Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 582.998.2 : 547.587

ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ВАСИЛЬКА ШЕРОХОВАТОГО

© М. С. Ларькина , Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова

Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, 634050 (Россия) Е-mail: [email protected]

Методом хроматографии на бумаге в 40 и 70% этанольных экстрактах из надземной части василька шероховатого обнаружены кофейная, феруловая, хлорогеновая, п-кумаровая, коричная и салициловая кислоты.

Определение содержания фенолкарбоновых кислот (ФКК) в экстрактах проведено двумя методами: 1) прямым спектрофотометрическим и 2) экстракционно-спектрофотометрическим. Установлено, что максимальное количество ФКК извлекается 70% этанолом. Содержание ФКК в надземной части василька шероховатого (экстрагент - 70% этанол) в пересчете на кофейную кислоту составляет 4,9±0,5% - прямым спектрофотометрическим методом и 1,6±0,5% - экстракционно-спектрофотометрическим.

Прослежена динамика накопления ФКК в надземной части василька шероховатого, произрастающего в Томской и Кемеровской областях, в течение вегетационного периода 2006 г. экстракционно-спектрофотометрическим методом. Максимальное накопление ФКК наблюдается в период массового цветения (1,67±0,04% - в надземной части и несколько больше в листьях - 1,83±0,04%). Оптимальным сроком сбора надземной части растения для получения наибольшего количества ФКК является фаза массового цветения.

Ключевые слова: Centaurea scabiosa, экстракционно-спектрофотометрический метод, фенолкарбоновые кислоты. Введение

Василёк шероховатый (Centaurea scabiosa L.) является ярким представителем рода Centaurea сем. Asteraceae, насчитывающего более 80 видов на территории стран СНГ. Это многолетнее травянистое растение широко распространено в европейской части России, на Кавказе, в Западном Казахстане, в Западной и Восточной Сибири, растет в степной и лесной зонах по пойменным, суходольным лугам, залежам, окраинам полей, луговым склонам, разреженным лесам и их опушкам, по сосновым борам.

Василёк шероховатый находит широкое применение в народной медицине в качестве седативного, противовоспалительного, диуретического, вяжущего средства, используется при гепатите, аллергических дерматитах, фурункулах [1]. Очевидно, что столь широкое и разнообразное применение василька шероховатого в народной медицине объясняется богатством его химического состава. В литературе имеются сведения о содержании в растении алкалоидов, поли-ацетиленовых соединений, стероидов, сесквитерпеноидов (гроссгемин, скабиолид), фенолкарбоновых кислот (хлорогеновая, кофейная), кумаринов, флавоноидов (байкалеин, рутин, апиин, скутеллареин и его глюкуронид), антоцианов, дубильных веществ. В ходе исследования на кафедре фармацевтической химии СибГМУ г. Томска установлено наличие в надземной части василька шероховатого флавоноидов: рутина, байкалеина, апигенина (1,5-2,0% в пересчете на рутин), фенолкарбоновых кислот, полисахаридов (10-15% в пересчете на глюкозу) и сесквитерпеновых лактонов (гроссгемин, цинаропикрин) [1-3].

Сведений о количественном содержании фенолкарбоновых кислот в данном растении нами в литературе не обнаружено.

Цель настоящей работы - исследование динамики накопления фенолкарбоновых кислот в различных органах данного растения в зависимости от фазы развития и места сбора сырья.

* Автор, с которым следует вести переписку.

Экспериментальная часть.

Объектом исследования служила надземная часть василька шероховатого, заготовленная в различных районах Кемеровской и Томской областей в 2004-2006 гг. в фазах: вегетации, бутонизации, массового цветения и плодоношения. Растения разделяли на органы и высушивали до воздушно-сухого состояния. Экстракты получали при нагревании до 80 °С на водяной бане с использованием в качестве экстрагента 40 и 70% этанола.

Качественный состав ФКК анализировали с применением метода хроматографии на бумаге, используя достоверные образцы веществ-свидетелей, в системах 1-5% уксусной кислоты. Обнаружение веществ проводили в фильтрованном УФ-свете до и после обработки хроматограмм 5% этанольным раствором калия гидроксида и диазореактивом в видимом свете при нагревании.

Так как в надземной части василька шероховатого присутствуют флавоноиды, поглощающие электромагнитное излучение в близкой ФКК области длин волн, мы провели количественное определение ФКК в полученных экстрактах двумя методами: 1) спектрофотометрическое определение суммы ФКК по собственному поглощению в УФ-области и 2) экстракционно-спектрофотометрический метод определения суммы ФКК в присутствии флавоноидов [4-6].

Методика определения фенолкарбоновых кислот прямым спектрофотометрическим методом. 1,0 г измельченного сырья (точная масса) помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 20 мл экстрагента, присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин с момента закипания экстрагента в колбе. Экстракцию повторяют дважды в описанных выше условиях. После охлаждения полученные извлечения фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объём экстрагентом до метки (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл фильтрата и доводят объём раствора соответствующим экстрагентом до метки (раствор Б).

Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 325 нм. В качестве раствора сравнения используют соответствующий растворитель.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту и воздушно-сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

Б ■ 50-100-100

X _-----------------,

т ■ 782 ■ (100 - W)

где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья ( влажность), %; 782 - удельный показатель поглощения кофейной кислоты при 325 нм.

Для выбора стандарта в данных методах были сняты спектры поглощения кофейной кислоты и этаноль-ных экстрактов василька шероховатого в УФ-области спектра в одних и тех же условиях: оба спектра имеют максимумы поглощения при длине волны 325 нм.

Методика определения фенолкарбоновых кислот экстракционно-спектрофотометрическим методом. 1,0 г измельченного сырья (точная масса) помещают в колбу вместимостью 250 мл со шлифом, приливают 20 мл 70% этанола, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания этанола в колбе. Экстракцию повторяют трижды в описанных выше условиях. После охлаждения полученные извлечения фильтруют через бумажный фильтр и упаривают до 20 мл водного остатка. Остаток переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят буферным раствором (pH 2,0±0,1) до метки - раствор А.

10 мл раствора А экстрагируют в делительной воронке 10 мл этилацетата (4 раза). Этилацетатное извлечение фильтруют через безводный натрия сульфат в мерную колбу на 50 мл и доводят этилацетатом до метки (раствор Б). 5 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят этилацетатом до метки.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 325 нм на спектрофотометре и рассчитывают количественное содержание суммы фенолкарбоновых кислот в % по формуле:

„_ Б ■ 50 ■ 50 ■ 50-100

X _--------------------,

782 ■ т ■ 5 ■ (100 - W)

где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья ( влажность), %; 782 - удельный показатель поглощения кофейной кислоты при 325 нм.

Примечание: буферный раствор с pH 2,0±0,1 готовили следующим образом. 2,48 борной кислоты растворяли в мерной колбе (вместимостью 1 л) в 500 мл дистиллированной воды при нагревании, охлаждали и прибавляли 2,6 мл концентрированной ортофосфорной кислоты и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты, доводили дистиллированной водой до метки, перемешивали.

Обсуждение результатов

Хроматографическое изучение экстрактов василька шероховатого в сравнении с достоверными образцами веществ-свидетелей показало присутствие в них кофейной, феруловой, и-кумаровой, коричной, хлорогеновой и салициловой кислот. Причем доминирующей фенолкарбоновой кислотой является кофейная кислота.

Определение количественного содержания ФКК в 40 и 70% этанольных экстрактах из надземной части василька шероховатого проведено двумя методами. При этом было установлено, что максимальное количество ФКК извлекается 70% этанолом. Содержание ФКК в надземной части василька шероховатого (экстрагент - 70% этанол) в пересчёте на кофейную кислоту составило 4,9±0,5% - прямым спектрофотометрическим методом и 1,6±0,5% - экстракционно-спектрофотометрическим методом.

Сущность второй методики, разработанной В.М. Косман и И.Г. Зенкевичем [5], заключается в избирательной экстракции одной из групп указанных веществ органическим растворителем при определенном значении pH водного слоя, при котором одна группа соединений находится преимущественно в протонирован-ной форме, лучше растворимой в органическом экстрагенте, а вторая - в виде солей, лучше растворимых в воде. Авторами работы установлено, что при pH 2,0±0,1 кофейная кислота на 93-94% переходит в слой органического растворителя, тогда как рутин приблизительно на 85% остается в водном слое. Указанные условия признаны оптимальными для разделения соединений этих групп.

Принципиальным недостатком первого метода являются невысокая избирательность и точность, так как в данной области спектра могут поглощать и другие группы веществ, в частности, флавоноиды, что приводит к завышенным данным по содержанию ФКК.

Полученные данные позволяют сделать вывод о рациональности количественного определения суммы ФКК в надземной части василька шероховатого экстракционно-спектрофотометрическим методом.

Этот метод был использован для изучения динамики накопления ФКК в надземной части василька шероховатого, произрастающего на территориях Томской и Кемеровской областей в течение вегетационного периода 2006 г. Из данных, представленных на рисунке 1, следует, что максимальное содержание ФКК наблюдается в период массового цветения растения (1,67±0,04%), что характерно для большинства представителей семейства астровых. На основании полученных результатов можно рекомендовать заготовку надземной части василька шероховатого в фазе массового цветения.

Изучение содержания ФКК в различных органах надземной части василька шероховатого, собранной в фазе цветения, показало, что максимальное содержание веществ наблюдается в листьях (1,83±0,04%), несколько ниже - во всей надземной части (рис. 2).

Рис. 1. Сезонная динамика содержания ФКК в зависимости от фазы развития надземной части василька шероховатого (1 - фаза вегетации; 2 - фаза бутонизации; 3 - фаза массового цветения; 4 - фаза плодоношения)

Рис. 2. Содержание ФФК в различных органах надземной части василька шероховатого, собранной в фазе массового цветения (1 - листья; 2 - надземная часть;

3 - цветочные корзинки; 4 - стебли)

Чтобы расширить представление о содержании ФКК в объекте нашего исследования, было проведено определение их в надземной части василька шероховатого из 9 мест произрастания (табл. 1) и в зависимости от года сбора сырья (место сбора - с. Заварзино Томского района) - с 2003 по 2007 г. (табл. 2). Содержание ФКК колеблется в интервале - от 1,3 до 2,0%, что свидетельствует о незначительном различии в содержании этой группы веществ в васильке шероховатом, произрастающем на территориях Томской и Кемеровской областей. Однако содержание ФКК в сырье, собранном в одном месте, в течение двух последних лет стабильно, а при хранении более двух лет - резко уменьшается (табл. 2).

Таблица 1. Определение содержания ФКК в надземной части василька шероховатого в зависимости от места произрастания растения (2006-2007 гг.)

№, п/п Место сбора Содержание ФКК в пересчете на кофейную кислоту, %

1 с. Заварзино, Томская обл. (луг у леса) 1,50±0,04

2 с. Петрово, Томская обл. (опушка леса) 1,80±0,04

3 с. Межениновка, Томская обл. (опушка леса) 1.82±0,05

4 г. Калтан, Кемеровская обл. (луг у соснового леса) 2,18±0,03

5 Новобалохоновка, Кемеровская обл. (луг у осинового леса) 1,36±0,04

6 с. Новотроицк, Томская обл. (березовый лес) 1,67±0,04

7 с. Нащеково, Шегарский район Томской области (луг у леса) 2,14±0,05

8 с. Уртам, Шегарский район Томской области (опушка леса) 1,34±0,04

9 Лагерный сад, окрестности г. Томска 1,38±0,04

Таблица 2. Определение содержания ФКК в надземной части василька шероховатого в зависимости от года сбора растения (место сбора - с. Заварзино, Томский район)

№, п/п Год сбора Срок хранения сырья до определения содержания ФКК Содержание ФКК в пересчете на кофейную кислоту, %

1 2003 4 года 0,55±0,04

2 2004 3 года 0,74±0,05

3 2005 2 года 0,87±0,05

4 2006 1 год 1,49±0,04

5 2007 три месяца 1,67±0,04

Выводы

Проведенные исследования позволили оценить содержание ФКК в надземной части василька шероховатого, рекомендовав оптимальный срок сбора растения - фазу массового цветения для получения наибольшего количества данной группы БАВ.

Список литературы

1. Федорова А. А. Растительные ресурсы СССР : цветковые растения, их химический состав, использование; семейство Asteraceae. Л., 1987. 326 с.

2. Каминский И.П., Кадырова Т.В., Краснов Е.А., Ивасенко С.А., Адекенов С.М. Сесквитерпеновые лактоны василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: матер. II межд. науч. конф. Алматы, 2007. С. 194.

3. Алексеюк Н.В., Поздняков Е.Г. Изучение химического состава василька шероховатого // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. 1986. С. 12.

4. Запорожец О.А., Крушинская Е.А., Барвинченко В.Н. Спектрофотометрическое определение гидроксикорич-ной кислоты и ее производных в препаратах эхинацеи // Хим.-фармац. журнал. 2003. Т. 37. №12. С. 11-13.

5. Косман В.М., Зенкевич И.Г. Количественное экстрационно-спектрофотометрическое определение суммарного содержания гидроксикоричных кислот в присутствии флавоноидов в экстрактивных веществах некоторых лекарственных растений // Растительные ресурсы. 2001. №4. С.123-129.

6. Куркин В.А., Авдеева О.И., Авлеева Е.В., Мизина П.Г. Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в надземной части Echinacea purpurea (L.) Moench // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34, вып. 2. С. 81-85.

Потупило вредакицю 5 марта 2008 г.

После переработки 13 мая 2008 г.