CC BY
21
6. Cherekaev A.V. How to develop beef cattle breeding // Zootechny. - 2008. - No. 9. - P. 2-6.
7. Mysik A.T. On the development of livestock in the USSR, the RSFSR, the Russian Federation and countries of the world // Zoo-techn. - 2013. - No. 1. - P. 2-6.
8. Manshin AA, Kibkalo LI Exterior features and productive indicators of purebred and cross-breed animals // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2017. - No. 2. - P. 24-29.
9. Kibkalo L.I., Galkina L.M. Perfection of the technology of beef production // Milk and meat cattle breeding. - 1998. - № 5. - P. 12-13.
УДК 619:616.9-036.22;619:616.9
ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ У МОРСКИХ СВИНОК ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ ОПОСРЕДОВАННОЙ НИЗКО ВИРУЛЕНТНЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru.
Реферат. Туберкулёз животных является общей проблемой ветеринарии и медицины. Так, например, возбудитель туберкулёза бычьего вида является зоонозным для разных видов животных и человека нанося большой экономический ущерб. Методы борьбы с туберкулёзной инфекцией основаны на изучении патогенетических механизмов. Изучение патогенеза туберкулёзной инфекции осуществляется на лабораторных моделях, среди которых наиболее используемой являются морские свинки, инфицированные микобактериями. Туберкулёзный процесс определяется степенью патогенности микроорганизма. Так высоко вирулентные возбудители используются при изучении процессов диссеминации. В то время как для изучения начальных этапов туберкулёзной инфекции целесообразно осуществлять при использовании низко вирулентных микобактерий. Одним из вариантов низко вирулентных микобактерий является штамм M. bovis БЦЖ, мутантный по RD-1 региону. Целью исследования было: изучение параметров крови морских свинок при моделировании туберкулёзной инфекции, постановки теста ПЧЗТ и определение корреляционной взаимосвязи между параметрами крови и кожной туберкулиновой реакцией ПЧЗТ. В результате проведенных исследований было определено достоверное повышение нейтрофилов, моноцитов, эози-нофилов и снижение тромбоцитов, лимфоцитов, через месяц после введения морским свинкам живых микобакте-рий M. bovis штамм БЦЖ. Показано, что после постановки туберкулинового теста в крови регистрируется достоверное увеличение количества эозинофилов и снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов. Выявлено, что интенсивность кожной туберкулиновой реакции ПЧЗТ характеризуется достоверной положительной зависимостью с содержанием сегментоядерных нейтрофилов и отрицательной - с содержанием лимфоцитов. Таким образом, модель туберкулёзной инфекции, предполагающей использование низко вирулентных микобактерий M. Bovis, характеризуется развитием первых стадий классического туберкулёзного процесса.
Ключевые слова: морские свинки, микобактерии, аллергический тест, анализ крови.
HEMATHOLOGICAL DYNAMICS CHANGES STUDYING OF GUINEA PIGS MODELLING LOW VIRULENT OF MYCOBACTERIUM A TUBERCULAR INFECTION
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru.
Essay. The tuberculosis of animals is a widespread problem in veterinary medicine science. Bovine tuberculosis (BT) is common disease in cattle and wildlife, with animal health, zoonotic and economic impact. Methods of a tubercular infection prevention are based on pathogenetic mechanisms studying. Pathogenic studying of a tubercular infection is carried out on laboratory models using of mycobacteriums infected guinea pigs mostly. Current tubercular process defined with the virulent activator. So highly virulent activators are used in dissemination processes studying. Studying of the initial stages of tubercular infection is expedient to carry out at use low virulent of mycobacterums. One of the least used low virulent mycobacterums is strain M. bovis BCG, mutant on RD-1 to region. The purpose of research was: parameters studying of guinea pigs blood modelling a tubercular infection, statement of DTH (delayed-type hypersensitivity) test and the definition of interrelation correlation of blood parameters and tuberculin skin reaction DTH. In a month after guinea pigs alive mycobacterium M. bovis injection the strain BCG as determined as a result of these researches is an authentic increasing neutrophils, monocytes, eosinophils and a decreasing platelets, lymphocytes. We see that after tuberculin test statement in blood the quantity of eosinophils and has increased leukocytes number has decreased and platelets have registered. It has revealed, that intensity skin tuberculin reactions DTH are characterized by authentic positive dependence with neutrophils and negative with lymphocytes. So, the tubercular infection model with low virulent mycobacterium M. bovis is characterized by development of classical tubercular process on the first stage.
Key words: guinea pigs, mutant mycobacterium, skin testing with tuberculin purified protein, hematological the analysis.
Введение. Туберкулёз животных является общей проблемой как ветеринарии так и медицины. Исследования патогенетических механизмов развития туберкулёзного процесса являются основой в разработке средств и методов борьбы с заболеванием. В свою очередь изучение патогенеза туберкулёзной инфекции осуществляется на лабораторных моделях, среди которых наиболее используемой являются морские свинки, инфицированные микобактериями [2, 8].
При этом интенсивность течения инфекционного процесса, обусловленного микобактериями, напрямую определяется несколькими факторами, основным из которых является вирулентность возбудителя. Так использование высоко вирулентного возбудителя целесообразно для получения диссеминационного варианта [2, 12], в то время как изучение начальных этапов туберкулёзной инфекции целесообразно осуществлять при использовании низко вирулентных микобактерий. Вариантом низко вирулентных микобактерий является штамм M. bovis БЦЖ, мутантный по RD-1 региону [4].
Известно, что коммуникационные взаимоотношения между системами организма животных обуславливают клеточные элементы крови, баланс которых изменяется даже в начальных стадиях различных патологических процессов как инфекционной, так и незаразной природы [1,6], что позволяет оценивать стадии туберкулёзного процесса по картине крови.
Принимая во внимание вышеизложенное целью исследования было: определение в динамике изменений параметров крови морских свинок при моделировании низко интенсивной туберкулёзной инфекции и определение корреляционной взаимосвязи между параметрами крови и кожной туберкулиновой реакцией ПЧЗТ.
Материал и методика исследования. В работе использовали микобактерии M. bovis БЦЖ, мутантные по RD-1 региону. Микобактерии культивировали на картофельной среде Павловского в течение 25 суток, при температуре 37°С, после чего приготавливали суспензии на физиологическом растворе. Морских свинок
инфицировали внутрикожно M. bovis в дозе 0,2 мг/ 0,1 см . Использование данной дозировки и пути введения микобактерий в организм лабораторных животных было отработано ранее, что обеспечивает низкую интенсивность развития инфекционного процесса [7]. Через 30 дней после инфицирования, животных использовали в опытах.
В исследовании были использованы самки морских свинок массой 400-600 г. Перед опытами морских свинок исследовали на туберкулёз аллергическим способом с применением ППД туберкулина [8].
Автоматическая оценка крови лабораторных животных была проведена аппаратным методом [1]. Также определяли микроскопическим методом лейкоформулу [6].
Интенсивность развития туберкулёзного процесса оценивали аллергической пробой с использованием разведений ППД туберкулина для млекопитающих на фосфатно - буферном растворе (производство ФКП «Курская биофабрика») в дозах 20 и 2 МЕ.
Математический анализ экспериментов проводили, используя стандартизированные подходы. [5].
Результаты исследования. Исследование включало два этапа. Первоначально, по параметрам крови была проведена оценка микобактериальной инфекции у лабораторных животных, которым инъецировали M. bovis. При проведении второго этапа осуществлена оценка корреляционной зависимости между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ на ППД для млекопитающих и параметрами крови.
В работе были использованы 24 морские свинки, распределённых в 3 группы. Первая группа являлась контрольной, инфицирование которой не осуществлялось. Животные второй и третьей группы инъецировали бычьими микобактериями. Параметры крови животных третьей группы оценивали через 24 часа после введения разведений ППД для млекопитающих. Параметры оценки картины крови у морских свинок, инфицированных микобактериями, представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Параметры крови морских свинок до инфицирования, через 30 дней после инфицирования, и после
постановки туберкулинового теста
№ п/п Наименование параметра крови Группа животных
1 (n=8) 1 (n=8) 1 (n=8)
M ± m M ± m M ± m
1 Лейкоциты х 109/л 15,90±1,27 14,56±2,00 13,10±0,72*
2 Эритроциты х1012/л 5,57±0,13 5,91±0,11 5,63±0,25
3 Концентрация гемоглобина, г/ л 143,86±1,43 150,29±2,97 145±5,40
4 Гематокрит, % 43,04±0,76 46,32±0,93 44,19±1,93
5 Средний объём эритроцитов, фл мм3 77,38±0,78 78,29±0,71 78,5±0,57
6 Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг 25,86±0,39 25,41±0,24 25,83±0,30
7 Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, г/л 334,63±2,71 324,43±1,15 328,3±3,64
8 Широта распределения эритроцитов 12,89±0,15 12,99±0,08 13,03±0,18
9 Тромбоциты х109/л 250,0±12,0 200,0±15,0 105,0±10,0*
10 Тромбокрит, % 0,81±0,061 0,65±0,03* 0,44±0,03*
11 Средний объём тромбоцитов, фл мм3 5,83±0,08 5,67±0,11 5,71±0,12
12 Широта распределения тромбоцитов,% 35,56±0,40 34,64±0,33 35,08±0,49
13 Нейтрофилы палочкоядерные, % 0 3,25±0,78 1,13±0,99
14 Нейтрофилы сегметоядерные, % 40,9±6,4 50,75±2,26* 39,5±6,2
15 Моноциты, % 3,13±0,67 5,5±1,41* 4,63±1,34
16 Лимфоциты, % 54,75±6,67 39,88±2,92* 52,63±6,19
17 Эозинофилы, % 1,25±0,37 2,25±0,65* 2,13±0,58*
Примечание: * разница достоверна при р< 0,05.
Оценка параметров изменения картины крови у морских свинок, которым вводили бычьи микобакте-рии, показала отсутствие достоверной разницы содержания лейкоцитов в сравнении с контролем. Вместе с тем, после осуществления аллергического теста с использованием ППД для млекопитающих регистрируется достоверное понижение лейкоцитов. Развернутый анализ клеток белой крови выявил изменение на уровне отдельных популяций. Так на общем фоне снижения лимфоцитов регистрируется увеличение сегментоядер-ных нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов. Кроме того, после развития кожной аллергической реакции на ППД туберкулин, снижается уровень лейкоцитов. Развернутый анализ демонстрирует, что подобное снижение опосредовано сегментоядерными нейтрофилами и лимфоцитами, представляющими совместно с моноцитами клетками воспалительный инфильтрат в месте введения микобактериальных антигенов (ППД для млекопитающих).
Известно, что эозинофилы регулируют патофизиологические процессы при развитии аллергических сдвигов в животном организме. Данные изменения достаточно полно изучены в отношении патологических процессов паразитарной природы, в то время как в отношении развития аллергических изменений при эволюции туберкулезного процесса предполагают проведение дополнительных исследований. Так в представленной работе полученные данные предполагают участие эозинофилов при формировании второго и третьего этапов туберкулёзного процесса.
Изучение содержания тромбоцитов после развития состояния ПЧЗТ не выявило разницы с контролем, в то время как после постановки туберкулинового теста продемонстрировало достоверное их снижение.
Оценка параметров крови лабораторных животных, инфицированных M. Bovis, продемонстрировала отсутствие достоверных изменений после введения микобак-терий, и постановки аллергического теста.
Оценка развития состояния ПЧЗТ аллергической реакции у морских свинок, инфицированных мутант-ными микобактериями бычьего вида, продемонстрировала следующие результаты: при использовании дозы 20 МЕ интенсивность составила 20,17 ± 0,82; при применении дозы 2 МЕ значение кожной реакции соответствовало 15,35 ± 0,45. Полученные результаты свидетельствуют об уровне развития ПЧЗТ, соответствующем интенсивности моделям туберкулёзного процесса с использованием живых патогенных микобактерий [10,11].
Следующим этапом исследования было изучение корреляционной зависимости между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ и параметрами крови. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Корреляционный анализ продемонстрировал отрицательную взаимосвязь (выше показателя r>0,3) между интенсивностью ПЧЗТ и содержанием лейкоцитов, моноцитов, лимфоцитов, средним объёмом тромбоцитов; положительную зависимость интенсивности кожной реакции ПЧЗТ средним содержанием гемоглобина в эритроците, а также средним объёмом эритроцитов. При этом на уровне достоверности р<0,05 выявлена положительная зависимость между интенсивностью кожной реакции и сегментоядерными нейтрофилами, а также лимфоцитами.
В соответствии с общепринятой классической моделью туберкулёзный процесс представлен следующей стадийностью: 1-инфицированием; 2-началом инфекции;
3- развитием иммунной реакции организма; 4- казеацией и ускоренным размножением микобактерий; 5- выделением микобактерий в окружающую среду. Так первый этап соотносится с проникновением в организм микобактерий и фагоцитированием их альвеолярными макрофагами. Второй этап сопровождается репликацией микобактерий в макрофагах, что приводит к их делеции. Происходит приток макрофагов с последующим фагоцитозом свободных микобактериальных клеток, развивается диссеминация патогенна сначала во внутригрудные лимфатические узлы, а затем по всему организму. Третий этап туберкулёзной инфекции сопровождается снижением количества микобактерий, формированием антибактериальной устойчивости, а также развитием состояния ПЧЗТ [3].
Таблица 2 - Корреляционная зависимость интенсивности кожной реакции ПЧЗТ и параметрами крови морских свинок инфицированных M. bovis _
№ п/п Наименование параметра крови r
1 Лейкоциты х 109/л -0,34
2 Эритроциты х 1012/л -0,23
3 Концентрация гемоглобина, г/л -0,1
4 Гематокрит, % -0,08
5 Средний объём эритроцитов, фл мкм3 0,8*
6 Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг. 0,39
7 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л. 0,01
8 Широта распределения популяции эритроцитов, % -0,15
9 Тромбоциты х 109/л 0,12
10 Тромбокрит, % 0,06
11 Средний объём тромбоцитов, фл -0,21
12 Широта распределения популяции тромбоцитов, % -0,33
13 Нейтрофилы палочкоядерные -0,17
14 Нейтрофилы сегментоядерные 0,73*
15 Моноциты -0,32
16 Лимфоциты -0,71*
17 Эозинофилы 0,19
Примечание:* значение достоверно при р<0,05
Результаты, полученные при проведении исследований демонстрируют, что моделирование туберкулёзного процесса с использованием низко вирулентных микобактерий M. bovis, мутантных по RD-1 региону, на морских свинках сопровождается следующими этапами: 1-инфицированием, 2- фагоцитированием тканевыми макрофагами микобактериальных частиц и 3 - развитием состояния ПЧЗТ. Так введение микобактерий в организм морских свинок соотносится с этапом инфицирования (1 этап).
Диссеминация микобактерий в регионарные лимфатические узлы сопряжено с развитием фагоцитарных реакций, образованием в месте введения микобактерий папулы, а также формированием пролиферативных реакций [9], что соответствует второму этапу туберкулёзного процесса. Формирование состояния ПЧЗТ в течение 30 суток выявляемое в кожном тесте с ППД туберкулином для млекопитающих соответствует 3 этапу.
Интенсивность реакции ПЧЗТ на разные дозы ППД для млекопитающих у морских свинок, инфицированных микобактериями бычьего вида штамм БЦЖ, свиде-
тельствует о правильно подобранной дозировке мико-бактерий используемой для моделирования туберкулёзного процесса, соответствующем варианту с использованием вирулентных микобактерий.
Таким образом, при моделировании низко интенсивной туберкулёзной инфекции регистрируется изменение клеток крови. Кроме того, выявлена зависимость между интенсивностью ПЧЗТ и содержанием сегмен-тоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.
Выводы. Показано достоверное повышение сег-ментоядерных нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов и снижение тромбоцитов, лимфоцитов, через месяц после введения морским свинкам живых микобактерий М.
bovis штамм БЦЖ. После постановки туберкулинового теста происходит достоверное увеличение количества эозинофилов и снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов.
Выявлено, что интенсивность кожной туберкулиновой реакции ПЧЗТ характеризуется достоверной положительной зависимостью, с содержанием сегментоя-дерных нейтрофилов и отрицательной - с содержанием лимфоцитов.
Модель туберкулёзной инфекции предполагающей использование низко вирулентных микобактерий M. bovis характеризуется развитием первых стадий классического туберкулёзного процесса.
Список использованных источников
1. Гематологический анализатор Abacus Junior B12. Руководство пользователя. Версия 1.1. - 60 с.
2. Гращенкова О.В., Зыков М.П. Оценка вирулентности микобактерий туберкулёза с помощью внутримозго-вого заражения морских свинок // Проблемы туберкулёза. - 1985. - № 8. - С. 56-59.
3. Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулёз: учебное пособие. - М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2007. - 303 с.
4. Литвинов В.И. Латентная туберкулёзная инфекция - миф или реальность? // Туберкулёз и болезни лёгких. -2011. - № 6. - С. - 3-9.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа. - 1990. - С 50-51.
6. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики / И.П. Кондрахин, А.В. Архипов, В.И. Левченко и др. - М.: Колос, 2004. - С. 52-55.
7. Мясоедов Ю.М., Морозов С.В. Оптимизация теста определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - № 9. - С. 7174.
8. Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002. - 63 с.
9. Шепелькова Г.С., Евстифеев В.В., Апт А.С. Исследование молекулярных механизмов патогенеза туберкулёза на экспериментальных моделях // Туберкулез и болезни лёгких. - 2012. - № 7. - С. 3-11.
10. Frank J.T., Griffin, Colin G. Mackintosh, Glenn S. Buchan. Animal models of protective immunity in tuberculosis to evaluate candidate vaccines // Trends in Microbiology. - 1995. - № 11.Vol. 3.
11. John B. Kaneene, Charlos O. Thoen. Tuberculosis // Vet. Med. Today: Zoonosis Update. JAVMA. - 2004. - № 5. -P. 685-691.
12. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - Paris, 2010.
List of sources used
1. Haematological analyzer Abacus Junior B12. User guide. Version 1.1. - 60 р.
2. Graschenkova O.V, Zykov MP Evaluation of the virulence of mycobacterium tuberculosis with intracerebral infection of guinea pigs. // Problems of tuberculosis. - 1985. - No. 8. - P. 56-59.
3. Koshechkin V.A., Ivanova Z.A. Tuberculosis: a study guide. - Moscow: GEOTAR-Media, 2007. - 303 p.
4. Litvinov V.I. Is latent tuberculosis infection a myth or a reality? // Tuberculosis and lung diseases. - 2011. - No. 6. -S. - 3-9.
5. Lakin G.F. Biometrics. - M.: High school. - 1990. - From 50-51.
6. Methods of veterinary clinical laboratory diagnostics // I.P. Kondrakhin, A.V. Arkhipov, V.I. Levchenko et al. -Moscow: Kolos, 2004. - P. 52-55.
7. Myasoyedov Yu.M., Morozov S.V. Optimization of the test for determining the biological activity of PPD tuberculin for mammals // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2012. - No. 9. - P. 71-74.
8. Manual on the diagnosis of tuberculosis of animals. - M., 2002. - 63 p.
9. Shepelkova G.S., Evstifeev V.V., Apt A.S. Investigation of molecular mechanisms of tuberculosis pathogenesis in experimental models // Tuberculosis and lung diseases. - 2012. - No. 7. - P. 3-11.
10. Frank J.T., Griffin, Colin G. Mackintosh, Glenn S. Buchan. Animal models of protective immunity in tuberculosis to evaluate candidate vaccines // Trends in Microbiology. - 1995. - No. 11.Vol. 3.
11. John B. Kaneene, Charlos O. Thoen. Tuberculosis // Vet. Med. Today: Zoonosis Update. JAVMA. - 2004. - No. 5. - P. 685-691.
12. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - Paris, 2010.
