CC BY
43
Фармация и фармакология. № 5 (12), 2015
УДК 615.285.7:576.8.073.3
ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОИ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНОГО ДИАЗИНОНА ПЯТИ10
12 1 2 А.В. Воронков, С.А. Лужнова, И.П. Кодониди, Н.М. Габитова,
1С.А. Ловягина, 1В.С. Сочнее
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ
Минздрава России, г. Пятигорск
2Научно-исследовательский институт по изучению лепры Минздрава России, г. Астрахань
STUDY FOR ANTIMYCOBACTERIAL ACTIVITY OF PYATD10 DIAZINON DERIVATIVE
1 2 12 A.V. Voronkov, S.A. Luzhnova, I.P. Kodonidi, N.M. Gabitova,
1S.A. Lovyagina, 1V.S. Sochnev
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical
University, Pyatigorsk 2Leprosy Research Institute, Astrakhan E-mail: prohor. 77@mail.ru
Проведен анализ антимикобактериальной активности производного диазинона ПЯТ610 и дапсона. Способность соединения ПЯТ610 и препарата дапсон подавлять рост культуры M.lufu исследовали методом серийных разведений. Визуальная оценка посевов на среде Школьниковой показала, что при концентрации соединения ПЯТ610 128 мкг/мл роста микобактерий не наблюдается, в то время как минимальная подавляющая концентрация дапсона была равна 32 мкг/мл. При исследовании мазков, окрашенных по Murohashi, под действием субстанции ПЯТ610 и препарата дапсон в тех же концентрациях, выявлено снижение содержания живых форм микобактерий. При этом доля нежизнеспособных бактерий уменьшается с увеличением разведения, но составляет не менее 35%. Таким образом, соединение ПЯТ610 проявляет антимикобактериальную активность в отношении М. lufu, несколько уступая по данному виду активности препарату сравнения дапсон.
Ключевые слова: производное диази-нона, дапсон, M.lufu, противолепрозная активность.
We have carried out the analysis of antymicobacterial activity of PYATd10 dia-zinon derivative and dapsone. The capability of PYATd10 compound and dapsone drug to suppress the growth of M.lufu culture was studied by the method of serial dilutions. Visual evaluation of inoculations in medium Shkolnikova showed that there was no growth of mycobacteria with PYATd10 concentration 128 qg/ml, while minimum suppressing concentration of dapsone were equal to 32 qg/ml. Examining smears, colored according to Murohashi, under the influence of PYATd10 excipient and dapsone drug in the same concentrations, we have revealed the decrease of mycobacterial living forms content. A share of inviable bacteria decreased after the cultivation intensification, but amounts to less than 35%. Thus, the PYATd10 compound exhibits antimycobacterial activity towards M. lufu, being slightly inferior to the dapsone comparative drug by this type of activity.
Keywords: diazinone derivatives, dapsone, M. lufu, antileprotic activity.
26
Фармация и фармакология. № 5 (12), 2015
Лидером среди препаратов, находящихся в современном арсенале противолепрозной терапии, является дапсон. Однако, наряду с высоким терапевтическим действием, препарат обладает рядом негативных эффектов, таких, как гематотоксичность, нейротоксичность, развитие тяжелых аллергических реакций и др. [5]. Кроме этого, по данным ВОЗ у 7-10% больных лепрой регистрируется вторичная, а у 3-4% - первичная резистентность к данному препарату. Таким образом, создаются предпосылки поиска новых лекарственных средств с антимикобактериальной активностью и лучшим профилем лекарственной безопасности.
В связи с этим актуальным является исследование противолепрозной активности нового производного диазинона ПЯТd10, который имеет в своей структуре фрагмент дапсона, что дает основания предполагать наличие у него антимикобактериальных свойств [2,4].
Цель работы - изучение in vitro противолепрозной активности производного ди-азинона ПЯТd10.
Изучение противолепрозной активности ПЯТd10 in vitro проводилось на базе ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» Минздрава России, г. Астрахань.
Для проведения первичного скрининга использовали культуру M.lufu, полученную от профессора Seydel (Германия), при содействии отдела лепры ВОЗ. Тест - штамм M.lufu поддерживался на среде Левен-штейна-Йенсена.
Способность производного диазинона ПЯТd10 подавлять рост культуры M.lufu исследовали методом серийных разведений на среде Школьниковой, используемой для культивирования M.tuberculosis [1,3].
Метод серийных разведений предполагает создание последовательных разведений вещества в питательной среде. В данном исследовании концентрация изучаемого соединения в ряду серийных разведений убывала в геометрической прогрессии с коэффициентом 2. Навеска субстанции (4мг) растворялась в 0,5 мл димексида, затем туда вносили 4,5 мл физиологического
раствора, получая рабочий раствор с концентрацией 800 мкг/мл, из которого на среде Школьниковой готовили разведения, содержащие активное вещество в концентрациях 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл. Контролем служила пробирка, содержащая среду Школьниковой без исследуемых соединений, а также ряд серийных разведений препарата дапсон.
Для приготовления взвеси микобактерий использовали двухнедельную культуру M.lufu, синхронизированную холодом (+40С) в течение 72 часов. Микобактериальную суспензию определённой плотности, соответствующую стандарту мутности 5 по McFarland, по 0,2 мл вносили в каждую пробирку ряда последовательных разведений изучаемых веществ, включая кон-троли. Посевы инкубировали в течение 10 дней при температуре +31 °С. По истечении этого срока визуально оценивали наличие роста в каждой из пробирок. Первую наименьшую концентрацию субстанции, при которой не определялся бактериальный рост, считали минимальной подавляющей концентрацией (МПК). После этого из каждой пробирки на среду Ле-венштейна-Йенсена высевали 0,05 мл суспензии с целью определения жизнеспособности M.lufu. После высева на жизнеспособность содержимое пробирок центрифугировали (1500 об/мин в течение 10 минут). Осадок делили на две части для окрашивания по методу Циля-Нильсена на кислотоустойчивость и методу Murohashi для определения соотношения жизнеспособных и «мертвых» бактерий [1].
В мазках, окрашенных по Цилю -Нильсену, просматривали 20 полей зрения, определяли соотношение кислотоустойчивых (КУМ) и некислотоустойчивых форм (НКУМ). В мазках, окрашенных по Muro-hashi, также просматривали 20 полей зрения, в которых определялось процентное содержание «живых» M.lufu. При окраске по методу Murohashi «живые» микобактерии приобретали зеленый цвет, несмотря на дополнительную окраску фуксином, сохраняли его. Погибшие клетки теряли эту
27
Фармация и фармакология. № 5 (12), 2015
способность и имели красный цвет. В зависимости от соотношения «живых» и «мертвых» M.lufu в мазке судили о характере действия соединения.
Посевы на среде Левенштейна-Йенсена инкубировали в течение 10 дней при температуре +31 °С, после чего на косяке плотной среды оценивали наличие и интенсивность роста колоний. Минимальной бактерицидной концентрацией (МБК) соединения считали то его количество, после инкубации с которым на среде Левенштей-на-Йенсена роста колоний M.lufu не наблюдалось [1].
Для статистической обработки данных использовали программу «BioStat 2009».
Визуальная оценка посевов на среде Школьниковой показала, что под действием дапсона среда оставалась прозрачной при концентрациях 128 - 32 мкг/мл, далее наблюдали появление роста. В рядах пробирок с разведениями субстанции ПЯТd10 неполную прозрачность среды наблюдали уже при концентрациях 64 - 32 мкг/мл. При увеличении разведения отмечали интенсивное помутнение, что дало основание предполагать активизацию роста микобактерий, обусловленную снижением активности производного относительно тестштамма при меньших концентрациях (таблица 1).
Таблица 1 — Показатели визуальной оценки активности соединения ПЯТ d10 в отношении роста М. lufu (среда Школьниковой)
Субстанции Концентрация субстанции, мкг/мл
128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25
Дапсон - - - + + + ++ +++ +++ +++
ПЯТ d10 - +- +- ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Примечание: «-» - полная прозрачность среды; «+-» - неполная прозрачность среды; « +» - слабый рост; « + + » - умеренный рост; « + + + » - интенсивный рост.
Первичная (визуальная оценка) позволила определить МПК производного ди-азинона ПЯТd10 - 128 мкг/мл, в то время как для дапсона МПК была равна 32 мкг/мл.
Анализ мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, показал, что доля КУМ в ряду разведений ПЯТd10 (по результатам 6 пересевов) составила при концентрации активного вещества 128 мкг/мл 25,4 ± 3,2%, достигала 35,7±2,2% при 32 мкг/мл, а при его дальнейшем снижении повышалась до 50,4 ± 1,4% - 52,6±3,8% и оставалась таковой даже при минимальной концентрации.
При исследовании мазков, окрашенных по Murohashi, под действием субстанций ПЯТd10 выявлено снижение содержания живых форм микобактерий. Доля нежизне-
способных бактерий уменьшалась с увеличением разведения: насчитывалось от
20±1,1% (при самых высоких концентрациях соединений) до 65,3±5,1% (при минимальной концентрации) жизнеспособных форм.
Оценка наличия и интенсивности роста М. lufu на среде Левенштейна - Йенсена показала, что в ряду посевов с ПЯТd10 (n=6) при концентрациях 128 - 64 мкг/мл видимый рост колоний отсутствует, однако среда изменила цвет. Далее, соответственно разведениям, наблюдали увеличение интенсивности роста: от единичных до многочисленных, но атипичных колоний, образующих сплошной массив на косяке среды. Результаты исследования согласуются с полученными ранее данными [3].
Выводы
В результате исследования установлено, что новое производное диазинона - ПЯТd10 проявляет как бактериостатические, так и бактерицидные свойства в отношении М. lufu в концентрации 128 мкг/мл, в то время как препарат сравнения дапсон оказал бактериостатическое действие уже при 32 мкг/мл.
28
Фармация и фармакология. № 5 (12), 2015
Исходя из того, что исследуемое соединение nHTdlO оказало как бактериостатическое, так и бактерицидное действие, в то время как дапсон оказал лишь бактериостатический эффект, можно предположить, что производные диазинона являются перспективным направлением поиска фармакологически активных субстанций с антимикобактериальной активностью.
Библиографический список
1. Иртуганова, О.А. Использование M.lufu для первичного отбора противолепрозных препаратов / О.А. Иртуганова, Н.Г. Урляпова // В кн.: Актуальные вопросы лепрологии. -Астрахань, 1984. - С.147-150.
2. Кодониди, И.П. Молекулярное конструирование N-замещенных производных 1,3-диазинона-4 // Фармация. - 2010. - №1. - С. 36-40.
3. Оценка антимикобактериальной активности некоторых новых производных диазинона / С.А. Лужнова, Н.М. Габитова, А.В. Воронков и др. // Фундаментальные исследования. - 2015. - №2, ч.11. - С. 2377-2380.
4. Синтез и противовоспалительная активность амидов антраниловой кислоты с фрагментами сульфаниламидов и дапсона/ В.С. Сочнев, И.П. Кодониди, Э.Т. Оганесян и др.// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. - Пятигорск, 2013. - Вып.68. - С. 344-346.
5. Wozel, Gottfried. Dapsone in dermatology and beyond / Gottfried Wozel, Christian Blasum // Arch. Dermatol. Res. - 2014. - Vol. 306(2). - P. 103-124.
it it it
Воронков Андрей Владиславович - доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии Пятигорского медикофармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУМинздрава России. Область научных интересов: поиск веществ, обладающих эндотелиопротективной активностью, разработка путей фармакологической коррекции состояний, возникающих у лиц, испытывающих постоянное экстремальное физическое и психоэмоциональное напряжение, в том числе в спорте высоких достижений, правовые аспекты спортивной медицины, инновационные подходы в сфере постдипломного образования специалистов. E-mail: prohor.77@mail.ru.
Лужнова Светлана Алексеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Научно-исследовательский институт по изучению лепры Минздрава России. Область научных интересов: поиск и разработка субстанций синтетического, растительного, животного, минерального происхождения, обладающих антибактериальной активностью, поиск корректоров дапсон-индуцированных нарушений, оптимизация схем противолепрозной терапии. E-mail: s.luzhnova@yandex.ru.
Кодониди Иван Панайотович - доктор фармацевтических наук, доцент кафедры органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России. Область научных интересов: исследования в области поиска и целенаправленного синтеза новых биологически активных веществ в ряду производных 1,3-диазинона-4, изучение взаимосвязи «структура - биологическая активность». E-mail: sochnevvad@gmail.com.
Габитова Нармина Муталлимага-кызы - младший научный сотрудник Научноисследовательский институт по изучению лепры Минздрава России. Область научных интересов: поиск веществ, обладающих антибактериальной активностью, микробиологическая оценка эффективности применяемых антибактериальных препаратов в области лепрологии. E-mail: narmina85@inbox.ru.
29
Фармация и фармакология. № 5 (12), 2015
Ловягина Светлана Александровна - аспирант кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России. Область научных интересов: поиск веществ, обладающих противолепрозной активностью, изучение острой и хронической токсичности соединений, изучение противовоспалительных свойств соединений. E-mail: Svetalov91@mail.ru.
Сочнев Вадим Сергеевич - аспирант кафедры органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России. Область научных интересов: синтез новых биологически активных соединений и изучение взаимосвязи «структура - биологическая активность» в ряду серосодержащих производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников. E-mail: sochnevvad@gmail.com.
30
