CC BY
40
УДК 606:631.484
Ю. А. Федорова, Г. И. Ахметова, Л. Ф. Коржова, Г. Г. Ягафарова
ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕСТРУКЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛЛЮТАНТОВ АРОМАТИЧЕСКОГО РЯДА
Ключевые слова: полициклические ароматические углеводороды, биодеструкция, аборигенные микроорганизмы.
Изучена способность аборигенных микроорганизмов, активированных в присутствии гуминового препарата, деструктировать моно-, ди-, трициклические ароматические углеводороды. Обнаружено, что выделенные микроорганизмы являются биологически активными в деградации полициклических ароматических углеводородов. Выявлено, что окисляющая активность микроорганизмов снижается с увеличением числа конденсированных колец. Установлено, что при использовании консорциума микроорганизмов (в соотношении 1:1) степень биодеструкции органических загрязнителей выше в среднем на 5-10 %, чем при их раздельном внесении.
Keywords: polycyclic aromatic hydrocarbons, biodégradation, aboriginal microorganisms.
The ability to destroy mono-, di-, tricyclic aromatic hydrocarbons by aboriginal microorganisms activated of a humic preparation has been studied. It was recognized that the obtained microorganisms are biologically active in the degradation ofpolycyclic aromatic hydrocarbons. It was found that the oxidizing activity of microorganisms decreases with increasing number of condensed rings. Experiments have shown when using the consortium of microorganisms (in a ratio of 1:1), the degree of biodegradation of organic pollutants is higher by an average of 5-10 % than when they are separately applied.
Введение
На сегодняшний день наибольшее влияние на состояние окружающей среды оказывает антропогенная деятельность, которая является источником образования и накопления различных токсичных загрязняющих веществ, в частности, таких органических поллютантов, как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые могут образовываться в результате работы металлургических, коксохимических, целлюлозно-бумажных и нефтехимических предприятий [1,2]. Поступление этих загрязняющих веществ при аварийных разливах нефти приводит к их распространению во всех компонентах окружающей среды: адсорбированные на частицах пыли они переносятся воздушными потоками, оседают на почве и дне водоемов, проникают в грунтовые воды. Негативное воздействие ПАУ на природу и живые организмы обуславливает актуальность проблемы их утилизации. Как показывает мировой опыт, среди общего многообразия применяемых технологий
обезвреживания биотехнологические методы позволяют разлагать токсичные поллютанты безопасным для окружающей среды способом и являются наиболее перспективными направлениями деградации промышленных экотоксикантов [3,4].
Целью работы являлось изучение процессов биодеструкции наиболее распространенных органических загрязнителей ароматического ряда.
В качестве поллютантов были выбраны ароматические углеводороды: псевдокумол (ПДК 0,5 мг/л), нафталин (ПДК 0,01 мг/л), фенантрен (ПДК 0,01 мг/л). Эти соединения применяются в химической, нефтехимической промышленности, а также входят в состав широко-используемых нефтепродуктов. Так, моноароматические углеводороды являются основными компонентами бензина и керосина, бициклическая ароматика
содержится в дизельном топливе, в мазуте присутствуют фенантрен и другие ПАУ. Данные поллютанты обладают токсическими свойствами, негативно влияют на окружающую среду и здоровье человека, нарушая при этом устойчивость экологических систем.
Экспериментальная часть
На начальном этапе проводили исследование химического и микробиологического состава реальных образцов загрязненного грунта. Отбор проб осуществляли согласно требованиям ГОСТ [5] на территории технологической площадки вблизи химического предприятия (г. Уфа, Республика Башкортостан). Численность гетеротрофных микроорганизмов в исследуемых образцах грунта определяли чашечным методом Коха путем высева на агаризованную питательную среду -мясопептонный агар (МПА) (таблица 1) [6]. О наличии органических поллютантов, загрязняющих образцы почвы, судили по составу почвенных экстрактов.
Таблица 1 - Количество гетеротрофных микроорганизмов, растущих на МПА
№ образца Численность микроорганизмов, кл/г а.с.п.
Образец 1 (5±0,1)106
Образец 2 (1±0,3)106
контроль* (1±0,2)108
контроль* - образец незагрязненной поллютантами почвы
Исследования показали следующее. В экстракте присутствуют малолетучие углеводороды нефтяного происхождения, в том числе псевдокумол (ПСК), нафталин (НФТ) и фенантрен (ФНТ). Биоценоз
почвы в данной точке отбора относительно скудный. По-видимому, данное обстоятельство связано с отрицательным воздействием загрязняющих веществ на популяции почвенных микроорганизмов.
Предварительную идентификацию
присутствующих в образцах микроорганизмов осуществляли по ряду культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, используя «Определитель бактерий Берджи» [6]. Было установлено, что данные бактерии относятся к родам Arthrobacter и Bacillus. Наработку биомассы выделенных аборигенных микроорганизмов (АМО) осуществляли в лабораторных условиях в жидкой среде Маккланга с добавлением в качестве стимулятора роста водного раствора гуминового препарата «Гумиком» [7], из расчета 0,02 % масс. В качестве источника углерода вносили гексадекан из расчета 1% мас. Культивирование проводили на термостатированной качалке при температуре 30°С в течение 7 суток.
Изучение процесса биодеструкции ПАУ проводили с использованием выделенных монокультур, а также их консорциума, взятых в соотношении 1:1.
С этой целью в подготовленные конические колбы с минеральной средой Маккланга вносили наработанные монокультуры Arthrobacter sp. (Монокультура 1) и Bacillus sp. (Монокультура 2) или их консорциум (из расчета 3 % об.), стимулятор роста микроорганизмов гуминовый препарат «Гумиком» (0,02 % масс.). В качестве источника углерода и энергии в среду добавляли НФТ, ПСК или ФНТ. Содержание ароматических углеводородов составляло от 1 мг/л до 10 мг/л для НФТ и ФНТ, от 50 мг/л до 500 мг/л для ПСК, что соответствовало 100 ПДК/л, 200 ПДК/л, 500 ПДК/л, 1000 ПДК/л. Исследования проводились при комнатной температуре в течение 3-7 суток. Контролем являлись колбы без внесения микроорганизмов. Косвенно о степени биодеструкции судили по приросту численности микроорганизмов [8]. Содержание органических загрязнителей определяли методом
газохроматографического анализа (ГХА).
Для проведения количественного анализа были отработаны методики пробоподготовки и хроматографического анализа. Подготовка проб включала жидкостную экстракцию хлористым метиленом, осушку полученного экстракта прокаленным Na2SO4, фильтрование и концентрирование.
Условия ГХА: хроматограф газовый PERICHROM с пламенно-ионизационным детектором; кварцевая капиллярная колонка DB-5MS (60 m x 0,25 mm x 0,2 mkm); газ-носитель азот ОСЧ, расход через колонку 1 см3, деление потока 1:60; режим ввода пробы split/splitless; объем пробы 1... 5 мкл; температурный режим термостата: изотерма 50°С в течение 1 мин, подъем температуры до 300 °С со скоростью 4 °С в мин, изотерма 300°С в течение 20 мин. Качественный анализ экстрактов проводился по временам удерживания и с помощью
добавок индивидуальных соединений в экстракт. Количественный анализ - расчет содержания загрязнителя, степени извлечения - производили по внутреннему стандарту.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования процессов
биодеструкции ряда органических загрязнителей представлены на рисунках 1-4. Максимальная деградация поллютантов бактериями наблюдается при исходных концентрациях веществ 100-200 ПДК/л.
Рис. 1 - Остаточная концентрация псевдокумола через 3 суток культивирования, мг/л
Как видно из рисунка 1, при начальной концентрации псевдокумола 100 ПДК/л его содержание уменьшилось для Arthrobacter sp. и Bacillus sp. более чем в 9 и 21 раз, степень биодеструкции составила 89 % и 95 %, соответственно.
Изучение способности микроорганизмов окислять нафталин показало снижение концентрации вещества с 1 мг/л до 0,194 мг при 100 ПДК/л, с 2 мг/л до 0,624 мг/л при 200 ПДК/л для Arthrobacter sp. (рисунок 2). Аналогичная зависимость наблюдается и для Bacillus sp.. При этом максимальная степень биодеструкции соединения после 3 суток культивирования составила 80 % и 89 % (при 100 ПДК/л) для Arthrobacter sp. и Bacillus sp., соответственно.
Эксперименты с фенантреном, в которых длительность опыта составляла 3 суток, показали незначительную биодеструкцию поллютанта микроорганизмами. Для определения времени культивирования были проведены опыты продолжительностью 5 и 7 суток. По полученным результатам установлено, что биодеструкция фенантрена в течение 3 суток в 1,4 и 1,9 раза ниже, чем в эксперименте длительностью 5 и 7 суток, соответственно. В связи с этим дальнейшие исследования проводили в течение 7 суток культивирования.
Рис. 2 - Биодеструкция нафталина Монокультурой 1 после 3 суток культивирования
Увеличение времени эксперимента привело к повышению эффективности биодеструкции с 36 % до 79% и с 44% до 84% (при 100 ПДК/л) для Arthrobacter sp. и Bacillus sp., соответственно (рисунок 3).
Биодеструкция ПАУ консорциумом
микроорганизмов выше, чем в среде с монокультурами. Так, остаточное содержание ФНТ в присутствии Arthrobacter sp., Bacillus sp. и их консорциума при 200 ПДК/л составило 0,464; 0,692; 0,422 мг/л, соответственно, в течение 7 суток культивирования (рис. 4а). При разрушении класса веществ степени биодеструкции для ПСК, НФТ, ФНТ составляют 81%, 76%, 40%, соответственно, при исходном содержании 200 ПДК/л в течение 3 суток культивирования (рис.4б).
Как показывают результаты исследований, изучаемые микроорганизмы являются биологически активными в окислении ПАУ. При этом, Bacillus sp. проявляет большую биодеградирующую способность. При использовании консорциума микроорганизмов, степень биодеструкции органических загрязнителей выше, в среднем на 5-10%, чем при их раздельном внесении.
углеводороде. Общая численность микроорганизмов за 3-7 суток культивирования увеличилась на 1-2 порядка, что свидетельствует об активном росте бактерий.
200 а
б
Рис. 4 - Биодеструкция ПАУ консорциумом АМО при 200 ПДК/л: а - ФНТ; б - класс веществ
Таким образом, наработанную биомассу консорциума активированных микроорганизмов совместно с гуминовым препаратом «Гумиком» можно рекомендовать для биотехнологического метода очистки почв и воды от ПАУ.
Рис. 3 - Степень биодеструкции фенантрена после 7 суток культивирования
Установлено, что биодеградирующая способность как монокультур по отдельности, так и их консорциума замедляется с увеличением числа конденсированных колец в ароматическом
Литература
1. Е.В Шаповал, Дисс. канд. хим. наук, Кубанский государственный университет, Краснодар, 2014. 120 с.
2. Н.И. Фатихова, Г.Г. Ягафарова, Л.Ф. Коржова, С.В. Леонтьева, Д.И. Ягафарова. Вестник технологического университета, 19, 10, 152-153 (2016).
3. Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева, Ю.А. Федорова, А.Х. Сафаров. Микробная трансформация экотоксикантов. Уфа, 2015, 254 с.
4. И.А. Дегтярева, А.Я. Давлетшина, Вестник технологического университета, 18, 4, 275-279 (2015).
5. ГОСТ 28168-89 Почвы. Отбор проб почв. Государственный агропромышленный комитет СССР, Москва, 1989, 5 с.
6. Е.З. Теппер, В.К. Шикльникова, Г.И. Переверзева. Практикум по микробиологии. Дрофа, Москва, 2004, 256 с.
7. Н.Н Чиглинцева, Ю.А. Федорова, Г.Г. Ягафарова. Защита окружающей среды от экотоксикантов, Изд-во УГНТУ, Уфа, 2014. С. 35-36.
8. Ю.А. Федорова, Н.Н. Чиглинцева, Г.Г. Ягафарова, Прикладная экология. Урбанистика, 19, 3, 60-68 (2015).
Д.И. Ягафарова, А.Х. Сафаров. Вестник ПНИПУ.
© Ю. А. Федорова - к.т.н., доцент кафедры «Прикладная экология» Уфимского государственного нефтяного технического университета; Г. И. Ахметова - магистрант кафедры «Прикладная экология» Уфимского государственного нефтяного технического университета, e-mail: [email protected]; Л. Ф. Коржова - к.х.н., инженер-лаборант кафедры «Прикладная экология» Уфимского государственного нефтяного технического университета; Г. Г. Ягафарова - д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Прикладная экология» Уфимского государственного нефтяного технического университета.
© J. A. Fedorova - Ph.D. in Technical Sciences, Assistant Professor of Applied Ecology Department, Ufa State Petroleum Technological University; G. I. Akhmetova - Graduate student, Ufa State Petroleum Technological University, e-mail: [email protected]; L. F. Korzhova - Ph.D. in Chemical Sciences, engineer-analyst of Applied Ecology Department, Ufa State Petroleum Technological University; G. G. Yagafarova - Doctor of Technical Sciences, Professor, Director of Applied Ecology Department, Ufa State Petroleum Technological University.
Все статьи номера поступили в редакцию журнала в период с 21.05.17. по 10.08.17.
