CC BY
1Шалбуев Дм.В., канд. техн. наук., доцент Научное направление: Переработка кожевенно-мехового сырья, охрана
окружающей среды Славгородская М.В., канд. хим. наук Научное направление: Переработка кожевенно-мехового сырья, охрана
окружающей среды Сячинова Н.В., канд. техн. н., старший преподаватель Научное направление: Переработка кожевенно-мехового сырья, охрана
окружающей среды Восточно-Сибирский государственный технологический университет
УДК 577.125.2
ИЗУЧЕНИЕ ДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ МЕТОДОМ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ТИТРОВАНИЯ
Изучен механизм деструкции жировых веществ различной химической природы прокариотическими культурами Pseudomonas sp и Bacillus licheniformis, выделенных из сточных вод после процесса эмульсионного обезжиривания овчинно-шубного сырья. Показано, что жирные кислоты, образующиеся в результате деструкции жиров культурами Pseudomonas sp и Bacillus licheniformis, окисляются различными ферментами, продуцируемыми данными культурами, с последующим вовлечением их в цикл трикарбоновых кислот. Деструкция сопровождается уменьшением длины углеводородной цепочки и образованием более сильных кислот.
Ключевые слова: овчинно-шубное сырье, сточные воды, эмульсионное обезжиривание, деструкция жиров.
STUDYING OF FATS DESTRUCTION BY potentiometric titration METHOD
Shalbuev D.V., Slavgorodskaya M.V., Syachinova N.V.
The mechanism of fatty substances destruction of the various chemical nature prokaryotic organisms by cultures Pseudomonas sp and Bacillus licheniformis, allocated of sewage water after process emulsion degreasing sheep raw materials is studied. It is shown, that the fat acids formed as a destruction result offats by cultures Pseudomonas sp and Bacillus licheniformis, are oxidised the various enzymes produced by given cultures, with their subsequent involving in a cycle tricarboxylic acids. The destrucruint is accompanied by reduction of length of a hydrocarbonic chain and formation of stronger acids.
Жиры широко распространены в природе и варьируют по своему составу. Они представляют собой смесь разнообразных по составу органических веществ. В натуральных жирах содержится около 95-97% глицеридов жирных кислот, а после рафинации содержание их повышается до 98,5-99,5%. В состав смеси входит также некоторое количество сопутствующих веществ - фосфатидов, стеринов, восков, продуктов гидролиза глицеридов и др. [1]. Жиры входят в состав животных и растительных организмов. У растений жир содержится главным образом в семенах [2]. У животных жир сосредоточивается, в первую очередь, на внутренних органах и в подкожной клетчатке, особенно в брюшной полости, у молодняка его больше между мышцами. У морских животных и рыб много жира находится в печени [3].
Химический состав жира различных животных различается даже в пределах одного организма и зависит от места отложения и глубины залегания в жировом слое. Для жиров наземных животных характерна, как правило, твердая консистенция, обусловленная высоким содержанием глицеридов насыщенных жирных кислот, таких, как пальмитиновая и стеариновая, а также малонасыщенной олеиновой. Жиры наземных животных характеризуются относительно небольшим йодным числом. Характерной особенностью жиров морских млекопитающих и рыб является наличие в них глицеридов многоненасыщенных жирных кислот с четырьмя, пятью и шестью двойными связями. В связи с высоким содержанием многоненасыщенных жирных кислот в составе жиров морских животных данные продукты характеризуются высоким йодным числом и, как следствие, жидкой консистенцией. Жиры морских организмов представляют собой смесь моно-, ди- и триацилглицеринов и содержат относительно
небольшое количество так называемых сопутствующих жирам веществ. К их числу относят: стерины, фосфолипиды, красящие вещества жиров, витамины, а также ксантофиллы [4].
Жиры играют важную физиологическую и биохимическую роль в живых организмах, являются одними из основных продуктов питания. Служат основным сырьем для жиропере-рабатывающей промышленности в производстве мыла, олифы, глицерина, используются в качестве добавок к лекарственным средствам, для строительных растворов, бетона, широко используются в кожевенной и меховой промышленности.
В процессе переработки жировые вещества частично поступают со сточными водами в природные водные объекты, вызывая изменения физических свойств воды (вкус, запах, цвет, прозрачность). Поступая в водоем жиры создают благоприятную среду для развития патогенных бактерий, грибков. Кроме того, наличие в сточных водах жировых веществ в больших концентрациях создает трудности в эксплуатации канализационных систем и дальнейшей очистке сточных вод на специальных сооружениях [5].
Одним из методов очистки сточных вод в кожевенно-меховой промышленности, содержащих жировые вещества в результате химической и механической обработки при производстве, является их деструкция с помощью микроорганизмов-деструкторов. Объектами исследования служили жиры нерпичий, сульфатированный рыбий, шерстный, свиной и Tanning Oil G, подвергшиеся обработке культурами Pseudomonas sp. и Bacillus licheniformis, выделенными из сточных вод после процесса эмульсионного обезжиривания. Степень деструкции жировых материалов микроорганизмами исследовалась методом потенциометрического титрования, основанным на исследовании взаимодействия веществ с протонами сильной кислоты (HCl).
Методом газовой хроматографии было определено, что исследуемые жиры - нерпичий, свиной, сульфатированный рыбий, шерстный и Tanning Oil G - могут содержать преимущественно олеиновую, пальмитиновую и изомер пальмитиновой кислоты. Кроме того, в них могут содержаться незначительные количества кислот: линолевой, миристино-вой, пальмитолеиновой, арахидоновой [6].
Кривые титрования позволяют: определить число связывающихся протонов омыленными жирами; изучить влияние щелочей на ионизацию эфирных групп жира; оценить глубину и специфичность реакций жиров с микроорганизмами; количественно определить деструкцию жиров. Число связанных протонов определяется по разности между общим числом добавленных ионов водорода и числом свободных ионов в растворе.
Для изучения деструкции жира микроорганизмами предварительно были приготовлены бактериальные суспензии на основе жидкой синтетической среды, содержащей 1 г жира, объемом 200 см каждая. Минеральная компонента среды Рана включала, г/дм3: K2HPO4- 5,0; (NH4)3PO4 - 5,0; KCl - следы; CaCh - 1,0; MgSO4*7^O - 1,0; FeCbx7H2O - следы. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате марки (ТС-80М-2) при температуре 37±0,5°С, осуществляя переменное механическое воздействие, на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки от 0 до 48 ч. Проведенные исследования показали, что оптимальное время деструкции жиров составляет 48 ч. После чего проводили щелочной гидролиз жиров. Полученную пробу титровали 0,1 н раствором соляной кислоты на приборе рН-метр «Анион 7051» при температуре 20,6°С. Параллельно проводили титрование контрольной пробы, в качестве стандарта использовали жиры, не подвергавшиеся деструкции микроорганизмами.
При титровании соли жирной кислоты (полученной при омылении жира) 0,1 н раствором соляной кислоты происходит реакция обмена с образованием жирной кислоты и соли:
RCOONa + HCl ^ RCOOH + NaCl.
Кривая титрования омыленного жира характеризуется нейтрализацией избытка щелочи. Первой вступает в реакцию соль более слабой кислоты, так как полнее идет ее гидролиз. После полной нейтрализации соли слабой кислоты в реакцию вступает натриевая соль более сильной кислоты. В результате нейтрализации образуются жирные кислоты, нерастворимые в воде, что сопровождается помутнением раствора.
5
а
12
11
10
.......\ .......„
:— * * .............. '''Wnrni...... \
•Ч ^—. . V
\ Ч N 4...... ..................................................
\ \ Ч ............. ........k
\ ч \ .....*. .............*..............
*1 ......... ......... .......к» .................- .
\ \
\ 1
*
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
7 _ 7,5 V, см3, HCl
- - сульфатированный рыбий жир нерпичий жир
-шерстный жир
— — свиной жир
- - - ■ Tanning Oil G
Рис. 1. Кривые титрования омыленных жиров после деструкции микроорганизмом Pseudomonas sp.
Кривые титрования полученных гидролизатов характеризуются наличием нескольких изгибов, соответствующих числу карбоксильных групп образовавшихся кислот (рис.1). Это свидетельствует о том, что происходит расщепление молекулы жирной кислоты микроорганизмом Pseudomonas sp., уменьшение длины углеродной цепи, т.е. увеличение силы образовавшейся кислоты, смещение кривой титрования в область меньших значений рН и появление новых скачков. Культура рода Pseudomonas sp. различным образом действует на жиры (рис. 1). Более полная утилизация происходит шерстного и сульфатированного рыбьего жира, а кривые титрования продуктов окисления нерпичьего жира и Tanning Oil G характеризуются большим числом изгибов, что указывает на образование значительного количества карбоксильных групп.
Для определения суммарного содержания связывающихся водородных ионов (в ммоль) на 1г жира проводили серию расчетов. Количество присоединенных протонов эквивалентно числу карбоксильных групп. Расчет количества протонов, вступивших в реакцию с карбоксильной группой кислот, проводился по закону эквивалентов в несколько этапов:
V - количество (в см3) реагента известной концентрацией раствора, добавленное к V см3 дистиллированной воды;
B - объем HCl, который добавлен к V см3 дистиллированной воды 0,1 н раствора
(
C Н X V
х 1000), где СН - нормальная концентрация кислоты, V1 - добавленный объем, V
V + V
начальный объем раствора; C - lgB; D - экспериментальное значение рН; A - строится график
зависимости C от D (находим формулу по линии Тренда);
F - количество (в см3) с известной концентрацией раствора реагента, добавленное к V
см3 раствора жира; G - объем HCl, который добавлен к 100 см3 водного раствора жира 0,1 н
раствора HCl; H - lg G; W - находится по линии Тренда; J - экспериментальное значение
водного раствора жира рН; K- разность значений рН, W-J (рНводы - pH^a); L- антилогарифм
K; M - (1 - L); N - суммарное содержание связанных водородных и гидроксильных ионов (в
лг G хM 1Л m х 1000
ммоль) на 1г жира, рассчитывается по формуле: N =-х 10, где g = ——, где m - на-
g
V + F
веска жира [7].
9
8
7
6
5
4
3
3
4
5
6
Таблица 1
Расчетные значения параметров сульфатированного рыбьего жира, деструктированного культурой
Pseudomonas sp.
V B C D F G H W J K M N
3 8,33 0,92 12,33 3,0 0,057 1,24 3,66 11,52 -7,86 1,0 2,51
3,2 8,84 0,94 12,13 3,2 0,056 1,25 3,66 11,46 -7,80 1,0 2,45
3,4 9,34 0,97 12,11 3,4 0,037 1,43 3,63 11,37 -7,73 1,0 1,64
3,6 9,84 0,99 12,07 3,6 0,036 1,44 3,63 11,23 -7,59 1,0 1,59
3,8 10,32 1,01 12,06 3,8 0,034 1,46 3,63 11,17 -7,54 1,0 1,55
4,0 10,81 1,03 12,03 4,0 0,033 1,48 3,63 10,84 -7,21 1,0 1,50
4,2 11,29 1,05 12,03 4,2 0,032 1,49 3,62 10,63 -7,00 1,0 1,46
4,4 11,76 1,07 12,02 4,4 0,031 1,51 3,62 10,15 -6,52 1,0 1,42
4,6 12,23 1,08 12,00 4,6 0,030 1,52 3,62 8,83 -5,21 0,99 1,38
4,8 12,70 1,10 11,99 4,8 0,029 1,53 3,62 7,58 -3,96 0,99 1,35
5,0 13,16 1,12 11,94 5,0 0,028 1,54 3,62 7,58 -3,96 0,99 1,32
5,1 13,39 1,13 11,94 5,1 0,028 1,55 3,62 7,1 -3,48 0,99 1,30
5,2 13,61 1,13 11,93 5,2 0,027 1,56 3,62 6,88 -3,26 0,99 1,29
5,3 13,84 1,14 11,92 5,3 0,027 1,56 3,62 6,68 -3,06 0,99 1,27
5,5 14,06 1,15 11,91 5,5 0,027 1,57 3,62 6,54 -2,92 0,99 1,26
5,5 14,29 1,15 11,90 5,5 0,026 1,57 3,61 6,32 -2,70 0,99 1,24
5,6 14,51 1,16 11,89 5,6 0,026 1,58 3,61 3,11 -2,49 0,99 1,23
5,7 14,72 1,17 11,89 5,7 0,025 1,58 3,61 5,95 -2,33 0,99 1,21
5,8 14,95 1,17 11,87 5,8 0,025 1,59 3,61 5,66 -2,05 0,98 1,19
5,9 15,17 1,18 11,86 5,9 0,025 1,59 3,61 5,27 -1,66 0,97 1,17
На основании проведенных расчетов (табл. 1) построили зависимость изменения рН раствора от суммарного содержания свободных карбоксильных ионов, в ммоль/на 1г жира.
— - - сульфатированный рыбий жир -шерстный жир
...............................................нерпичий жир — — свиной жир
- - - ■ Tanning Oil G
Рис. 2. Зависимость количества карбоксильных групп от рН, образованных в процессе деструкции
жиров культурой Pseudomonas sp
Исследуемая культура дифференцированно деструктирует жиры в зависимости от их химической природы (рис.2). Максимальной деструкции подвергался синтетический жир Tanning Oil G, представляющий собой модифицированный эмульгатор. Данное органическое вещество характеризуется низкой величиной эфирного числа (93,3) по сравнению с исследуемыми жирами, что указывает на низкое количество связанных жирных кислот, содержащихся в нем. Низкая степень вовлечения в конструктивный и энергетический обмен культурой
Pseudomonas sp. нерпичьего жира, вероятно, связана с наличием в нем насыщенных кислот -пальмитиновой и стеариновой. Для данного соединения характерно невысокое значение кислотного числа (4,907) по сравнению с Tanning Oil G (25,211), что указывает на минимальное содержание в жире свободных жирных кислот. Высокое значение кислотного числа указывает на то, что во время хранения имеет место расщепление жира на глицерин и жирные кислоты [8].
Действие микроорганизмов на жир имеет дифференцированный характер. Деструкция жира проходит замедленно, образованные кислоты расщепляются частично. В течение 48 ч культивирования в средах, содержащих жировые вещества, под действием различных ферментов, продуцируемых культурами Pseudomonas sp. и Bacillus licheniformis, происходит окисление жирных кислот до альдегидов, что подтверждается качественной реакцией «серебряного зеркала» [9] с последующим образованием карбоновой кислоты, которая после реакции с ацетил-КоА включается в цикл трикарбоновых кислот. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Штаммы Pseudomonas sp. и Bacillus licheniformis дают различные количества изгибов, что свидетельствует об изменении количества карбоксильных групп при действии на Tanning Oil G. Культура Bacillus licheniformis полнее всего вовлекает в конструктивный и энергетический обмен сульфатированный рыбий и свиной жиры.
Таблица 2
Содержание жирных кислот в жирах после деструкции микроорганизмами
через 48 ч культивирования
Жиры Кислоты Содержание жирных кислот в жировых веществах до деструкции, % Содержание жирных кислот, образованных в процессе деструкции жировых веществ Bacillus licheniformis, % Количество карбоксильных групп, образованных в результате окисления жировых веществ, ммоль/г
Pseudomonas sp Bacillus licheniformis
Сульфатирован-ный рыбий Олеиновая 65 13,41 1,64 3,43
Пальмитиновая 29 6,24
Нерпичий Олеиновая 48 5,79 1,44 1,92
Пальмитиновая 39 5,55
Изомер пальмитиновой 13 2,81
Свиной Олеиновая 50 7,43 2,03 3,16
Пальмитиновая 46 7,18
Шерстный Олеиновая 40 8,33 3,14 3,01
Пальмитиновая 60 12,89
Tannig Oil G Олеиновая 28 5,7 4,09 3,88
Пальмитиновая 38 6,92
Изомер пальмитиновой 22 4,3
На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что наиболее активна в отношении деструкции жиров культура Bacillus licheniformis. Установлено, что полнее окисляется олеиновая кислота (табл. 2), которая входит в состав Tanning Oil G. Ее содержание в жире после окисления составляет 5,7%. Хуже подвергается деструкции олеиновая кислота, входящая в состав сульфатированного рыбьего жира. Остаточное содержание ее составило 13,41 %. Для пальмитиновой кислоты в составе нерпичьего и шерстного жиров эти значения, после 48 ч культивирования, составляют 5,55 и 12,89% соответственно.
Проведенные исследования показали, что культуры Pseudomonas sp и Bacillus licheniformis вследствие окисления продуктов деструкции жиров снижают количество жирных кислот на 71 - 85%, что, вероятно, сопровождается уменьшением длины углеродной цепочки и образованием более сильных кислот.
Один и тот же жир различными культурами разрушается по-разному (рис.3). Оценивая интенсивность вовлечения сульфатированного жира в конструктивный и энергетический обмен исследуемыми культурами можно отметить, что большей деструктивной активностью обладает культура Bacillus licheniformis. Количество карбоксильных групп, образующихся в процессе деструкции сульфатированного рыбьего жира культурой Bacillus licheniformis, составило от 2 до 3,4 ммоль/гр жира, тогда как для аналогичного состава с культурой Pseudomonas sp. значительно меньше - от 0,8 до 1,6 ммоль/гр жира.
Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность утилизации жировых веществ различной химической природы выделенными из сточных вод после процесса эмульсионного обезжиривания культурами Pseudomonas sp и Bacillus licheniformis. Установлено, что максимальной деструктивной активностью по отношению к жировым веществам обладает культура Bacillus licheniformis, представляющая собой грамположитель-ную, подвижную, спорообразующую, факультативно анаэробную палочку.
о -I-------
о 2 4 6 8 10 12 14
Pseudomonas sp ■■ ■■ ' Bacillus licheniformis рН
Рис. 3. Динамика деструкции сульфатированного рыбьего жира исследуемыми культурами
Библиография
1. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. - М.: Химия, 1987. - 516 с.
2. Верболович П.А., Аблаев Н.Р., Гуськов М.И. Лекции по отдельным разделам биологической химии. - Алма-Ата: Наука, 1985. - 156 с.
3. Grady, C.P. Leslie. We can save the world // J. Cell. Biochem .- 1998 .- N17 .- P.188.
4. Кузнецов А.И., Гришина Н.Л. Жирнокислотный состав жира морских и пресноводных рыб, морских беспозвоночных и млекопитающих // Вопросы питания .- 1975 .- №6 .- С. 62-70.
5. Шалбуев Дм.В. Управление качеством окружающей среды на кожевенно-меховых предприятиях .- Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2004. - 122 с.
6. Шалбуев Дм.В., Славгородская М.В. Жировые вещества как фактор антропогенного воздей-ствия кожевенно-меховых предприятий на окружающую среду // Кожевенно-обувная промышленность .- 2007 .- №5 .- С.26-28.
7. Аналитические методы белковой химии.- М.: Изд-во «Иностранная литература», 1963.- 643
с.
8. Шалбуев Дм.В., Славгородская М.В. Изучение механизма деструкции жировых веществ различной химической природы аборигенной микрофлорой //Мат-лы II междунар. науч.-практ. конф. «Кожа и мех в XXI веке: технология, качество, экология, образование». - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2006. - С. 62-73.
9. Органическая химия. - СПб.: Изд-во «Иван Федоров», 2002. - 652 с. 1. Vojutskij S.S. Colloidal chemistry course. - М.: Chemistry, 1987. - 516 p.
2. Verbolovich P.A., Ablaev N.R., Guskov M.I. Lecture on selected parts of biological chemistry. -Alma-Ata: Science, 1985. - 156 p.
3. Grady, C.P. Leslle. We can save the world // J. Cell. Biochem .- 1998 .- №17 .- P.188.
4. Kuznetsov A.I., Grishina N.L. Fatty-acid composition of fat of sea and fresh-water fish, sea invertebrate and the mammals // Nutrition issue. - 1975 .- №6 .- P. 62-70.
5. Shalbuev Dm. V. Environment quality management at tanning and fur enterprises. - Ulan-Ude: East Siberia State University of Technology Press, 2004. - 122 p.
6. Shalbuev Dm. V., Slavgorodskaya M. V. Fatty substances are one of the factors of anthropogenic impact of tanning and fur enterprises on environment // Leather and foot-wear industry.- 2007 .- №5 .- P.26-28.
7. Analytical methods of protein chemistry.- M.: Foreign Languages Press, 1963.- 643 p.
8. Shalbuev Dm. V., Slavgorodskaya M.V. Fat substances of different chemical character mechanism destruction by aboriginal of microflora // Materials of the second international scientific practical conference «Leather and fur in XXI century: technology, quality, ecology, education». - Ulan-Ude: East Siberia State University of Technology Press, 2006. - P. 62-73.
9. Organic chemistry. - St. Petersburg.: Ivan Fyodorov Press, 2002. - 652 p.
