Изучение антагонистической активности штамма E. coli M-17 in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 579

Н. С. ХИШТОВА

ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММА Е. COLI М-17 IN VITRO

Кафедра общей гигиены и микробиологии Адыгейского филиала Кубанского государственного медицинского университета, г. Майкоп

Введение

В настоящее время является непреложным тот факт, что организм человека и его нормальная микрофлора представляют собой подвижную, взаимовлияющую экосистему. Известно, что на состояние микробиоценоза кишечника оказывают влияние различные факторы как экзогенного, так и эндогенного происхождения, в том числе нарушения иммунитета, соматические и инфекционные заболевания, нарушения питания и медикаментозное воздействие [1, 2]. Глубокие изменения внешней среды, широкое, порой неадекватное использование антимикробных препаратов привели к тому, что состояние дисбактериоза у населения формируется во всех возрастных группах и с разной степенью выраженности. У детей до 1 года дисбактериоз кишечника регистрируется в 90%, а у подростков и у людей старше 60 лет - в 100% случаев, дисбиотические нарушения у молодых людей 1-19 лет - в 77% случаев [3].

Для лечения и профилактики дисбактериоза используется достаточно широкий круг эубиотиков - как в самостоятельном виде, так и в форме пробиотиков. Необходимость выбора того или иного эубиотика определяется возрастом, данными бактериологического анализа о стадии и виде дисбактериоза, клиническими проявлениями. Порой это длительные, затяжные сроки лечения, не приносящие существенных сдвигов к нормализации микрофлоры кишечника. Подбор эуби-отиков для коррекции микрофлоры кишечника ведется вслепую. Не изучается характер взаимоотношений, складывающихся между возбудителем дисбактериоза и вводимым препаратом эубиотика. Не изучена вероятность более сильного антагонистического действия возбудителя дисбактериоза на эубиотик.

Мы считали эти моменты важными для разработки направленного применения эубиотиков и возможностей контроля в динамике в системе эубиотик - возбудитель дисбактериоза. С этой целью мы выбрали экспериментальную модель, состоящую из эубиотика E. coli M-17 и возбудителей дисбактериоза, выделенных в лаборатории от больных. Нами были поставлены задачи:

1. Изучить динамику изменения КОЕ обеих составляющих системы E. coli М-17 плюс возбудитель дисбактериоза при смешанном культивировании.

2. Определить частоту эффективности антагонистического действия E. coli М-17 в системе.

Материалы и методы

Штамм E. coli М-17, использованный в данной работе, получен из биотерапевтического препарата (БТП) колибактерин АО «Биомед», серия 100-10402. Индикаторные штаммы (ИШ), выделенные из кишечника людей с диагнозом дисбактериоза, превышали нормы для кишечной микрофлоры [4]. Использовано 58 культур энтеробактерий, 59 культур S. aureus и 20 культур дрожжеподобных грибов Candida spp. Биохимическую

идентификацию энтеробактерий проводили при помощи ПБДЭ, принадлежность к роду Candida с использованием морфологических критериев и теста на фила-ментацию, S. aureus - по общепринятой методике [5].

Антагонистическую активность штаммов E. coli M-17 in vitro определяли по отношению к условно-патогенным и патогенным индикаторным бактериям методом смешанной культуры [6]. Для этого 0,1 мл 16-часовой культуры E. coli M-17 из разведения 10-6 смешивали с 0,1 мл 16-часовой культуры индикаторных штаммов из разведения 10-7 и инкубировали при 37° С 10 минут. Производился высев контрольных образцов индикаторных штаммов и штамма E. coli М-17 в 0 часов из разведения 10-7 и 10-6 соответственно. После 18-20 часов инкубирования при 37° С производили количественный учет выросших колоний с учетом морфологии колоний и биохимических свойств бактерий на дифференциально-диагностических средах. Для изучения антагонистической активности штамма E. coli M-17 к S. aureus использовали агар для культивирования микроорганизмов (МПА), к энтеробактериям - Endo agar, к дрожжеподобным грибам рода Candida - питательную среду № 2 для контроля микробной загрязненности. От больных дисбактериозом были выделены бактерии семейства Enterobacteriaceae: a) Klebsiella spp.; б) E. coli с характеристиками: лактозонегативные, гемолитические, со сниженной ферментативной активностью; в) Enterobacter spp.; г) Citrobacter spp; д) Proteus spp.; е) Edwardsiella spp.

Результаты

Вначале мы суммировали все результаты по энтеробактериям по 3 группам:

1-я - исходная величина КОЕ, полученная в результате самостоятельного культивирования штаммов.

2-я - выделялись и суммировались результаты опытов, в которых при совместном культивировании с E. coli M-17 получали данные ИШ ниже исходных КОЕ.

3-я - выделялись и суммировались результаты опытов, в которых при совместном культивировании с E. coli M-17 получали данные ИШ выше исходных величин КОЕ. В каждой группе обсчитывались данные по КОЕ у E. coli M-17 и индикаторных штаммов. Соотношение исходных величин КОЕ индикаторных штаммов к E. coli M-17 у энтеробактерий составляло 1:1.

Обсуждение

Энтеробактерии

Рост 55,3 +6,6 % штаммов энтеробактерий (табл.1, 3) подавлялся антагонистическим действием E. coli M-17 в

2,7 раза (n=31). КОЕ (М1+т1) 215,6 +9,3 до и (М2+т2) 77,3 + 8,8% после контакта. Соотношение энтеробактерий и E. coli М-17 в этой группе составило 1: 4,7 соответственно с увеличением числа КОЕ E. coli М-17 после совместного культивирования в 1,7 раза. В 3-й группе число КОЕ эн-

теробактерий увеличилось в 2 раза по сравнению с исходными цифрами. В итоге резко тормозилась активность E. coli М-17. Их количественные соотношения составили 2,4:1 соответственно, с незначительным уменьшением числа КОЕ эубиотика в сравнении с исходной величиной. Изучив суммарные результаты по энтеробактериям, мы решили детализировать и вычленить отдельные роды. В итоге сформировались 3 подгруппы.

Первая - представители рода Klebsiella - 24 штамма.

Вторая - E. coli (E. coli lac-; Hly +; с измененной ферментативной активностью) - 17 штаммов, которые в дальнейшем будут именоваться «эшерихии».

Третья - представители родов Enterobacter, Citrobacter -17 штаммов, в дальнейшем именуемых «прочие энтеробактерии».

Из полученных результатов (табл. 1, 3) следует, что наибольший антагонистический эффект штамма E. rali M-17 проявляется по отношению к I подгруппе (Klebsiella spp.). Подавление бактерий рода Klebsiell произошло в 66,6±9,6% случаев (n=16), с уменьшением числа КОЕ после совместного культивирования с эубиотиком в 3 раза (М±т КОЕ 224,6 ± 19,8 до и 76,1± 10,1% после контакта). Соотношение УПБ и эубиотика составило 1:6,9, тогда как исходный показатель КОЕ культур был 1:1. Отмечается увеличение количества КОЕ E. coli M-17 в 2,5 раза. В 33,4 ± 9,6% случаев (n=8) прослеживается отсутствие антагонистического эффекта эубиотика, которое сопровождается увеличением числа КОЕ Klebsiella spp. в 1,5 раза. При этом показатель КОЕ эубиотика оставался на прежнем, исходном уровне. Соотношение Klebsiella spp. и E. Mli М-17 в данном случае составляло 1,8:1 соответственно.

В третьей подгруппе - «прочие энтеробактерии» рост более половины исследуемых штаммов (52,9 ± 12,1%) также подавлялся биологическим действием колибактерина в 3,4 раза (М ± m КОЕ 203,8 ±19,0 до и 60,4 ± 12,9 после контакта), но соотношение КОЕ УПБ и эубиотика было невысоким - 1:1,8. В остальных случаях (47,1 ± 12,1% ) рост УПБ в этой подгруппе увеличивался в 1,8 раза и, соответственно, угнетался рост КОЕ эубиотика в 2,8 раза по сравнению с исходными данными. Соотношение УПБ и E. coli M-17 в данном случае составило 4,9:1 соответственно.

И, наконец, во второй подгруппе - «эшерихии» только в 40,0 ± 12,6% случаев (n=6) проявился антагонистический эффект E. coli М-17 с уменьшением количества КОЕ УПБ в 2,3 раза. М±т КОЕ 214,7 ± 16,5 до и 95,2 ± 11,6% после контакта. Соотношение «эшерихий» и

E. coli М-17 после культивирования также было невысоким: 1:1,6. Тогда как в 60,0 ± 12,6% случаев число КОЕ «эшерихий» увеличивалось в 3 раза с соотношением 2:1 к эубиотику. Следует при этом отметить и увеличение количества КОЕ E. coli М-17 в 1,5 раза.

Стафилококки

При соотношении числа КОЕ стафилококков (табл.

2, 3) к эубиотику до контакта 1,2:1 рост патогенного стафилококка в 78,4 ± 5,8% случаев (n=48 ) подавлялся антагонистическим действием E. coli М-17 в

2.3 раза. После контакта соотношение культур составило 1:2,3 соответственно. В 21,6 ± 5,8% случаев наблюдалось увеличение числа КОЕ стафилококков почти в 4 раза (М1±т1 КОЕ 254,8 ± 12,8; М2±т2 КОЕ

987.3 ± 74,9%). В этом случае соотношение патогена к эубиотику составило 2,7:1. Также как и в случае с подгруппой «эшерихии», при отсутствии антагонистического эффекта отмечалось увеличение КОЕ E. coli М-17в 1,7 раза (М1±т1 КОЕ E. coli М-17- 209,7 ± 5,0 до и М2±т2-360,4 ± 72,2% после контакта).

Дрожжеподобные грибы рода Candida

Исходный уровень Candida (табл. 2, 3) до

совместного культивирования (n=20) составил 69,6 ± 1,4% (М1±т2). Соотношение исходных величин КОЕ индикаторных культур и E. coli М-17 - 1:3. После контакта в подгруппе Candida с подавлением роста возбудителя (n=11) число КОЕ дрожжеподобных грибов составляло 15,7 ± 3,7% (М1±т2), т. е. рост культур угнетался в 4,4 раза -55,0 ± 11,1% случаев. При этом отмечается и уменьшение числа колоний E. coli М-17 в 4,9 раза. Соотношение возбудителя дисбактериоза и E. coli М-17 осталось практически на исходном уровне - 1:2,7. В 45% Candida оказались устойчивыми к антагонистическому действию эубиотика (n=9). Число КОЕ индикаторных штаммов увеличилось в 2,2 раза. Более того, в этой подгруппе проявилось резко выраженное подавляющее действие кандид на E. coli М-17, количество которых в смеси было в 8,4 раза меньше и по сравнению с исходным уровнем КОЕ уменьшилось в 11 раз.

Выводы

По результатам нашей работы установлено, что штамм E. coli M-17 из БТП колибактерин проявляет неоднородный антагонистический эффект по отношению к исследованным условно-патогенным и патогенным культурам. Установлена различная ингибирующая активность этого штамма к различным видам микроорганизмов.

Таблица 1

Изменение числа КОЕ индикаторных штаммов Enterobacteriaceae при совместном культивировании с E. coli М-17 (M ± m %)

№ Под- Уменьшение КОЕ Увеличение КОЕ

п/п группы % Кратность % Кратность

1 Enterobacteriaceae 55,3 ± 6,6 2,7 44,7 ± 6,6 2,1

2 I Klebsiella spp. 66,6 ± 9,6 3,0 33,4 ± 9,6 1,5

3 II «Эшерихии» 40,0 ± 12,6 2,3 60,0 ± 12,6 3,0

4 III «Прочие энтробактерии» 52,9 ± 12,1 3,4 47,1 ± 12,1 1,8

Таблица 2

Изменение числа КОЕ индикаторных штаммов S. aureus и Candida spp. при совместном культивировании с E. coli M-17 (M ± m %)

№ Индикаторные культуры Уменьшение КОЕ Увеличение КОЕ

% Кратность % Кратность

1 S. aureus 78,4 ± 5,3 2,3 21,6 ± 5,3 3,9

2 Candida. spp 55 ± 11,1 4,4 45 ± 11,1 2,2

Таблица 3

Соотношение КОЕ возбудителей дисбактериоза и КОЕ E. coli М-17 при совместном культивировании

В группе с подавлением В группе устойчивых

№ Исходные роста возбудителей к эубиотику возбудителей

п/п величины КОЕ M ± m n M ± m n

Энтеробактерии 215,6±9,3 77,3±8,8 31 456,2±44,8 25 P,11<0,001 Pi111 < 0,001

1 E. coli М-17 209,7±5,0 362,8±57,8 27 187,8±35,6 12 PM1=0,01 Р,11>0,5

Кратность изменения 1:1 1:4,7 2,4:1

Клебсиеллы 224,6±19,8 76,1±10,1 16 343,0±47,6 8 Pi11<0,001 P. .„=0,02 i-111 ’

2 Е. coli М-17 209,7 ± 5,0 527,6±83,4 16 187,1 ±44,7 7 Pi11<0,001 P.. >0,5 i-111 ’

Кратность изменения 1:1 1:6,9 1,8:1

«Эшерихии» 214,7±16,5 95,2±11,6 6 644,4±99,3 9 Pi11<0,001 Pi111<0,001

3 E. coli М-17 209,7 ± 5,0 152,5±34,8 4 319,7±96,2 7 F3.„=0,1 i-11 ’ P, >0,2 i-111 ’

Кратность изменения 1:1 1:1,6 2:1

«Прочие 203,8±19,0 60,4±12,9 9 357,5±35,8 8 Pi11<0,001 Pi111<0,001 Pi11<0,001 Pi-111<0,001

энтеробактерии»

4 E. coli М-17 209,7±5,0 106,3±7,9 7 72,9±14,9 8

Кратность изменения 1:1 1:1,8 4,9:1

Стафилококки 254,8±12,8 109,1 ±8,9 48 987,3±74,9 11 Pi11<0,001 P111<0,001

5 E. coli М-17 209,7±5,0 251,1±26,3 31 360,4±72,2 8 p11>0,1 i-11 ’ P <0,05 i-111 ’

Кратность изменения 1,2:1 1:2,3 2,7:1

Кандида 69,9±1,4 15,7±3,7 11 155,8±30,3 9 Pi11<0,001 p-111<0,01

6 E. coli М-17 209,7±5,0 42,2±7,0 11 18,6±5,3 9 Pi11<0,001 Pi-111<0,001

Кратность изменения 1:3 1:2,7 8,4:1

Биологическое действие E. coli M-17 выражено в большей степени к патогенным стафилококкам (78,4%) с кратностью уменьшения количества КОЕ E. coli M-17 как в группе с подавлением роста КОЕ патогенных стафилококков (в 1,2 раза), так и в группе устойчивых ИШ к действию эубиотика (в

1,7 раза).

Подавление роста энтеробактерий наблюдалось только в 55,3% случаев в 2,7 раза, а 44,7% штаммов энтеробактерий были нечувствительны к действию колибактерина с кратностью увеличения числа их КОЕ в 2,1 раза, т. е. можно говорить о слабом антагонистическом эффекте E. coli M-17 к энтеробактериям. Среди энтеробактерий наибольшее антагонистическое действие E. coli M-17 оказывает на «прочие энтеробактерии» (снижение КОЕ в 3,4 раза в 52,9% случаев) и клеб-сиеллы (снижение КОЕ в 3,0 раза в 66,6% случаев). Наименьшая на «эшерихии» - в 60% случаев отмечается нарастание КОЕ ИШ в 3,0 раза. После контакта E. coli M-17 с подгруппами «эшерихии» и «прочие энтеробактерии» в группах с подавлением КОЕ ИШ (II группа) наблюдается снижение числа КОЕ и самого исследуемого штамма E. coli M-17, что говорит о взаимном влиянии возбудителя дисбактериоза и эубиотика друг на друга.

Антагонистический эффект в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida проявляется также в половине случаев (55%) с кратностью уменьшения числа КОЕ ИШ в 4,4 раза. При этом отмечается снижение числа КОЕ эубиотика в группе с подавлением роста ИШ в 4,9 раза и в группе устойчивых к действию E. coli M-17 ИШ в 11,3 раза по сравнению с исходными данными.

Применение БТП колибактерин для подавления остаточной микрофлоры кишечника при дисбактериозе необходимо сопровождать мониторингом антагонистической активности E. coli M-17 к условно-пато-

генным микроорганизмам, выделенным из организма больного.

Поступила 20.09.2006

ЛИТЕРАТУРА

1. Бондаренко В. М., Боев Б. В., Лыкова Е. А. и др. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта // Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 1998, № 1. С. 66-72.

2. Блохина И. Н. Дорофейчук В. Г. Дисбактериозы // Медицина, 1976. С. 175.

3. Леванова Л. А., Алешкин В. А., Воробьев А. А. и др. // Журн. микроб. 2001. № 3. С. 72-75.

4. Леванова Л. А., Сурикова Е. В. // Журн. микробиол. 2001, № 1. С. 69-71.

5. Приказ 535. Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ. МЗ СССР от 34.04.85.

6. Bhatia S. J., Kochaz N., Abraham P. et al. // J. Clin. Microbiol. 1989. V. 27. Р. 2328-2330.

N. S. HISHTOVA

THE STUDY OF THE ANTAGONISTIC ACTIVITY OF E. COLI M-17 IN VITRO

The antagonistic activity at combined culturing with indicator strains (IS), allocated at dysbacteriosis of intestine is studied. Biological activity of aubiotik is more expressed to pathogenic staphylococci and enterobacteria, particularly in subgroups «other enterobacteria» and «clebsielly».

Candida and subgroup «esherichia» snow some stability to the action of the preparation and besides, decrease COE of the last one.

Key words: antagonistic activity, aubiotik, indicator strain.

Н. С. ХИШТОВА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АНАЛИТА

Кафедра общей гигиены и микробиологии АФ КТМУ

Введение

Используемые в дезинфекционной практике химические средства должны отвечать определенным требованиям: в малых концентрациях и в наиболее короткие сроки убивать микробы, в то же время являться безвредными для человека; быстро и полностью растворяться в воде, образуя стойкие смеси; оказывать бактерицидное действие даже при наличии защитных органических веществ в обеззараживаемой среде; не разрушать обеззараживаемые объекты; сырье для их производства должно быть недорогим и широкодоступным [1]. За рубежом и в России широко используется препарат аналит (гипохлориду натрия) [1], получаемый при электрофорезе 5-10%-ного раствора натрия хлорида на электрохимических установках. Используемый нами аналит получают на установке типа СТЭЛ -10Н-120-01. Содержание активного хлора составляет 0,05%. По данным некоторых авторов [3], препарат

обладает бактерицидным, фунгицидным, вирулицид-ным, спороцидным и антибактериальным действием и используется для дезинфекции изделий медицинского назначения, поверхностей помещений, сантехоборудования, предметов ухода за больными. Для обеззараживания использованной лабораторной посуды и обработки поверхностей помещений применяют 0,05%-ный раствор аналита. Экспозиция дезинфекции лабораторной посуды, по разным авторам, составляет от 30 до 60 минут [3, 6]. Поверхности помещений, по действующим инструкциям [6], рекомендуется обрабатывать раствором аналита дважды с интервалом в 30 минут, что при больших площадях практически трудноосуществимо. При изучении эффективности каждого конкретного средства и допуске его в медицинскую практику определяют бактерицидное действие препарата установленной концентрации с требуемой экспозицией, кратностью обработки и спектром антимикробного действия [2].

УДК 579