CC BY
16
УДК:66.094.3.098
Лакина Н.В., Лыса В.А., Бровко Р.В., Долуда Е.О., Лакина М.Е.
ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ СПОСОБОВ ПРИМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСА ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ
Лакина Наталия Валерьевна, к.х.н.,доцент кафедры биотехнологии,химии, стандартизации; e-mail: lakina@yandex.ru
Лыса Виктория Александровна, студент 4 курса химико-технологического факультета Бровко Роман Викторович, студент 2 курса магистратуры химико-технологического факультета Долуда Евгений Олегович, студент 2 курса химико-технологического факультета Лакина Маргарита Евгеньевна, студент 3 курса химико-технологического факультета Тверской государственный технический университет, г. Тверь, Россия.
В настоящее время особенно актуальным является получение энергии с использованием экологически чистых биологических компонентов. Изучение эффективных способов применения окислительно-восстановительных ферментов позволит получить биотопливные элементы, биосенсоры с высокочувствительными к химическим сигналам электродами. Данная работа посвящена изучению влияния рН растворов многокомпонентных субстратов на активность комплекса ферментов глюкооксидазы и пероксидазы. Показано, что исследуемый комплекс ферментов наиболее активен в интервале рН от 5.45 до 7.23, что расширяет возможности его использования.
Ключевые слова: окислительно-восстановительные ферменты, биотопливные элементы, биосенсоры, D-глюкоза
STUDY OF EFFECTIVE WAYS TO USE A COMPLEX OF REDOX ENZYMES
Lakina Natalija Valirjevna, Lisa Viktorija Alexandrovna, Brovko Roman Viktorovich, Doluda Evgeniji Olegovich, Lakina
Margarita Evgenievna
Tver state technical University, Tver, Russia
Currently, it is particularly important to obtain energy using environmentally friendly biological components. The study of effective ways to use redox enzymes will allow us to obtain biofuel elements, biosensors with highly sensitive electrodes to chemical signals. This work is devoted to the study of the effect ofpH solutions of multicomponent substrates on the activity of the complex of enzymes glucooxidase and peroxidase. It is shown that the studied enzyme complex is most active in the pH range from 5.45 to 7.23.
Keywords: redox enzymes, biofuel elements, biosensors, D-glucose.
В последнее время всё большее внимание в различных исследовательских работах уделяется безреагентным биосенсорам, основанным на прямом переносе электронов между активным центром фермента и поверхностью электрода («биосенсоры третьего поколения») [1]. К ним относятся и биосенсоры, в которых перенос происходит после предварительной модификации поверхности электрода. Основным ограничением для ферментов, определяющим возможность существования прямого переноса электронов, является близкое расположение активного центра к поверхности глобулы. Наличие прямого переноса было показано для ряда пероксидаз [1,2]. Б- глюкоза как биотопливо используется для преобразования энергии для питания электронных устройств в живом организме из-за своей высокой специфичности биокатализаторов. GOX является одним из наиболее широко используемых ферментов для анодного окисления глюкозы клетками биотоплива глюкозы-02 за счет своих стабильных показателей активности и времени жизни при нескольких значениях рН. [3]
Получение ферментативных биотопливных ячеек - достаточно трудоемкая процедура. Для их конструирования нужно учесть множество факторов:
условия протекания реакции, при каких рН буферных смесей ферменты будут более активны, и в итоге подобрать такие ферментативные системы, сочетание которых будет давать наилучший результат. Мы рассматривали сочетание глюкоокидазы (GOX) и пероксидазы (HRP). GOX катализирует с высокой селективностью окисление ß-D-глюкозы до глюконолактона с помощью процесса переноса 2e и 2H+ и регенерирует себя путем восстановления кислорода до перекиси водорода. Этот побочный продукт часто рассматривается как недостаток в применении биотоплива в клетках из-за его токсичности и денатурации белков. Однако используют HRP в качестве катализаторов для восстановления перекиси водорода и таким образом получают усиление аналитического отклика окислительно -
восстановительной реакции в многокомпонетном растворе, содержащем D-глюкозу [4,5].
Как и белки ферменты чувствительны к значению рН среды. Ионизация функциональных групп в молекуле фермента зависит от концентрации водородных ионов. Ферменты активны только в определенном интервале рН и каждый биокатализатор характеризуется оптимальным
значением рН, зависящим от природы фермента, субстрата и от свойств среды [20]. Наличие оптимума рН определяется несколькими причинами:
1) истинное обратимое влияние рН на максимальную скорость реакции V при насыщении фермента субстратом;
2) влияние рН на сродство фермента к субстрату, которое, как считается, может отражать константа Михаэлиса Км;
3) влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или обе стороны от оптимума.
Важно, что перечисленные факторы могут действовать в комбинации друг с другом. Специфика пероксидазного катализа состоит в том, что с изменением рН среды может менять состояние или строение молекул субстратов (ароматические амины) и ингибиторов (фенолы и производные) вследствие протонизации аминов и диссоциации фенолов по ОН связи, что изменяет реакционную способность субстратов и ингибиторов [6].
Все вышеперечисленные факты указывают на актуальность исследований условий эффективной работы комплекса окислительно-восстановительных ферментов.
Эспериментальная часть
Материалы и методы
Очищенная пероксидаза хрена (HRP) с активностью 150 ед/мг («Sigma»); C18H24N6S4 2,2-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) диаммониевая соль (ABTS) (чда, «BioChemica»); очищенная глюкооксидаза из Aspergillus niger (GOX) c активностью 174.9 ед/мг («Sigma»); D-глюкоза («Sigma»), Н2О2 (55%, чда, "Акрихим"); СН3СООН, СНзСООШ, Na2HPO4 (х. NaH2PO4 (хч, "Акрихим").
Приготовление ферментного окислительно-восстановительных комплекса (HRP и GOX): mHRP=mGOX=0.001 г растворяли в ацетатном (или) фосфатном буфере V=100 мл. Для измерения активности комплекса ферментов (HRP и GOX) были выбраны оптимальные разведения субстратов, при которых скорость ферментативной реакции достигала максимального значения и в дальнейшем не зависела от их концентраций: Cabts = = 1.73x10"3 моль/л; Сн2О2=СD-глюкозы = 0.0026 моль/л.
Активность ферментного комплекса оценивали спектрофотометрически (СФ UV/VIS Excellence, Х=405 нм, е=36800 М-1см-1) фиксируя переход окраски рабочего раствора от бесцветного до синего. Схемы химических реакции описываются следующими уравнениями (1,2).
GOD
02 + ß-D-глюкоза —* Р-0-глюкоза-5-лактон + Н20 (1)
HRP
Н-,0-. + ABTS — 2 Н-,0 + ABTS
(2)
В анализе продуктов ферментативной окислительно-восстановительной реакции ABTS превращается в катион-радикал путем, который является реактивным по отношению к большинству антиоксидантов, включая пероксиды. В процессе
реакции синий катион радикала ABTS превращается обратно в бесцветную нейтральную форму. Реакция может контролироваться спектрофотометрически.
Активность комплекса ферментов по ABTS рассчитывали по формуле (3).
^ пАА бО^РЮ5 ^
где A - активность ферментного комплекса , мкмоль/(мин*мл);
n - стехиометрический коэффициент для субстрата в реакции пероксидазного окисления;
А А - изменение экстинкции в единицу времени,
-1
с ;
V1 - объем реакционной смеси, мл;
V2 - объем фермента в реакционной смеси, мл;
F - фактор разведения
е - коэффициент молярной экстинкции субстрата реакции, равный 36800 М-1см-1 при Х= 405 нм
Результаты и их обсуждение
Большинство ферментов проявляют свою максимальную активность при рН, значения которых близки к нейтральным, для таких растворов инактивация происходит при рН<5 или pH > 9. Однако, некоторые ферменты работают в сильно щелочных или кислотных средах. В данной работе варьирование рН проводили в интервале 3.05-8.45, об активности комплекса ферментов выражали по изменению оптической плотности рабочего раствора, содержащего ABTS.
Данные по изучению влияния рН многокомпонетного раствора на активность комплекса ферментов показаны на рисунке 1.
Рисунок 1. Графики зависимости оптической плотности
окисленной формы ABTS (С = 1.73 ?< 10~3 моль/л) от времени ферментативной реакции при рН = 3.05 - 8.45
Из полученных данных (рисунок 1) можно сделать вывод, что оптимальной рН раствора, при котором будет достигаться максимальная активность
комплекса ферментов GOX:HRP, является кислая среда с меньшим ее значением, близким к нейтральной (рН=5.45). Однако, работа вблизи максимумов приводит к существенной ошибке в расчетах даже при небольшом отклонении от заданной концентрации, поэтому рекомендуется в дальнейшем работать в интервале рН 4.25-5.45. Уменьшение активности биферментного комплекса в сторону больших или меньших значений от оптимума, можно объяснить конкурентным ингибированием активных центров ферментов образующимися продуктами последовательных реакций превращения D-глюкозы и затем распада H2O2 в результате каталитического действия HRP.
Заключение
Проведенные исследования показывают, что применение комплекса ферментов HRP и GOX для проведения окислительно-восстановительных
реакций с целью увеличения их скорости является эффективным и перспективным для получения полимеро-ферментных компдексов, усиливающих аналитический отклик биосенсоров и биоэлектродов. Полученные данные изучения оптимальных значений рН многокомпонентных растворов биокаталитических окислительно-
восстановительных реакций в дальнейшем могут быть использованы для повышения
электрохимического потенциала окисления D-глюкозы при работе биотопливных элементов.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-08-00186.
Список литературы
1.Turner A., Biosensors, fundamentals and applications / Turner A., Karube I., Wilson G - Oxford: Oxford University Press, 1987, с. 240.
2.Abreu C. [et al.]. Glucose oxidase bioanodes for glucose conversion and H2O2 production for horseradish peroxidase biocathodes in a flow through glucose biofuel cell design / C. Abreu, Y. Nedellec, O. Ondelc, F. Buretc, S. Cosnier, A. Le Goff // Journal of Power Sources - 2018 - Vol. 392 р. 176-180.
3.Duonga N. B. [et al.]. Development of a facile and low-cost chitosan-modified carbon cloth for efficient self-pumping enzymatic biofuel cells / N. B. Duonga, Chih-Liang Wanga, L. Z. Huanga, W. T. Fanga, H. Yang // Journal of Power Sources - 2019 - Vol. 429 р. 111119.
4.Joonmok Shim, Enzyme-catalyzed conversion of phenol by using immobilized horseradish peroxidase (HRP) in a membraneless electrochemical reactor / Joonmok Shim, Applied catalysis, 2005.
5.Метелица Д. И. Влияние рН среды на пероксидазное окисление тетраметилбензидина и его ингибирование замещенными пирокатехинами / Д. И. Метелица, М. В. Потапович, М. В. Иксанова, О. И. Шадыро - Республика Беларусь «Труды БГУ» т. 8 (1), 2013, с. 159-166.
6.Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб -Москва «Мир», т. 2, 1982, с. 389.
