 мг/кг
1,0 мг/кг
Рис. 1. Анксиолитическое действие феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (НаноФен), в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах
*—различие с контролем достоверно при p < 0,05
-х
к
к
_ *
к
Таблица 1
Анксиолитическое действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен), в сравнении с феназепамом в субстанции (Фен-Субс),
в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах
Вводимые вещества Число выходов в открытые рукава Время в открытых рукавах (сек.) Число свешиваний Число выходов в закрытые рукава
Контроль №0) 0,43±0,09 5,14±1,78 0,29±0,12 2,29±0,1
НаноФен (0,1 мг/кг, внб) 2,53±0,16* 39,16 ±5,18* 2,11±0,24* 1,1±0,09*
Фен-Субс (0,1 мг/кг, внб) 3,27±0,48* 32,3±3,16* 2,66±0,61* 0,64±0,18*
НаноФен (0,5 мг/кг, внб) 2,73±0,18* 55,86±7,14* 2,12±0,47* 1,3±0,22*
Фен-Субс (0,5 мг/кг, внб) 2,57±0,48* 41,1±5,17* 2,06±0,52* 1,1±0,21*
НаноФен (1 мг/кг, внб) 2,57±0,89* 70,86±4,84* 2,29±0,52* 1,28±0,41*
Фен-Субс (1 мг/кг, внб) 2,43±0,75* 57,8±6,77* 1,86±0,41* 1,28±0,41*
Примечание: *—различие с контролем достоверно при p < 0,05
ходит феназепам в субстанции, однако, различия не носят достоверного характера.
Антиагрессивное действие было изучено в тесте немотивированной агрессивности — «драки» на электродном полу в опытах на мышах. При использовании феназепама в субстанции в дозе 2 мг/ кг порог болевой реакции животных увеличился в 1,9 раз, а порог агрессивной реакции — в 1,6 раз (табл. 2).
Таблица 2
Антиагрессивное действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен) и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте «драки» у мышей
Показатели поведения Контроль №0) НаноФен (2 мг/кг, внб) Фен-Субс (2 мг/кг, внб)
Порогболевой реакции 6,13±1,73 23,5±6,18* 11,88±4,22*
Порог агрессивной реакции 22,5±4,96 38,8±4,51* 36,5±1,29*
Порог судорожной реакции 25,5±1,93 40,13±1,29* 31,88 ±1,81*
Примечание: *—различие с контролем достоверно приp < 0,05
НаноФен в дозе 2 мг/кг увеличивал порог болевой реакции животных в 3,8 раз, а порог агрессивности — в 1,72 раза (табл. 2) и, таким образом, не уступал феназепаму в субстанции по антиагрессивному действию.
При изучении противосудорожного действия установлено, что феназепам в субстанции и НаноФен в 100% случаях блокировали судороги, вызванные коразолом, в то время как в контрольной группе при введении аналогичной дозы коразола у 90% крыс наблюдались тонико-клонические судороги.
После введения бемегрида в дозе 10 мг/кг в сен-сомоторной коре, дорзальном гиппокампе и латеральном гипоталамусе регистрировались эпилеп-тиформные разряды высокоамплитудных острых и медленных волн, амплитудой более 200 мкВ,
длительностью от 0,3 до 2,5 сек. (рис. 2). Число разрядов за минуту составило в среднем 12,3±4,6, а длительность разрядов за минуту — 6,1±0,4. НаноФен почти полностью устранял первично-генерализованные судороги (рис. 3) и значительно увеличивал латентное время появления эпиразря-дов. Число разрядов в минуту составило 1,1±0,07, т.е. в 11 раз меньше, чем в контроле, а длительность 0,45±0,07, т.е. в 13 раз меньше, чем в контроле.
Феназепам в субстанции также ослаблял эффекты бемегрида: число разрядов за минуту снижалось до 3,2±0,5, а длительность до 0,5±0,08. Таким образом, можно отметить, что противосу-дорожная активность НаноФен была несколько выше, чем у феназепама в субстанции.
При изучении седативного эффекта под влиянием феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось существенное уменьшение, по сравнению с контролем, числа пересечённых мышами квадратов (в 7 раз), количества вертикальных стоек (в 5 раз) и количества обследованных отверстий (в 15 раз) в открытом поле, что свидетельствует о его выраженном седативном действии. НаноФен практически не вызывал снижения числа пересечённых квадратов и числа вертикальных стоек (табл. 3).
Таблица 3
Седативный эффект феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы (НаноФен), и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте «открытое поле» в опытах на мышах в дозе 1 мг/кг
Показатели поведения Контроль №0) НаноФен (1 мг/кг, внб) Фен-Субс (1 мг/кг, внб)
Горизонтальные перемещения 32,5±3,96 37,24±3,85 4,59±1,6*
Вертикальные стойки 6,29±1,78 4,24±0,63 1,24±1,25*
Обследованные отверстия 7,12±1,75 6,88±1,45 0,47±0,63*
Число болюсов 1,82±0,21 0,35±0,16* 1,24±0,45
Примечание: *—различие с контролем достоверно приp < 0,05
Рис. 2. Электрограммы крысы, зарегистрированные через 10 минут после введения бемегрида
Рис. 3. Электрограммы крысы, зарегистрированные при введении НаноФен и бемегрида
Изучение миорелаксантного действия. В опытах на крысах феназепам в субстанции в дозе 1 мг/ кг вызывал падение со стержня 50% крыс с латентным периодом 11,2 с., а в дозе 2 мг/кг — 80% животных с латентным периодом 4,1 с. НаноФен в дозах 1 и 2 мг/кг практически не оказывал миорелаксантного действия: количество крыс, неспособных удержаться на вращающемся стержне при использовании вещества в дозах 1 и 2 мг/кг составило 10%.
В опытах на мышах при использовании фена-зепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось падение со стержня 50% мышей с латентным периодом 8,4 с., а в дозе 2,5 мг/кг — 90% животных с латентным периодом 2,8 с. В дозе 5 мг/кг феназепам в субстанции оказывал еще более глубокое мио-релаксантное действие. У животных наблюдалось расслабление задних конечностей и 50% животных не были способны перемещаться даже на плоской поверхности (лабораторном столе). НаноФен в дозе 1 мг/кг не вызывал нарушения координации движений и миорелаксантного действия. В дозе 2,5 мг/кг НаноФен вызывал нарушение коорди-
нации движений у 20% мышей при первой посадке и у 10% мышей при второй посадке. В высокой дозе 5 мг/кг НаноФен вызывал нарушение координации движений у 70% мышей.
Таким образом, полученные результаты показали, что фе-назепам, включённый в ПБЦА наночастицы, обладает выраженным анксиолитическим, антиагрессивным и противо-судорожным действием, аналогичным действию феназепаму в субстанции, однако, в отличие от феназепама в субстанции, в терапевтических дозах не обладает седативным и мио-релаксантным действием.
С целью выяснения вопроса о возможном вовлечении ГАМК-бензодиазепинового ре-цепторного комплекса в реализацию анксиолитического действия наноразмерной формы феназепама были использованы фармакологические анализаторы — флумазенил и бику-куллин. Флумазенил — этил-8-фтор-5,6-дигидро-5-метил-6-оксо-4Н-имидазо [1,5^-1,4] бензодиазепин-3-карб оксилат является конкурентным бло-катором специфических бен-зодиазепиновых рецепторов и устраняет все центральные эффекты бензодиа-зепиновых транквилизаторов: анксиолитический, снотворный, седативный и миорелаксантный, а также способствует восстановлению дыхания и сознания при передозировке бензодиазепинов. Бикукуллин — алкалоид, выделяемый из растения Dicentra сысы11апа, является антагонистом ГАМК-А рецепторов и снижает центральные эффекты бен-зодиазепиновых анксиолитиков.
В ходе проведённого исследования установлено, что флумазенил (10 мг/кг, внб), введённый после феназепама (1 мг/кг), достоверно снижает анксиолитический эффект как феназепама в субстанции, так и НаноФен, о чём свидетельствует значительное уменьшение (более чем в 6 раз) числа наказуемых взятий воды по сравнению с показателями одних веществ (рис. 4). Бикукуллин (1 мг/ кг, внб) также ослабляет анксиолитический эффект феназепама в субстанции и НаноФен (рис. 4), но его эффект был менее выражен, чем эффект флумазенила. Полученные данные позволяют предположить, что в реализацию анксиолитиче-
Рис. 4. Влияние флумазенила (флум) в дозе 10 мг/кг и бикукуллина (бик) в дозе 1 мг/кг на анксиолитиче-ское действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы в дозе 1 мг/кг, и феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг, в тесте конфликтной ситуации в опытах на крысах *—различие с контролем достоверно при p < 0,05 #—различие с препаратом без антагониста достоверно при p < 0,05
ского действия НаноФен также как и в механизм действия феназепама в субстанции, вовлекаются бензодиазепиновые и ГАМК-А рецепторы.
С целью получения доказательных представлений о механизме действия наноразмерной формы феназепама проводили изучение рецепторного связывания феназепама, включённого в ПБЦА НЧ с бензодиазепиновыми рецепторами мозга в условиях in vitro и ex vivo.
Эксперименты in vitro. Результаты сравнения динамики специфического связывания и величин IC50 двух серий экспериментов в условиях in vitro представлены на рис. 5. Как феназепам, так НаноФен вмешиваются в процесс связыва-
пама и НаноФен представлены на рис. 6. Эффекты обоих веществ описываются классическим кривыми насыщения, указывающими на монотонное и моноцентровое связывание лиганда. При этом обе экспериментальные кривые лежат существенно выше, чем в контрольной группе сравнения.
Количественные параметры рецепторного связывания, рассчитанные по программе Graphpad Prism 4 Demo, приведены в табл. 4, из которой следует, что под влиянием субхронического введения изменениям подвергаются обе константы, описывающие состояние БДЗ-рецепторов: во-первых, величины констант диссоциации Kd уменьшаются в обеих группах на 22% (р<0.01), что интерпретируется как возрастание степени структурного сродства рецептора к лиганду ([N-метил-Щ] -флунитразепаму); во-вторых, возрастают величины B , отражающие плотность
r max' г '
мест связывания лиганда. Причём, под влиянием феназепама количество рецепторов увеличивается на 46% (p<0.01), а под воздействием НаноФен — на 70% (p<0.01). При этом действие НаноФен оказывается заметно эффективнее (p<0.05).
Таблица 4
120 -i
100-
Щ 80-
ния [N-метил-Н] -флунитра-зепама с рецепторами гиппо-кампа с близкими величинами 2,8 и 6,6 нмоль/л. Полученные данные in vitro свидетельствуют о том, что включение феназепа-ма в ПБЦА наночастицы не изменяет способности феназепа-ма специфически связываться с БДЗ-рецепторами мозга.
Эксперименты ex vivo. Результаты изучения состояния БДЗ-рецепторов после 5-кратного системного введения феназе-
з
>о о
60-
40-
20-
Феназепам ICr„ = 2.84±0.1nM
IC50 = 6.60±0.1nM
-12
-11
"Г -10
"Г
-9
"Г
-7
"Г
-5
Log (концентрация соединения, M)
Рис. 5. Влияние феназепама и НаноФен на связывание [И-метил-3И] -флунитразепама мембранами гиппокампа крыс in vitro
0
5
10
15
20
Концентрация [N-метил-'Н] - флунитразепама [мМ]
Рис. 6. Сравнительное влияние субхронического введения феназепама (1 мг/кг, 5 дней) и НаноФен (1 мг/кг, 5 дней) на характеристики радиолигандного связывания с мембранами гиппокампа крыс ex vivo
Характеристики рецепторного связывания феназепама и НаноФен с БДЗ-рецепторами гиппокампа крыс после субхронического введения (1мг/кг/день*5) ex vivo
Группы Bmax, фмоль/мг белка (% к контролю) Kd, нмоль/л (% к контролю)
Контроль 975±17 (100±2%) 5,02±0,23 (100±5%)
Феназепам 1427±28* (146±3%) 3,94±0,22* (78±4%)
НаноФен 1662±44*/ ** (170±5%) 3,92±0,30* (78±6%)
Примечания: *—отличие от контроляр<0.01; **—отличие от феназепамар < 0.05
Обсуждение результатов
При изучении спектра фармакологических эффектов феназепама, включённого в ПБЦА на-ночастицы, было установлено, что он обладает выраженным анксиолитическим эффектом в тесте приподнятого крестообразного лабиринта, аналогичным эффекту феназепама в субстанции, который является дозозависимым и усиливается при повышении дозы от 0,1 до 1,0 мг/кг. По выраженности анксиолитического эффекта фена-зепам, включённый в ПБЦА наночастицы, даже несколько превосходит феназепам в субстанции, однако, различия не носят достоверного характера. Наряду с анксиолитическим эффектом, феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, и фе-
назепам в субстанции обладают сходным антиагрессивным эффектом в тесте «драки» пары мышей на электродном полу и противосудорожным эффектом в тестах антагонизма с ко-разолом и бемегридом. В тоже время, феназепам, включённый в ПБЦА наночастицы, в сравнении с феназепамом в субстанции, не обладает в терапевтических дозах седативным и миорелаксантным действием. В высокой дозе (5 мг/кг) НаноФен оказывает значительно меньшее миорелаксантное действие (нарушение координации движений у 70% животных), чем феназепам в субстанции (нарушение координации у 100% животных, расслабление задних конечностей и неспособность передвижения даже на плоской поверхности).
Таким образом, феназепам, инкапсулированный в ПБЦА наночастицы, покрытые по-лисорбатом 80, в сравнении с феназепамом в субстанции, обладает выраженным анксиолитическим, антиагрессивным и противосудорожным действием, аналогичным действию феназепаму в субстанции, однако, в отличие от феназепама в субстанции, в терапевтических дозах не обладает седативным и миорелаксантным действием.
Для объяснения вышеуказанных эффектов феназепама, включённого в матрикс ПБЦА, нами были проведены исследования, которые позволяют предположить, что в реализацию анксиолитиче-ского действия феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы, также как и в действие феназепама в субстанции, вовлекаются бензодиазепиновые и ГАМК-А рецепторы. Об этом свидетельствует тот факт, что флумазенил — антагонист бензодиа-зепиновых рецепторов достоверно снижает анкси-олитическое действие феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы. Наряду с этим, достоверно снижает анксиолитическое действие феназепама бикукуллин — антагонист ГАМК-А рецепторов. Полученные данные позволяют предположить, что фармакологические эффекты инкапсулированного в наночастицы феназепама реализуются через бензодиазепиновые рецепторы, которые ал-лостерически связаны с ГАМК-А рецепторами.
Результаты проведённых исследований по изучению рецепторного связывания в условиях in vitro подтвердили предположение о том, что действие инкапсулированного в наночастицы фена-
0
зепама опосредуется через БДЗ-рецепторы. При этом установлено, что поли (бутил) цианоакри-латные наночастицы не влияют на способность феназепама специфически связываться с БДЗ-рецепторами мозга. Выявленное в экспериментах ex vivo существенное возрастание константы B
J r max
при субхроническом введении наноформы фена-зепама свидетельствует об увеличении плотности участков связывания феназепама в структуре БДЗ-рецепторов гиппокампа. Таким образом, некоторое повышение фармакологической активности феназепама, включённого в ПБЦА наночастицы, можно отчасти объяснить его более полным связыванием с БДЗ-рецепторами мозга.
К настоящему времени можно считать доказанным, что поли (бутил) цианоакрилатные наноча-стицы, покрытые полисорбатом 80, способны осуществлять доставку ЛВ в мозг [11—16]. Ключевую роль в этом процессе играют аполипопротеины Аро-Е и АроА-1, сорбирующиеся на поверхность частицы из плазмы крови [17, 18]. Наличие аполи-попротеинов на поверхности наночастиц придаёт им сходство с липопротеинами плазмы крови, что и обеспечивает их рецептор-зависимый эндоцитоз эндотелиоцитами капилляров мозга [19]. Внутри
эндотелиальной клетки частица подвергается биодеградации под действием ферментов и выделяет ЛВ, которое затем диффундирует через мембрану в межклеточное пространство.
В структурах мозга выявлена различная плотность рецепторов к Аро-Е и АроА-1. Показано, что в головном мозге рецепторы к АпоЕ и АроА-1 находятся в наибольшем количестве в гиппокампе и коре [20—22]. Эти данные хорошо коррелируют с результатами о том, что именно в гиппокампе, а также в коре и в значительно меньшей степени в других структурах под влиянием нанокапсули-рованного феназепама происходит усиление спектров мощности ЭЭГ [23].
Учитывая вышеизложенное можно предположить, что феназепам, включённый в ПБЦА нано-частицы, доставляется преимущественно в гип-покамп и кору, т.е. в структуры наиболее значимые для проявления анксиолитического эффекта, и в которых плотность рецепторов к АпоЕ и АроА-1 максимальна. Этот факт в определённой степени объясняет наблюдаемое расслоение основных и побочных эффектов инкапсулированного в поли (бутил) цианоакрилатные наночасти-цы феназепама.
Литература
1. Wohlfart S., Gelperina S., Kreuter J. Transport of drugs across the blood—brain barrier by nanoparticles. J. Control. Release 2012. Vol. 161, P. 264-273.
2. Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer. Tumori 2008. Vol. 94, Р. 271-277.
3. Andrieux K., Garcia-Garcia E, Kim H.R, Couvreur P. Colloidal carriers: a promising way to treat central nervous system diseases. J. Nanoneurosci. 2009. № 1. Р. 17-34.
4. De Juan B. S, Von Briesen H, Gelperina S. E, Kreuter J. Cytotoxicity of doxorubicin bound to poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles in rat glioma cell lines using different assays. J. Drug Target. 2006. № 14. Р. 614-622.
5. Aktas Y, YemisciM, AndrieuxK, et al. Development and brain delivery of chitosan-PEG nanoparticles functionalized with the monoclonal antibody OX26. Bioconjug. Chem. 2005. № 16. Р. 1503-1511.
6. Steiniger S. C, Kreuter J., Khalansky A. S, et al. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles. Int. J. Cancer 2004. Vol. 109, Р. 759-767.
7. Wang C. X., Huang L. S, Hou L. B, et al. Antitumor effects of polysorbate-80 coated gemcitabine polybutylcyanoacrylate nanoparticles in vitro and its pharmacodynamics in vivo on C6 glioma cells of a brain tumor model. Brain Res. 2009. Vol. 1261, Р. 91-99.
8. Mahajan S. D, Roy I., Xu G, et al. Enhancing the delivery of antiretroviral drug «Saquinavir» across the blood brain barrier using nanoparticles. Curr. HIV Res. 2010. Vol. 8. Р. 396-404.
9. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ. — Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р. У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 253-263.
10. Pellow S. Validation of open: closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J. Neurosci.Methods. 1982. Vol.14. Р.149-167.
11. Alyautdin R, Gothier D, Petrov V., et al. Analgesic activity of the hexapeptide dalargin adsorbed on the surface of polysorbate 80-coated poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles. Eur. J. Pharm. Biopharm 1995. Vol. 41. Р. 44-48.
12. Alyautdin R. N, Petrov V. E, Langer K., et al. Delivery of loperamide across the blood-brain barrier with polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles. Pharm. Res. 1997. Vol. 14. Р. 325-328.
13. Gulyaev A. E, Gelperina S. E, Skidan I. N., et al. Significant transport of doxorubicin into the brain with polysorbate 80-coated nanoparticles. Pharm. Res. 1999. Vol. 16. Р. 1564-1569.
14. Басел А., Петров В. Е, Балабаньян В. Ю. и др. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи полибутилцианоакрилатных на-ночастиц, покрытых полисорбатом 80. Рос. мед. журн. 2006. № 4. С. 28-32.
15. Kurakhmaeva K. B, Djindjikhashvili I. A., Petrov V. E, et al. Brain targeting of nerve growth factor using poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles. J. Drug Target. 2009. Vol. 17. Р. 564-574.
16. Балабаньян В. Ю., Солев И. Н, Елизарова О. С. и др. Нейропротекторный эффект человеческого рекомбинантного эритропоэтина, сорбированного на полимерных наночастицах, на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (модель геморрагического инсульта). Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011. № 5. С. 8-13.
17. Kreuter J., Hekmatara Т., Dreis S., et al. Covalent attachment of apolipoprotein A-I and apolipoprotein B-100 to albumin nanoparticlesenables drug transport into the brain. J. Control. Release 2007. Vol. 117, Р. 54-58.
18. Zensi A., Begley D, Pontikis C, et al. Human serum albumin nanoparticles modified with apolipoprotein A-I cross the blood-brain barrier and enter the rodent brain// J. Drug Target. 2010. Vol. 18. Р. 842-848.
19. Kreuter J., Shamenkov, D. Petrov V., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier// J. Drug Target. 2002. Vol. 10. Р. 317-325.
20. Holtzman D. M, Bales K. R, Tenkova T. et al. Apolipoprotein E isoform-dependent amyloid deposition and neuritic degeneration in a mouse model ofAlzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. Vol. 105, Р. 2892-2897
21. Irizflrry M. C, Cheung B, Rebeck et al. Apolipoproteins affect the amount, form, and anatomical distribution ofamyloid — peptide deposition in homozygous APP V717F transgenic mice. Acta Neuropath. 2000. Vol. 100, Р. 451-458
22. Bales K. R., Verina T, Cummins D. J. et al. Apolipoprotein E is essential for amyloid deposition in the APP V717F transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. Vol. 96, 1523-1528
23. Разживина В. А. Изучение эффектов феназепама на поли (бутил) цианоакрилатных наночастицах.— Автореф. дисс. канд. биол. наук. М. 2009. 24 с.
