CC BY
111
УДК-66.098.2:547.52
Г. Г. Ягафарова (д.т.н., проф., зав. каф.)1, Л. Р. Атнагулова (магистрант)1, М. И. Маллябаева (к.х.н)1, Л. Ю. Хакимова (студ.)1, Т. В. Тюмкина (с.н.с., к.х.н.)2
ИССЛЕДОВАНА БИОДЕСТРУКЦИИ ПОЛИАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра прикладной экологии 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431737, e-mail: ecologia1@rambler.ru 2Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук, лаборатория структурной химии 450075, г. Уфа, пр. Октября, 141; тел/факс (347) 2842750, e-mail: ink@anrb.ru
G. G. Yagafarova1, L. R. Atnagulova1, M. I. Mallyabaeva1, L. Yu. Khakimova1, T. V. Tyumkina2
BIOLOGICAL DEGRADATION STADY OF POLYAROMATIC COMPOUNDS
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431737, e-mail: ecologia1@rambler.ru 2Institute of Petrochemistry And Catalysis Russian Academy of Sciences 141, Pr. Oktyabrya, 450075, Ufa, Russia; ph/ fax (347) 2842450, e-mail: ink@anrb.ru
Выделен консорциум микроорганизмов-деструкторов из активного ила биологических очистных сооружений ОАО «Уфанефтехим», с помощью которого исследован процесс биодеструкции полиароматических соединений: нафталина, фенантрена и антрацена, известных своими ток-сичными,мутагенными и канцерогенными свойствами. В качестве продуктов биодеструкции методом и 13С ЯМР спектроскопии иденци-фицированы в случае фенантрена и антрацена легкие алканы, а в случае нафталина — 1,2-ди-гидроксинафталин. Установлено, что наибольшей степенью биодеструкции после 30 сут культивирования характеризуется фенантрен — 39%, в то время как трансформация нафталина и антрацена составляет 15% и <5%, соответственно. Для интенсификации процесса биодеструкции полироматических углеводородов подобран ростовой субстрат.
Ключевые слова: биодеструкция; консорциум активного ила; полиароматические углеводороды; 1И и 13С ЯМР спектроскопия.
The consortium of microorganisms -destructors from active silt of biological treatment facilities of «Ufaneftekhim» was selected. The process of polyaromatic compounds biodestruction: naphthalene, phenanthrene and anthracene (known for the toxic, mutagen and cancerogenic properties) was investigated by means of active silt. As biodegradation products by the spectroscopy nuclear magnetic resonance method 1H and 13C the light alkanes were identified in the case of phenanthrene and anthracene, and 1,2-dihydro-xynaphthalene in case of naphthalene. It is established that phenanthrene is characterized by the greatest degree of biodestruction after 30 days of cultivation — 39% while naphthalene and anthracene transformation makes 15% and 5% respectively. The growth substrate was selected to intensify the polyaromatic hydrocarbons biodestruction process.
Key words: biodestruction; consortium of active silt; polyaromatic hydrocarbons; 1H and 13C NMR spectroscopy.
Основными источниками эмиссии техногенных полиароматических углеводородов (ПАУ) в окружающую природную среду являются предприятия энергетического комплекса, автомобильный транспорт, химическая и нефтеперерабатывающая промышленность. В основе практически всех техногенных источни-
Дата поступления 05.05.14
ков ПАУ лежат термические процессы, связанные со сжиганием и переработкой органического сырья: нефтепродуктов, угля, древесины, мусора, пищи, табака и др 1.
Канцерогенные и мутагенные свойства данных веществ общеизвестны 2, так как среди веществ-экотоксикантов именно полиароматические соединения занимают одно из первых
мест по урону, наносимому окружающей среде. Однако, их утилизация сводится в основном к захоронению на специальных полигонах. С точки зрения экологии, ключом к решению проблемы очистки окружающей среды от чужеродных соединений является именно микробиологическая трансформация и деградация. В связи с этим целью работы являлось исследование биодеструкции ПАУ консорциумом микроорганизмов-деструкторов, выделенным из активного ила биологических очистных сооружений ОАО «Уфанефтехим». Предполагаются их адаптационные свойства к ароматическим соединениям, в том числе к ПАУ. В качестве объектов исследования взяты нафталин, фенантрен и антрацен. Считается, что ПАУ с числом ароматических колец менее четырех более экотоксичны вследствие более высокой биодоступности по сравнению с ПАУ с числом ароматических колец более пяти, несмотря на то, что последние суперканцероге-
3
ны и мутагены 3.
Для достижения поставленной цели был выделен консорциум микроорганизмов-деструкторов из активного ила биологических очистных сооружений ОАО «Уфанефтехим», который далее был использован в качестве биодеструктора. Предварительными исследованиями было установлено, что в состав консорциума входят спорообразующие бактерии, которые относятся к роду Bacillus sp. Было выявлено, что данный штамм способен расти в минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии только фенол. Так, прирост культуры с (1±0.3)-106 до (4±0.2)-106 наблюдается на 7 сут культивирования.
В качестве продуктов деградации фенола методом 1H и 13С ЯМР спектроскопии были идентифицированы алканы, характеристичные сигналы которых наблюдаются при 8=0.9 м.д. (-CH3) и 8=1.2 м.д. (-CH2-) в спектрах ЯМР 1H. Соответственно в спектрах ЯМР 13С метильным и метиленовым группам соответствуют сигналы, наблюдаемые в области 13.2—14.6 м.д. и 22.2—23.6 м.д. согласно данным двумерной гетероядерной корреляционной ЯМР спектроскопии (HSQC). Мониторинг относительной интегральной интенсивности сигналов исходных компонентов и продуктов биотрансформации во времени (выборка — 1,3,5,7 сут) свидетельствует об увеличении содержания продуктов в 18 раз к концу эксперимента. Кинетические кривые приведены на рис. 1.
01234Sfi7Ä сутки
Рис. 1. Кинетические кривые расходования фенола и накопления продукта реакции биодеструкции:
начальная точка соответствует чистому фенолу, спектральные характеристики которого соответствуют литературным данным 4.
Далее исследование биодеструкции ПАУ подобранным консорциумом микроорганизмов-деструкторов проводили в полной минеральной среде Маккланга, содержащей в объеме 100 мл следующие компоненты: МаЫО3 — 0.2 г, КН2РО4 - 0.1 г, MgSO4 • 7Н2О - 0.05 г, 4 — в следовых количествах. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли нафталин, фенантрен и антрацен из расчета 1 г/л. Дрожжевой автоли-зат в следовых количествах использовали как ростовой субстрат. Длительность культивирования на термостатической качалке при температуре 30 0С составила 30 сут. Результаты экспериментов приведены в табл. 1.
Таблица 1 Содержание микроорганизмов в 1 мл среды с ПАУ
Гетеротрофы, растущие на МПА Микромицеты
1 сут 30 сут 1 сут 30 сут
Нафталин (1±0.3)-106 (2±0.2)-106 + +
Фенантрен (1±0.1)-106 (3±0.3)-107 + +
Антрацен (1±0.3)106 (2±0.1 )106 + ++
Как видно из табл. 1, наблюдается прирост микроорганизмов, причем относительно больший в среде с фенантреном.
Степень биодеструкции полиароматических соединений, а также идентификация продуктов определялись методом ЯМР спектроскопии.
В спектрах ЯМР 1Н образца с фенантре-ном, наряду с сигналами фенантрена, проявляющимися в слабопольной области спектра, появляются новые сигналы в области сильных полей, а именно, 8=0.6 м.д. и 8=1.1 м.д., характеристичные для алканов. Оценка соотношений интегральных интенсивностей сигналов
фенантрен
Г
JL
J
и
-СИ,
CDCI3
-СИз
1 ' ' ' ' 1 1 ■ ■ ' I ' ■ ' ' г ' ■ ' 1 г ■ ■ 1 ' Г ' ' ' ' Г ' 1 ' ■ 1 ' ' ' ' 1 ' ' ■ ' I ■ ' ' ' Г ' ' ' ' г ■ 1 1 ' 1 ' ' ' ' 1 ' ' ■ ■ I 1 ' ■ ' [ ' ' ' ' I ' ■ ' ' [ ' ' ' '
8.5 8.0 ; . 5 1.0 Й.Ь 6.0 а.Ь 5.0 4.о 4.0 З.э 1.0 2.5 2.0 1.5 1.0 О.Ь ррт
Рис. 2. Спектр ЯМР H образца, соответствующего 30 сут культивирования фенантрена
показала, что степень прошедшей биотрансформации фенантрена в среде с консорциумом микроорганизмов составляет 39.1%. Полученные спектральные данные вполне согласуются с выводами об уменьшении токсичности данных образцов в связи с уменьшением их содержания в исследуемом образце (рис. 2).
Однако степень биодеструкции антрацена по истечении 30 сут не превышает 5%, так как в спектрах 1H ЯМР интенсивность дополнительных сигналов незначительна. Интенсификации процесса биодеструкции фенантрена и антрацена на 50% можно добиться при использовании в качестве ростового субстрата сахарозы. Следует отметить, что скорость биодеструкции в данном случае зависит только от структуры (или расположения ароматических колец относительно друг друга) субстрата, так как число колец одинаково для обоих соединений (n=3).
Таким образом, впервые установлено, что консорциум микроорганизмов-деструкторов, выделенный нами из «загрязненной» почвы, может трансформировать ПАУ до экологически безопасных легких алканов, в то время как известно, что в результате трансформации отдельными видами бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia и грибов Aspergillus, Pemcillium и др. 5 ароматические группы ПАУ подвергаются гидроксилированию с последующим расщеплением дигидроксилированного кольца. Дальнейшее расщепление осуществляется через раскрытие ароматического кольца, катализируемое диоксигеназами. Например, антрацен окисляется через 2-гидроси-3-наф-тойную кислоту до 2,3-дигидроксинафталина 6, фенантрен деградируется через 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту с последующим превращением в салицилат и катехол 5.
Установлено, что продуктами биодеструкции нафталина не являются алканы, так как в спектрах ЯМР характерные для них сигналы отсутствуют. Анализ спектральных параметров новых сигналов относительно исходного вещества показал наличие 1,2-дигидроксинаф-талина (относительно исходного соединение содержание составляет порядка 15%). Так, наблюдается смещение одного из сигналов протонов в слабое поле до 8.8 м.д. относительно 7.9 м.д. в нафталине, что свидетельствует о прошедшем гидроксилировании. Мультиплет-ность смещенного сигнала представляет собой дублет с 3J = 7.9 Гц. Согласно литературным данным, ароматическое кольцо нафталина действительно наиболее часто расщепляется через 1,2-дигидроксинафталин и салициловую кислоту до пирокатехина 7, хотя некоторые бактерии окисляют нафталин до 1,2-нафтохи-нона, токсичного для микробной клетки 8.
Сравнение степени биодеструкции нафталина, фенантрена и антрацена представлено в виде диаграммы на рис. 3.
Рис. 3. Сравнительная характеристика биодеструкции полиароматических соединений (исходное содержание 1 г/л)
Таким образом, из активного ила биологических очистных сооружений ОАО «Уфанеф-техим» нами впервые выделен консорциум микроорганизмов-деструкторов, способный к биодеградации фенантрена и антрацена до легких алканов. Из исследуемых ПАУ наиболее биостойким явился антрацен (степень биодеструкции -5% после 30 сут культивирования).
Для интенсификации процесса биодеструкции полиароматических углеводородов подобран ростовой субстрат - сахароза.
Очевидно, что в природных средах эффективность трансформации ПАУ в почве зависит от ее свойств, возраста загрязнения, концентрации ПАУ, дополнительных источников углерода (в виде корневых выделений, растительных остатков, компоста) и т.д. Однако, нами показана принципиальная способность почвы к самоочищению.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 13С, получены на спектрометре Вгикег ЛУЛЫСЕ-400, рабочая частота 400,13 МГц Он) и 100,63 МГц (13С). В качестве стандарта ЯМР 1Н, 13С использовали CDCl3. Образцы готовили в стандартной ампуле диаметром 5 мм. Количество точек в одномерной спектроскопии ЯМР 1Н - 32К, импульс 90о длительностью 14,7 мс, ЯМР 13С — 32 К, импульс 90о длительностью 9.3 мс. Время ожидания 5 с.
Выделение деструкторов ароматических углеводородов. Для выявления наиболее активных штаммов микроорганизмов, способных к деградации ароматических углеводородов, использовались образцы почвы с территории ОАО «Уфахимпром» и микробный консорциум активного ила из биологических очистных сооружений ОАО «Уфанефтехим». Образец №1 был отобран около цеха со стороны отвода вентиляторов, образец №2 — около отстойников, образец №3 — около цеха, в местах разгрузки химических препаратов. Глубина отбо-
ра проб составляла 15—20 см. Для выделения колоний микроорганизмов проводили разведение образцов почвы методом Пастера (метод предельных разведений) до 6 9.
Результаты анализа приведены в табл. 2.
Как видно из результатов анализа, образцы №1-3 содержат до (1±0.2)-108, (2±0.4)-107, (2±0.3)-106 бактерий, растущих на МПА соот-ветсвенно. Образцы №2 и 3 содержат микрро-мицеты. В образце №1 микромицеты не обнаружены.
Для выделения чистой культуры из образцов №1 104, №2 102 и №3 103 проводили многократное последовательное засевание штрихом по всей поверхности питательной среды (метод истощающего штриха).
В результате исследований выявлено, что выделенные бактерии представляют, в основном, спорообразующие бактерии, которые относятся к роду Bacillus sp. Идентификацию микроорганизмов проводили по определителю
Берджи 10. Спорообразование установили по 11
известной методике .
Так же проводили анализ с помощью микроскопа МИКРОМЕД-2 для морфологических исследований . Результаты микроскопирова-ния представлены на рис. 4—6.
Рис. 4. Бактерии из образца почвы №1
Таблица 2
Рост микроорганизмов в зависимости от разведения
Образец №1 Образец №2 Образец №3
Микробы, растущие на МПА Микромицеты Микробы, растущие на МПА Микромицеты Микробы, растущие на МПА Микромицеты
102 Сплошной рост Отсутствуют Сплошной рост - Сплошной рост -
103 Сплошной рост Отсутствуют Сплошной рост - Сплошной рост -
104 Сплошной рост Отсутствуют Сплошной рост - Сплошной рост -
105 Сплошной рост Отсутствуют Сплошной рост - Сплошной рост -
106 (1±0.2)108 Отсутствуют (2±0.4)107 +++ (2±0.3)106 ++
Рис. 5. Бактерии из образца почвы №2
Как видно из рис. 4—6, в образцах №1 и №3 преобладают кокки размером 1—2 мкм, в образце №2 — палочковидные бактерии размером 5—6 мкм.
Для дальнейших исследований в качестве монокультуры-деструктора ароматического соединения был использован штамм Bacillus sp. выделенный из образца №2, так как предвари-
Литература
1. Имашев У. Б. Промышленная органическая химия на предприятиях Республики Башкортостан.- Уфа: Изд-во УГНТУ, 2000.- 144 с.
2. Реутов О. А., Курц А. Л., Бутин К. П. Органическая химия.- М.: Бином, 2004.- 1994 с.
3. Spectral Database for Organic Compounds, SDBS. [Электронный ресурс]: Режим доступа: http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/ direct_frame_top.cgi
4. Козлов Г. В., Гарабаджиу А. В., Соколов В. Н. // Биотехнология.- 1999.- №4.- C.63.
5. Мирчинк Т. Г. Почвенная микология.- М.: Изд-во МГУ, 1988.- 220 с.
6. Волова Т. Г. Биотехнология.- Новосибирск: Изд.-во Сибирского отделения РАН, 1999.252 с.
7. Кошелева И. А., Балашова Н. В., Измалкова Т. Ю. и др. // Микробиология.- 2000. Т.69, №4.-С.783.
8. Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.- М.: Изд-во МГУ, 1995.- 224 с.
9. Щеглова М. К., Глухов Н. В., Остроухова З. А. Руководство для большого практикума по микробиологии.- Саратов: СГУ, 1981.- С.87.
10. Криг Н., Снит П., Уильямс С., Бок Э., Хоулт Джон, Беркли Р., Бун Д., Стейли Дж., Стин П. Определитель бактерий Берджи.Т.1.- М: Мир, 1997.- 430 с.
11. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова.- М.: Академия, 2005.- 608 с.
Рис. 6. Бактерии из образца почвы №3
тельными исследованиями было выявлено, что данный штамм способен расти в минеральной среде, содержащий в качестве источника углерода и энергии фенол.
В качестве консорциума использовались микроорганизмы активного ила из БОС ОАО «Уфанефтехим».
References
1. Imashev U. B. Promyshlennaya organicheskaya khimiya na predpriyatiyakh Respubliki Bashkortostan Industrial organic chemistry at the enterprises of the Republic of Bashkortostan]. Ufa: USPTU Publ., 2000. 144 p.
2. Reutov O. A., Kurts A. L., Butin K. P. Organicheskaya khimiya [Organic chemistry].-Moscow: Binom Publ., 2004. 1994 p.
3. Spectral Database for Organic Compounds, SDBS. http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi
4. Kozlov G. V., Garabadzhiu A. V., Sokolov V. N. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 1999. No.4. P.63.
5. Mirchink T. G. Pochvennaya mikologiya [Soil mycology]. Moscow: Moscow State University Publ., 1988. 220 p.
6. Volova T. G. Biotekhnologiya [Biotechnology]. Novosibirsk: Siberian Branch of Russian Academy of Sciences Publ., 1999. 252 p.
7. Kosheleva I. A., Balashova N. V., Izmalkova T. Ju. i dr. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2000. V.69, no.4. P.783.
8. Egorov N. S. Rukovodstvo k prakticheskim zanyatiyam po mikrobiologii [Guide to practical training in microbiology]. Moscow: Moscow State University Publ., 1995. 224 p.
9. Scheglova M. K., Glukhov N. V., Ostroukhova Z. A. Rukovodstvo dlya bol'shogo praktikuma po mikrobiologii [Guide for a large workshop for Microbiology]. Saratov: SGU Publ., 1981.- P. 87.
10. Krig N., Snit P., Uil'jams S., Bok Je., Hoult Dzhon, Berkli R., Bun D., Stejli Dzh., Stin P. Opredelitel' bakterii Berdzhi. T.1 [Determinant bacteria Bergey. V. 1]. Moscow: Mir Publ.,, 1997.- 430 p.
11. Praktikum po mikrobiologii [Workshop on Microbiology / Ed. A.I. Netrusov]. Moscow: Akademiya Publ., 2005. 608 p.
