CC BY
194
ФАРМАКОЛОГИЯ
ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОПОЛИСА
Е.А. Данилина1, Э.Г. Кравцов2, Е.Ю. Бабаева3
кафедра управления и экономики фармации 2Кафедра микробиологии и вирусологии 3Кафедра ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198
Изучена антимикробная активность образцов прополиса из разных регионов с помощью нескольких методик. Показано, что только методика, изложенная в ГОСТ Р 53124-2008 «Прополис. Антимикробная активность», дает корректный результат. Максимальная противомикробная активность выявлена в образце из Луганской области Украины. Установлено, что водорастворимая часть водно-спиртового экстракта прополиса не обладает антимикробной активностью.
Ключевые слова: прополис, антимикробная активность.
Прополис — это продукт пчеловодства, представляющий собой смесь смолистых, фенольных веществ, терпеноидов, воска и других соединений природного происхождения. Благодаря широкому спектру биологической активности соединений, входящих в состав прополиса, лекарственные препараты из него используются современной медициной и ветеринарией [8]. Состав прополиса сложен и полностью не изучен [5; 7]. При контроле качества прополиса используется ряд органолептических показателей (цвет, запах и др.), что не соответствует современным требованиям.
По данным некоторых источников, прополис предлагается стандартизовать по минимальной подавляющей концентрации его извлечений относительно микроорганизмов. На одни виды микробов прополис оказывает бактериостатический эффект, на другие — бактерицидный. Например, минимальные бактерицидные концентрации в отношении культур Staphylococcus aureus 209Р варьируют между 110 и 1680 мкг/мл. По-видимому, для гарантии наиболее широких антибиотиче-
ских свойств прополиса, включающих бактерицидный и бактериостатический эффекты, стандартизация должна быть одновременно основана на обоих показателях антимикробного действия [9]. В РФ действует ГОСТ Р 53124-2008 «Прополис. Антимикробная активность». Он устанавливает метод определения минимальной подавляющей концентрации водно-спиртового экстракта прополиса (в пересчете на сухую массу прополиса) в диапазоне от 100 до 600 мкг/мл для характеристики его антимикробной активности в отношении Staphylococcus aureus 209Р (FDA 209Р, ATCC 6538P) [1].
Целью работы является изучение антимикробной активности образцов прополиса из разных регионов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1) оценивали возможность использования метода дисков для определения бактериостатической активности спирторастворимого и водорастворимого компонентов прополиса;
2) оценивали корректность метода разведений при определении бактерио-статического действия спиртового экстракта прополиса;
3) проводили стандартизацию образцов прополиса по бактериостатической активности методом, регламентированным ГОСТ Р 53124-2008.
Материалы и методы. Объектами исследования были образцы прополиса из двух регионов РФ (Орловской и Московской (2 образца) областей), а также из Черниговской и Луганской областей Украины. Для определения противомик-робного действия опытных образцов был использован референс-штамм Staphy-lococcus aureus 209Р из коллекции кафедры микробиологии и вирусологии РУДН. Его культивировали на агаре Мюллера-Хинтона (МХА). Для проведения опытов изначально из образцов прополиса готовили 5% водно-спиртовое извлечение, для чего к 100 мл 70% этанола добавляли навеску 5 г измельченного образца, выдерживали 2 дня при комнатной температуре и периодическом встряхивании, фильтровали.
С целью получения из спиртового экстракта водорастворимого компонента 1 мл его высушивали, добавляли 1 мл воды, и затем в водном растворе определяли концентрацию веществ по сухой массе. Наличие спиртового экстракта послужило основанием к привлечению разных способов оценки их бактериостатиче-ской активности. В работе использовали метод дисков. С его помощью изучали спиртовые экстракты и их водорастворимые компоненты.
Принимая во внимание то, что бактерицидным действием обладает экстра-гент (70% этанол), перед использованием пропитанные изучаемым раствором диски высушивали и только после этого наносили на засеянный газон.
В опытах с использованием метода разведений в ряд пробирок с жидким мясопептонным бульоном (МПБ) с добавлением глюкозы до концентрации раствора 2,5% вносили по 25 мкл спиртового экстракта прополиса в разных концентрациях. В качестве контроля в последнюю пробирку вносили 25 мкл 70% этанола.
Все пробирки засевали бактериологической петлей взвесью Staphylococcus aureus 209Р, содержащей стандартную концентрацию микробных клеток.
Третьим способом, примененным для определения бактериостатической активности, был способ, регламентированный ГОСТ Р 53124-2008. Он заключается в том, что в расплавленную агаризованную среду, разлитую по 5 мл в ряд пробирок, вносили разные концентрации раствора исследуемого образца. После перемешивания среду выливали в чашки Петри, где она застывала. Чашки подсушивали 15 мин. и засевали газонной тест-культурой Staphylococcus aureus 209Р в концентрации, оттестированной по стандарту мутности (10-4).
В таком варианте опыта удается исключить бактерицидное действие этанола. В то же время, поскольку рост тест-культуры происходит на среде, содержащей растворимые в этаноле компоненты образца, в случае их бактериостатического действия можно зарегистрировать задержку роста культуры и определить действующую концентрацию тестируемого образца.
Результаты и их обсуждение. При определении бактерицидной активности образцов прополиса методом дисков было установлено, что вокруг дисков, обработанных спиртовым экстрактом всех образцов, не образуются зоны задержки роста Staphylococcus aureus 209Р. Это исключало бактериостатическую активность тех компонентов, которые после высушивания дисков могли диффундировать в гель, т.е. водорастворимых компонентов водно-спиртового экстракта, и в то же время не исключало бактериостатическое действие спирторастворимых компонентов, остающихся на дисках.
С целью уточнения данного заключения образцы прополиса исследовали методом разведений. Оказалось, что при внесении в жидкую питательную среду водно-спиртовых экстрактов образцов в разных разведениях рост тест-культуры отсутствовал. При этом не было роста и в контроле, где вместо экстракта прополиса был внесен растворитель, что говорит о бактериостатической активности самого растворителя (70% этанол), в связи с чем невозможно оценить эффективность прополиса.
Иной эффект наблюдался, когда в среду вносили водорастворимый компонент водно-спиртового экстракта. Тест-культура давала рост во всех пробирках, в том числе в контрольной. Это позволило считать, что водорастворимый компонент не обладает бактериостатическим действием, даже в высоких его концентрациях (600 мкг/мл).
Тем не менее, некоторые авторы не исключают бактериостатической активности водорастворимой субстанции прополиса, но только в том случае, когда для ее получения применяют специальные методы, например, электролиз в водной среде [2—4].
Следует отметить, что подобная обработка прополиса приводит к его денатурации в результате гидролиза и окисления некоторых биологически активных веществ.
Из всех использованных в данной работе методов способ определения про-тивомикробной активности прополиса, предлагаемый действующим регламентом, оказался наиболее репрезентативным. Все исследуемые образцы вызывали задержку роста культуры Staphylococcus aureus 209Р. Интенсивность задержки коррелирует с концентрацией раствора анализируемого образца, т.е. в данной постановке опыта можно было определить минимальную бактериостатическую активность образца.
Во всех опытах контроль на бактериостатический эффект растворителя был отрицательным. Это указывает на испарение этанола, который содержался в экстракте образца при внесении в расплавленный агар. Были проведены испытания пяти образцов прополиса. Они показали, что все образцы обладали бактериостати-ческой активностью. Минимальная концентрация экстракта образцов, подавляющая рост культуры Staphylococcus aureus 209Р, представлена на рис. 1.
Минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл
Рис. 1. Минимальная подавляющая концентрация образцов прополиса
Из этих данных следует, что активность экстрактов образцов прополиса находится в диапазоне, предусмотренном ГОСТом (от 600 до 100 мкг/мл). Наибольшей активностью обладал образец из Луганской области, у которого минимальная подавляющая рост Staphylococcus aureus 209Р доза составляла 109,2 мкг/мл. Наименьшая активность была у образца прополиса из Орловской области, у которого этот показатель составил 208 мкг/мл.
По итогам исследования антимикробной активности прополиса можно сказать, что он активен в отношении золотистого стафилококка. Румынские исследователи также отмечают, что лучшая чувствительность к 5% водно-спиртовому извлечению прополиса (растворитель 70% этанол) у грамположительных бактерий, в том числе у Staphylococcus aureus 209Р [6].
Заключение
В ходе исследования было выявлено, что все образцы прополиса обладают антибактериальной активностью по отношению к золотистому стафилококку, а их минимальная подавляющая концентрация составляет 109—208 мкг/мл, что соответствует диапазону измерений, указанных в ГОСТ Р 53124-2008 (от 100 до 600 мкг/мл). Для определения антимикробной активности прополиса следует использовать ГОСТ Р 53124-2008 «Прополис. Антимикробная активность». Бак-териостатическая активность водорастворимого компонента спиртового экстракта прополиса использованными методами не выявлена.
ЛИТЕРАТУРА
[1] ГОСТ Р 53124-2008 Прополис. Антимикробная активность. М.: ФГУП Изд-во Стан-дартинформ, 2008.
[2] Иванов Ц.И., Шкендеров С.В. Пчелиные продукты. София: Земиздат, 1983.
[3] Корнева Н.В., Орлов Б.Н. Прополис и воск — пчелам и человеку. Н. Новгород: Изд. Ю.А. Николаев, 2009.
[4] Омаров Ш.М. Апитерапия: продукты пчеловодства в мире медицины. Ростов н/Д: Феникс, 2009.
[5] Da Silva F.C., Favaro-Trindade C.S., Severino M. de Alencar et al. Physicochemical properties, antioxidant activity and stability of spray-dried propolis // Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 3 (2): 94—100 (2011).
[6] Marghitas L.A., Mihai C.M., Chirila F. et al. The Study of the Antimicrobial Activity of Transyl-vanian (Romanian) Propolis. Marghitas, L. Al. Et al. / Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj 38 (3) 2010, 40—44.
[7] Sawaya A. C.H. Frankland; da Silva C., Ildenize B. et al. Analytical methods applied to diverse types of Brazilian propolis // Sawaya et al. Chemistry Central Journal. 2011. Vol. 5. Issue 1. P. 27.
[8] Sforcin J.M., Vassya B. Propolis: Is there a potential for the development of new drugs? // Journal of Ethnopharmacology. 2011. 133. pp. 253—260.
REFERENCES
[1] GOST R 53124-2008 Propolis. Antimicrobial activity. Publ House Standartinform. Moscow, 2008.
[2] Ivanov Ts.I., Shkenderov S.V. Bees products. Sofia: Zemizdat, 1983.
[3] Kornev N. V., Orlov B.N. Propolis and beeswax — for bees and humans. N. Novgorod: Publ. Yu.A. Nikolaev, 2009.
[4] Omarov Sh.M. Apitherapy: bee products in medicine. Rostov-on-Don: Phoenix, 2009.
[5] Da Silva F.C., Favaro-Trindade C.S., Severino M. de Alencar et al. Physicochemical properties, antioxidant activity and stability of spray-dried propolis // Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 3 (2): 94—100 (2011).
[6] Marghitas L.A., Mihai C.M., Chirila F. et al. The Study of the Antimicrobial Activity of Tran-sylvanian (Romanian) Propolis. Marghitas, L.Al. et al. / Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj 38 (3) 2010, 40—44.
[7] Sawaya A. C.H. Frankland; da Silva C., Ildenize B. et al. Analytical methods applied to diverse types of Brazilian propolis // Sawaya et al. Chemistry Central Journal. 2011. Vol. 5. Issue 1. p. 27.
[8] Sforcin J.M., Vassya B. Propolis: Is there a potential for the development of new drugs? Journal of Ethnopharmacology. 2011. 133. p. 253—260.
STUDY OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF PROPOLIS
E.A. Danilina1, E.G. Kravtsov2,
E.Yu. Babaeva3
department of management and economics of pharmacy
2Department of Microbiology and Virology 3Department of botany, physiology and agrobiotechnology People's Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
Antibacterial activity of propolis samples from different regions using several techniques has studied. It is shown that only the methodology outlined in the GOST R 53124-2008 "Propolis. Antimicrobial activity", gives a correct result. The maximum antimicrobial activity has been detected in the sample from the Lugansk region, Ukraine. It has been established that the water-soluble portion of alcoholic extract of propolis has no antimicrobial activity.
Key words: propolis, antimicrobial activity.
