CC BY
16Изучение эффективности действия капель Плетнева № 5 (препарата № 5) на модели синдрома сухого глаза у кроликов
Плетнев Владимир Владимирович,
кандидат медицинских наук, докторант, старший научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава России E-mail: pletnevtreatment@mail.ru
На модели синдрома сухого глаза у кроликов показано, что препарат № 5 в дозе 0,05 мл/кг в разведении 1:15 стерильным физиологическим раствором при инстилляции в оба глаза животным 2 раза в день в течение 30 суток оказывает сильное противовоспалительное, ранозаживляющее и ангиопротектор-ное действие, положительно влияя на течение репаративного процесса в конъюнктиве, роговице, осложненных состоянием не смыкания век. Установлено также, что препарат № 5 в испытанной дозе способствует стимуляции репаративных процессов в конъюнктиве, роговице, клинически проявляясь в ускорении восстановления дефектов переднего эпителия и стромы роговицы, в уменьшении частоты образования глубоких дефектов роговицы, снижения выраженности воспалительной реакции и васкуляризации. Отмечается замедление формирования помутнения роговицы, уменьшение количества и появление более жидкого слизистого отделяемого конъюнктивы по сравнению с контролем. На основании морфологических исследований показано положительное влияние препарата № 5 в испытанной дозе. Препарат не допускает развития тяжелых изменений и устраняет симптомы со стороны поверхностного эпителия, стромы роговицы, передней и задней камер глаза, сосудистой оболочки и сетчатки при синдроме сухого глаза. Препарат № 5 восстанавливает поверхностный эпителий и бокаловидные клетки конъюнктивы, получившие повреждения в результате развития синдрома сухого глаза.
Ключевые слова: синдром сухого глаза, капли Плетнева № 5, доктор Плетнев.
Введение. Актуальность проблемы связана с высокими показателями распространенности синдрома сухого глаза (ССГ) среди населения. В структуре первичных обращений к офтальмологу ССГ составляет от 35 до 45%. Этот синдром также распространен у пациентов пожилого возраста.
Пациенты с ССГ более подвержены инфекцион-но-воспалительным заболеваниям переднего отрезка глаза (конъюнктивиты, кератиты) и развитию таких серьезных осложнений, как кератоу-веит, язва роговицы, кератомаляция и др. Кроме того, эти лица представляют собой группу высокого риска при проведении контактных диагностических офтальмологических процедур (измерение внутриглазного давления, ультразвуковое исследование), ношении контактных линз, выполнении рефракционных (лазерная коррекция зрения) и других офтальмологических операций.
В этой связи является актуальным изучение противовоспалительного, ранозаживляющего и ангиопротекторного действия препарата № 5.
Капли Плетнева № 5 являются комплексным растительным препаратом внутриаптечного изготовления, запатентованным в России (Патент РФ на изобретение № 2578033 от 13.03.2015), для получения которого используются листья березы повислой - Folia Betulae pendula Roth., семейство березовые - Betulaceae [1; 2; 4; 5].
Целью исследования являлось экспериментальное изучение противовоспалительных, рано-заживляющих и ангиопротекторных свойств капель Плетнева № 5 на модели синдрома сухого глаза у кроликов.
Материалы и методы исследования. Исследование противовоспалительного, ранозаживля-ющего и ангиопротекторного действия препарата № 5 на модели синдрома сухого глаза кролика проведено в лаборатории пластической хирургии отдела травм и реконструктивной хирургии глаза ФГБУ «НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (руководитель отдела д.м.н., проф. Р.А. Гундорова) в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств от 2012 года [3].
Исследование проведено на 45 кроликах (90 глаз) породы шиншилла (самцы и самки, масса тела 2,0-2,5 кг). Модель ССГ воспроизводили с подшиванием краев верхнего и нижнего века к коже лобной и щечной областей соответственно, для стойкого несмыкания век.
После создания модели ССГ оценивали общее поведение кроликов, проводили биомикроскопиче-
сз о
о Л о
о сз о в
ские исследования с фоторегистрацией состояния структур аппарата глаза. Наблюдение за состоянием глаз кроликов осуществляли с помощью биомикроскопии щелевой лампой «Karl Zeiss» и «Opton SL-30» (Германия) с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией цифровой камерой Canon 300D.
Через 5 суток, когда появились резко выраженные признаки развития сухости переднего отдела глаза, хемоз конъюнктивы, выраженная ее гиперемия, кератопатия и нитчатый кератит (в ряде случаев образование серозной дегенерации роговицы и конъюнктивы, полное несмыкание век), было начато лечение в экспериментальной группе препаратом № 5 и в двух группах в качестве референс-препаратов использовали 20% глазной актовегиновый гель (Никомед, Австрия) и стерильный физиологический раствор.
Клиническую оценку состояния глаз животных проводили на 2, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 сутки лечения по следующим показателям: степень воспалительной дегенеративной реакции, площадь дефекта эпителия и стромы, интенсивность помутнения роговицы, прокрашивание роговой оболочки флюоресцеином, состояние век и их разведение, сохранение фиксационных швов.
Степень выраженности изменений конъюнктивы и роговицы оценивали по бальной системе [Ченцова Е.В., 1996]. Ширину глазной щели измеряли линейкой. Площадь дефекта стромы роговицы оценивали с помощью биомикроскопии. Дефект стромы по глубине изучали по схеме Венвор-та [Wenworth J.S., 1993].
Степень глубины проникновения патологического процесса в роговице и эффективность лечения определяли при биомикроскопии. Полученные данные представляли в виде графиков и диаграмм. Площадь окрашивания роговицы флюо-ресцеином, а также развития эрозии или серозной дегенерации оценивали с помощью калибровочной шкалы, встроенной в окуляр микроскопа [Чен-цова Е.В., 1996].
Патогистологическое исследование глаз проводили следующим образом. После фиксации эну-клеированного глазного яблока, ножницами через склеру вскрывали задняя камера глаза и удаляли стекловидное тело. Затем каждое глазное яблоко было правильно сориентировано и разделено безопасной бритвой на две части через зрительный нерв и центр оптической зоны роговицы. Парафиновые блоки готовили методом быстрой заливки по Циммерману. Для изучения тканей роговицы использовали метод окраски парафиновых срезов гематоксилином и зозином.
На окрашенных гистологических срезах проводили морфологические исследования на световом микроскопе «Фотомикроскоп-III» (Opton, Германия). Подсчет количества фибробластов и клеток е сосудистого инфильтрата проводили в централь-е ной оптической и парацентральной областях роговицы с помощью стандартной сетки на площади ° 5 мкм2 в 20 полях. Измерение толщины роговицы ¡в осуществляли в центральной области роговицы
на 5 точках, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга и вычисляли среднее значение.
Съемку на цифровую камеру и морфологическую обработку изображений для биомикроскопического исследования производили с помощью аппаратно-программного комплекса автоматической морфоденситометрии «ДиаМорф Объектив» (компания ДиаМорф).
Результаты и обсуждение. Исследования проведены на 3-х группах кроликов шиншилла (45 животных (90 глаз), самцы и самки, масса тела 2,0-2,5 кг) по 15 животных (30 глаз) в каждой: 1 группа - контроль, стерильный физиологический раствор (СФР); 2 группа - препарат сравнения 20% глазной актовегиновый гель (АГ) (Никомед, Австрия); 3 группа - препарат № 5. Препарат № 5 в дозе 0,05 мл/кг в разведении 1:15 СФР инстилли-ровали животным в оба глаза 2 раза в день в течение 30 суток. По 1 капле АГ из тубы закладывали животным в оба глаза 2 раза в день в течение 30 суток. В оба глаз контрольных животных инстил-лировали СФР 2 раза в день в течение 30 суток.
Предварительными исследованиями на интакт-ных кроликах было установлено, что при введении препарата № 5 в глаза животных признаков токсико-аллергической реакции (дерматит век, реакция конъюнктивы, аллергические инфильтраты в лимбе или роговице) не наблюдается. Критериями оценки действия препарата служили: напряжение швов, фиксирующих расхождение век, состояние конъюнктивы и ее отделяемого, характеристика поверхностного слоя (с прокрашиванием флюоресцеином) и глубоких слоев роговицы.
На основании динамического наблюдения можно отметить, что в течение первых 5 суток эксперимента после создания модели ССГ у всех 45 кроликов контрольной и опытных групп, наблюдалась примерно одинаковая картина состояния век и их разведения, реакции конъюнктивы, стромы роговицы, ее поверхности с окрашиванием роговой оболочки флюоресцеином, отделяемому слизистой оболочки.
Тяжесть состояния усиливалась аутотравмати-зацией придаточного аппарата глаза и самого глаза кроликов, от раздражающих его век и слизистой. В группе с препаратом № 5 веки разведены полностью (4 балла) и начинают деформироваться (3 балла). На конъюнктиве наблюдается ишемия по лимбу, сама ткань рыхлая (3 балла) и воспалительная реакция отсутствует (0 баллов). Выявлено обильное количество разного по консистенции отделяемого.
Состояние роговицы у разных кроликов неоднозначно, наблюдается как спокойное состояние без окрашивания эпителия, так и отмечается прокраска поверхности эпителия и склонного к подвижности, много окрашиваемой слизи на поверхности роговицы, состояние повышенной кератопа-тии (2 балла).
Таким образом, выявленные изменения со стороны положения век, отсутствие их смыкания, со-
стояние конъюнктивы в виде застойных явлении, обильное количество разного по консистенции отделяемого, начальная кератопатия и формирование серозной дегенерации, появление абсцесса роговицы и формирование язвенного очага свидетельствует о возможности использования данной экспериментальной модели ССГ для изучения влияния препарата № 5 и АГ на патологический процесс.
2-е сутки лечения. В группе контроля - на 2 сутки инстилляций СФР конъюнктива выражено ги-перемированная. В случаях, когда конъюнктива внешне была более спокойная, она была с сужеными сосудами и бледной тканью. Отделяемое чаще комбинированное: сухое и влажное (2-3 балла), чисто влажное не более 1 балла.
На роговице - в центральной зоне наблюдается буллезная кератопатия в виде капли от 1 до 3 мм и флюоресцеиновая проба в 2 балла. Отмечено отсутствие изменений поверхностного слоя роговицы, но начинает страдать строма (1-3 балла) в верхних квадрантах без прокраски флюоресце-ином. В 2 случаях, когда изменение стромы роговицы оценивалось в 3 балла, появились явления эндофтальмита.
В группе с АГ на фоне гиперемии (3 балла) с неровной структурой ткани снижалась отечность конъюнктивы и в отдельных случаях наблюдалось восстановление ее нормального цвета.
Отмечалось более влажное и равномерное отделяемое, сухая его часть уменьшалась в объеме и уплотнялась.
Роговица - состояние спокойное, на поверхности остаточные явления мазеподобной слизи и прокраска флюоресцеином не выявляется (1 балл), наблюдалась эпителизация, размер очагов не уменьшился. Сохраняется кератопатия около уплощаемой серозной дегенерации, которая уже не прокрашивается и строма роговицы теряет характерную опалесценцию, буллезная кератопатия разрешилась, сохраняется десцеметит (или кера-топатия роговицы - общее название группы хронических патологий роговой оболочки глаз, которые проявляются в ее помутнении и уменьшении остроты зрения вследствие нарушения целостности слоев роговицы), в очаге «бублика» образовалась серозная дегенерация около 2 мм. В зоне абсцедирования определяется гиперплазия слизистой поверхности, очаг контурирует.
Серозная дегенерация трансформируется с удлинением очага и формированием вокруг него ке-ратопатией (3 балла), флюоресцеин прокрашивает только сам измененный участок и слизь вокруг него (2 балла).
В группе с препаратом № 5 наблюдается выраженная деформация век, в % случаях изменение тканей век различной интенсивности, более выраженное у верхних век. Отмечается гиперемия конъюнктивы, местами она становится рыхлой и отечной с узелковой деформацией в зоне фактически выворота, количество отделяемого составляет 3 балла. Структура отделяемого - от сухой
корочки до обильного слизистого. В тех случаях, где конъюнктива не повреждена отделяемого нет.
Отмечаются роговицы с дефектом поверхностного эпителия и развитием кератопатии (1 балл), флюоресцеиновая проба (2 балла). В других случаях роговица спокойная и флюоресцеиновая проба (1 балл), легко перемещается по поверхности. На 6 глазах сохраняется кератопатия (2 балла) и флюоресцеиновая проба (2 балла), уже определяется прокраска самой ткани роговицы.
Конъюнктива в опытной группе под влиянием препарата № 5 менее раздражена.
Поверхность роговой оболочки не прокрашивается при назначении препарата № 5 у 53,6% глаз, малая доля в 2,9% случаев отмечена при закапывании СФР, окрашивание флюоресцеином в 1 балл определялось практически одинаково во всех группах. Однако, в группе с препаратом № 5 окрашивание в 2 балла отмечалось в 1,2% случаев, тогда как в группах с СФР и АГ в 22,9% и 35,8% случаев соответственно.
Полная прозрачность роговицы наблюдалась в 72,6% случаев в группе с препаратом № 5, в группах с СФР и АГ, соответственно в 27,8% и 45,7% случаев.
Первые инстилляции СФР, АГ и препарата № 5 на поверхность глаза показали преимущество препарата № 5: увеличение количества отделяемого, меньше раздражения конъюнктивы и прокрашивания поверхности роговицы, отсутствие патологических изменений стромы роговицы. Во всех группах преобладает обильное слизистое отделяемое.
Таким образом, введение препарата № 5 в дозе 0,05 мл/кг в разведении 1:15 СФР в конъюнкти-вальную полость обоих глаз 2 раза в день в течение 2 суток уже оказывает положительное влияние, в основном строма сохраняется прозрачной.
Введение актовегинового геля не оказывает фармакологического действия, размеры серозной дегенерации роговицы не уменьшаются.
30-е сутки лечения. В группах с СФР, АГ и препаратом № 5 отделяемое отсутствовало у 8,0%, 54,0% и 80,5% глаз соответственно.
Полностью прозрачная строма роговицы отмечена в группе с препаратом № 5, в то время как в группах с СФР и АГ она составляла от 1 до 3 баллов.
Серозная дегенерация роговицы остается в группе с СФР, где продолжает сохраняться распространенная кератопатия.
В группе с препаратом № 5 просматривается стабильный период состояния всех параметров исследования: почти отсутствует слизистое отделяемое, одновременно с этим снизилась опалес-ценция роговицы.
Морфологические исследования на 30 сутки лечения препаратами ССГ у кроликов подтверждают результаты, полученные при клиническом наблюдении.
Заключение. На модели синдрома сухого глаза у кроликов показано, что препарат № 5 в дозе
сз о
о Л о
о сз о в
0.05 мл/кг в разведении 1:15 СФР при инстилля-ции в оба глаза животным 2 раза в день в течение 30 суток оказывает сильное противовоспалительное, ранозаживляющее и ангиопротекторное действие, положительно влияя на течение репаратив-ного процесса в конъюнктиве, роговице, осложненных состоянием не смыкания век.
Установлено также, что препарат № 5 в испытанной дозе способствует стимуляции репаратив-ных процессов в конъюнктиве, роговице, клинически проявляясь в ускорении восстановления дефектов переднего эпителия и стромы роговицы, в уменьшении частоты образования глубоких дефектов роговицы, снижения выраженности воспалительной реакции и васкуляризации. Отмечается замедление формирования помутнения роговицы, уменьшение количества и появление более жидкого слизистого отделяемого конъюнктивы по сравнению с контролем.
На основании морфологических исследований показано положительное влияние препарата № 5 в испытанной дозе. Препарат не допускает развития тяжелых изменений и устраняет симптомы со стороны поверхностного эпителия, стромы роговицы, передней и задней камер глаза, сосудистой оболочки и сетчатки при ССГ. Препарат № 5 восстанавливает поверхностный эпителий и бокаловидные клетки конъюнктивы, получившие повреждения в результате развития ССГ.
В результате проведенных сравнительных исследований на модели ССГ установлено также, что 20% актовегиновый глазной гель при закладывании по 1 капле из тубы животным в оба глаза 2 раза в день в течение 30 суток не обеспечивает должной защиты, как поверхностных, так и глубоких структур глазного яблока при отсутствии смыкания глазной щели из-за воспалительного процесса. Поражение поверхностного эпителия роговицы связано с исчезновением бокаловидных клеток роговицы в количестве не достаточном для нормального выделения слезы на поверхность глаза. Возникший при этом воспалительный процесс затрагивает почти все структуры глазного яблока, что свидетельствует об отсутствии терапевтического эффекта актовегинового геля для устранения вызванных повреждений.
Литература
1. Гончарова, Т.А. Энциклопедия лекарственных растений: в 2 т. - М.: Изд-во Дом МСП, 2004. -Т. 1. - С. 159-161.
2. Мазнев, Н.И. Лекарственные растения. - М.: ООО ИКТЦ «ЛАДА», 2006. - С. 218-230.
3. Миронов, А.Н., Бунатян, Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К. -2012. - 944 с
4. Муравьева, Д.А, Самылина, И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 2002 - С. 246.
5. Путырский, И.Н., Прохоров, В.Н. Лекарственные растения. Энциклопедия / И.Н. Путырский,
B.Н. Прохоров. - Мн.: Книжный дом, 2003. -
C. 77-81.
STUDY OF THE EFFECTIVENESS OF PLETNEV DROPS NO. 5 (DRUG NO. 5) ON A MODEL OF DRY EYE SYNDROME IN RABBITS
Pletnev V.V.
National medical research center of cardiology of the Ministry of health of the Russian Federation
On the model of dry eye syndrome in rabbits, it is shown that the drug No. 5 at a dose of 0.05 ml/kg in 1:15 dilution with sterile saline solution when instilled into both eyes of animals 2 times a day for 30 days has a strong anti-inflammatory, wound-healing and angio-protective effects, positively affecting the course of the reparative process in the conjunctiva, cornea, complicated by the condition of non-closing of the eyelids. It was also found that the drug No. 5 in the tested dose promotes the stimulation of reparative processes in the conjunctiva, cornea, clinically manifesting itself in accelerating the recovery of defects in the anterior epithelium and corneal stro-ma, in reducing the frequency of formation of deep corneal defects, reducing the severity of inflammatory response and vascularization. There is a slowdown in the formation of corneal opacities, a decrease in the amount and appearance of a more liquid mucous discharge of the conjunctiva compared to the control. Based on morphological studies, the positive effect of the drug No. 5 in the tested dose is shown. The drug does not allow the development of severe changes and eliminates symptoms from the surface epithelium, corneal stroma, anterior and posterior chambers of the eye, vasculature and retina in dry eye syndrome. Drug No. 5 restores the surface epithelium and goblet cells of the conjunctiva, damaged as a result of the development of dry eye syndrome.
Keywords: dry eye syndrome, Pletnev drops No. 5, doctor Pletnev. References
1. Goncharova, T.A. Encyclopedia of medicinal plants: in 2 vols. -Moscow: publishing House of MSP, 2004. - Vol. 1. - P. 159161.
2. Maznev, N.I. Medicinal plants. - Moscow: LLC ICTC "LADA", 2006. - Pp. 218-230.
3. Mironov, A.N., Bunatyan, N.D., and others. Guidelines for conducting preclinical research of medicinal products. - M.: Grif and K.-2012. - 944 p.
4. Muraveva, D.A, Samylina, I.A., Yakovlev, G.P. Pharmacognosy. - Moscow: Meditsina, 2002. P. 246.
5. Putyrsky, I.N., Prokhorov, V.N. Medicinal plants. Encyclopedia / I.N. Putyrsky, V.N. Prokhorov. - Mn.: Book house, 2003. -P. 77-81.
e
u
CM CO
