CC BY
22
ФАРМДиЕВТПЧЕСКПЕ НАУКИ
ИЗУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО И ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ MACLEAYA CORDATA (WILLD R. BR.)
Бушуева Гульнара Раисовна
К.фарм.н, старший научный сотрудник ФГБНУВИЛАР, Москва
Многочисленными исследованиями показано наличие широкого спектра биологического действия бензо[с]фенантридиновых алкалоидов: противовоспа ли-тельное, антимикробное, противогрибковое, адренолити-ческое, симпатолитическое, противосудорожное, анти-пролиферативное, местное анестетическое, включая их цитотоксичность против нормальных и раковых клеточных линий человека [5,6,7]. На данный момент в России (РФ) маклейя сердцевидная и маклейя мелкоплодная являются единственными источниками бензо[с]фенантри-диновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, используемых в фармакологии при изготовлении антимикробного препарата «Сангвиритрин». На территории РФ в естественных условиях маклейя не произрастает, оно введено в культуру и выращивается в основном в южных районах европейской части России (Краснодарский край) [3].
В качестве альтернативы нами предложен способ выращивания маклейи сердцевидной путем введения рас-тигельных клеток в культуру in vitro. Данный метод можно рассматривать как одно из возможных направлений в решении проблемы сырьевой базы с полноценным содержанием биологически активных веществ в короткие сроки. В предыдущих работах нами было установлено, что суспензионная культура маклейи сердцевидной (M.cordata) способна синтезировать бензо[с]фенантриди-новые алкалоиды, в частности сангвинарин, хелирубин и их дигидропроизводные, а также было доказано наличие бактериостатической и фунгистатической активности данных алкалоидов [1,2].
В связи с отсутствием в литературе сведений об аминокислотном составе и содержание жирных кислот клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.) и учитывая, значимость данной группы БАВ, был изучен качественный и количественный состав аминокислот и жирных кислот.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служила сухая клеточная культура Macleaya cordata (WilldR. Br.). Изучаемая суспензионная культура была получена в ГНУ ВИЛАР из листовой почки маклейи сердцевидной, которая была привезена из Китая и была введена в культуру на интродукционном участке института. Культивирование суспензионной клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.) в культуре in vitro поддерживалось в жидкой питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга в круг-лодонных колбах, на вращающейся подвесной качалке, в термостатируемом помещении при температуре 26±1°С в темноте. Правило асептики и приемы посадки общепринятые [4].
Исследования проводились с клеточной культурой Macleaya cordata (Willd R. Br.) в возрасте 21 суток, отделяли из культуральной жидкости путем фильтрования через бязевый материал и высушивали до сухого состояния.
ВЭЖХ аминокислот. Изучение состава аминокислот в сухой клеточной культуре Macleaya cordata (Willd R. Br.) осуществлялось с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США) с градиентным насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 мл/мин. Прибор оборудован диодноматричным спектро-фотометрическим детектором (СДДМ) и флуориметриче-ским детектором, автосамплером, а также системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation, Agilent. В качестве неподвижной фазы использовался сорбент Hypersil AA-ODS с размером частиц 5 мкм. Хроматографическая колонка Agilent, длина колонки - 200 мм, диаметр - 2,1мм. Температура колонки -40,0 0С. При проведении анализа использовали инжектор, поэтому предколоночную дериватизацию проводили в «микровиалках», с помощью шприца помещали 50 мкл боратного буфера, 10 мкл ОРА комплекса (ортофталевый альдегид в присутствии меркаптопропионовой кислоты), 10 мкл образца, перемешивали, набирали в шприц и обратно 5-10 раз, и вводили пробу 10 мкл. Вводить пробу необходимо сразу же, так как ОРА комплексы не стойкие и разрушаются в течение 2-5 мин.
Приготовление раствора ОРА - реагента. В 1 мл метанола растворяют 50 мг о-фталевого альдегида, добавляют 40 мкл 3 - меркаптопропионовой кислоты и доводят объем до 10 мл 0,4 Н водным раствором бората натрия (рН=10,4).
Приготовление рабочих стандартных растворов аминокислот. В качестве стандартных образцов использовались: таурин, цитруллин, орнитин (Sigma, Fluka). 25 мг (точная навеска) аминокислоты переносят в мерную колбу вместимостью 250,0 мл, до половины заполненную 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем ратвора до метки и тщательно перемешивают.
Газо-жидкостная хроматография липидов. Исследование липофильной фракции сухой клеточной культуры Mac^ya cordata (Willd R. Br.) проводили методом ГЖХ на приборе Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300 Mega Series (Италия) с пламенно ионизационным детектором с использованием программно - аппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных «Multichrom for Windows».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Аминокислоты определяли методом ВЭЖХ с пред-колоночной дериватизацией ортофталевым альдегидом в присутствии меркапто-пропионовой кислоты (ОРА- реагент).
Подготовка к анализу
Приготовление подвижной фазы А. 1,36 ± 0,025 г тригидроацетата натрия помещали в мерный стакан вместимостью 1000 мл, добавляли 500 мл дистиллированной воды, 90 мкл триэтиламина и перемешивали. С помощью
1-2% уксусной кислоты доводили рН до 7.20, добавляли 1,5 мл тетрагидрофурана, перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фторопластовый фильтр, с диаметром пор 0,45 мкм.
Приготовление подвижной фазы В. 1,36 ± 0,025 г тригидроацетата натрия помещали в мерный стакан вместимостью 500 мл, добавляли 100 мл дистиллированной воды и перемешивали до полного растворения. С помощью 1-2% уксусной кислоты доводили рН до 7.20, добавляли 200 мл метанола и 200 мл ацетонитрила. Полученный раствор фильтровали через мембранный фторопластовый фильтр, с диаметром пор 0,45 мкм.
Пробоподготовка Измельченную сухую культуру маклейи (около 1,0 мм) в количестве 10,0 г помещали в
мерную колбу вместимостью 250 мл, добавляли до половины объема подогретого до 45°С 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, встряхивали на аппарате для встряхивания в течение 15-20 минут, охлаждали до комнатной температуры, доводили 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до метки и тщательно перемешивали. Фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента», затем через тефлоновый фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Аминокислоты обнаруживали как по поглощению в УФ-области спектра при длине волны Х=338 нм (реф. Х=390нм) и Х=262нм (реф Х=324нм), так и по флуоресценции: при Хех=340нм и Хет=450нм до 14,5 минут и при Хех=266нм и Хет=305нм далее до конца анализа (рис. 1).
Рисунок 1. Хроматограмма аминокислот из сухой клеточной культуры Macleaya cordatа (Willd R. Br.)
Расчет проводили методом абсолютной градуировки. Полученные результаты анализа свободных аминокислот в пересчете на сухое сырье представлены в табл. 1
Таблица 1
_Результаты аминокислотного анализа сухой клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.)_
Наименование аминокислоты
Содержание в образце, мг/ 100 г
Сумма аминокислот, из них:
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Серин
Гистидин
Глицин
Треонин
Аланин
Аргинин
Тирозин
Цистин
Валин
Метионин
Фенилаланин
Триптофан
Изолейцин
Лейцин
Лизин
39,53 1,28 1,66 2,34 13,53 0,19 0,64 1,11 1,07 0,48 0,29 0,07 1,77 0,15 0,21 0,22 1,21 0,31
Из таблицы видно, что суммарное содержание аминокислот в сухой клеточной культуре Macleaya cordata (Willd R. Br.) было равно 39,53 мг/100 г, среди которых идентифицированы 17 аминокислот.
Около 34,2 % от суммарного содержания аминокислот составляла аминокислота гистидин (13,53 мг/100 г). На долю остальных аминокислот приходилось 65,8 % (26 мг/100 г), среди которых преобладали такие аминокислоты, как серин - 5,9%, метионин - 4,5%, глутаминовая кислота - 4,2%, аспарагиновая кислота - 3,23%, лейцин -3,1%, аланин - 2,8%, аргинин - 2,7%. Суммарное содержание остальных аминокислот не превышало 6,5%.
Из определенного пула аминокислот 9 из них являются незаменимыми для организма человек (треонин, ва-лин, метионин, лейцин, лизин, изолейцин, аргинин, фе-нилаланин, гистидин), на долю которых приходится 43,5% от общей суммы аминокислот.
Для изучения состава жирных кислот было получено гексановое извлечение путем экстракции навески сырья - сухой клеточной культуры маклейи (10 г) в аппарате Сокслета при температуре 40±5 °С. Полученное извлечение упаривали под вакуумом. Остаток (сумма липидов) представлял собой маслянистую легкоподвижную, мутную жидкость зеленовато - желтого цвета.
Пробоподготовка: 20,0 мг суммы липидов поме-
щали в пробирку емкостью 2 мл, добавляли 0,2 мл диэти-лового эфира, 1,0 мл метанола и 3 капли хлористого ацетила. Пробирку присоединяли к обратному холодильнику, нагревали в течение 1 часа и упаривали растворители в вакууме при комнатной температуре до удаления хлори-
стого водорода. Образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот растворяли в 0,2 мл гексана и анализировали на газовом хроматографе. Хроматограмма липидов, содержащихся в сухой клеточной культуре Macleaya cordata (WilldR. Вг.), представлена на рисунке 2.
№
l.L.„
LLIilI !
Рисунок 2. Хроматограмма жирных кислот в сухой клеточной культуре Macleaya cordata (Willd R. Br.)
Условия анализа
Хроматографическая колонка - Chrompack Capillary column test Reporp CP 7420, длина 100 мм, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки неподвижной жидкой фазы 0,25 дм; температурный режим - термостат колонок: 110°С (10 мин), 175°С (15 мин), 200°С (5 мин), температура инжектора - 260°С, температура детектора -240°С. Газ - носитель - азот, скорость подачи элюента 2мл/мин.
Идентификацию жирных кислот проводили путем сравнения индексов удерживания отдельных компонентов анализируемой смеси со стандартами. Количественное определение отдельных жирных кислот определяли на интеграторе C-R6A Chromatopac фирмы Shimadzu.
Расчет проводили методом внутренней нормализации площадей пиков с использованием автоматической системы обработки данных (все компоненты смеси, представленные на хроматограмме составляют 100%).
В результате сопоставления пиков в сухой клеточной культуре Macleaya cordata (Willd R. Br.) было идентифицировано 26 жирных кислот, в том числе непредельные эссенциальные - линолевая и линоленовая. В общей сумме преобладали олеиновая, линолевая, пальмитиновая, а - линоленовая и бегеновая жирные кислоты. Они составляют около 85 % от всей суммы всех жирных кислот (табл. 2).
Таблица 2
Содержание жирных кислот в сухой клеточной культуре Macleaya cordatа (Willd R. Br.)
Название жирных кислот Индекс ЖК Содержание, % от суммы кислот
Каприловая 8:0 0,01
Каприновая 10:0 0,07
Лауриновая 12:0 1,76
Тридекановая 13:0 0,02
Миристиновая 14:0 1,52
Миристолеиновая 14:1 0,06
Пентадекановая 15:0 0,37
Пентадеценовая 15:1 0,09
Пальмитиновая 16:0 22,94
Гексадеценовая 16:1 0,48
Пальмитолеиновая 16:1 9 - цис 0,91
Маргариновая 17:0 0,28
Гептадеценовая 17:1 0,07
Стеариновая 18:0 4,62
Олеиновая 18:1 9 - цис 10,49
Вакценовая 18:1 11 - транс 1,76
Линолевая 18:2 42,93
у -линоленовая 18:3 омега - 6 0,15
а - линоленовая 18:3 омега - 3 8,01
Арахиновая 20:0 0,89
Гондоиновая 20:1 0,29
Эйкозадиеновая 20:2 0,04
Эйкозатриеновая 20:3 0,07
Арахидоновая 20:4 0,26
Бегеновая 22:0 1,15
Эруковая 22:1 0,76
Выводы
Впервые изучен аминокислотный состав сухой клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.) методом ВЭЖХ. Суммарное содержание аминокислот в сухой клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.) равно 39,53 мг/100 г, среди которых было идентифицировано 17 аминокислот, в том числе 9 незаменимых. Исследован состав жирных кислот сухой клеточной культуры Macleaya cordata (Willd R. Br.) методом ГЖХ. Было идентифицировано 26 жирных кислот, в том числе эссенциальные - ли-нолевая и линоленовая.
Литература
1. Бушуева Г. Р., Савина Т. А., Быков В. А. Изменение содержания бензо[с]фенантридиновых алкалоидов в суспензионной культуре маклейи сердцевидной Macleaya cordata (Willd R. Br.) при длительном субкультивировании. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2009. №1. С. 3-6.
2. Бушуева Г.Р., Савина Т. А.,Фатеева Т. А.,Быков В. А. Культура клеток Macleaya cordata (Willd R. Br .) -источник антимикробных биологически активных веществ // Вопросы биологической медицинской и
фармацевтической химии. 2010. №2. С. 33-38.
3. Вичканова С.А., Колхир В.К., Крутикова Н.М., Адгина В.В., Фатеева Т.В., Сокольская Т. А. В кн.: «Химия. Технология.медицина» Сб. науч. трудов, посвящ. 70-летию Всер. н.-и. института лекар. и аром. растений, 300. (2000).
4. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук Е. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка.-1980.- 488 с.
5. Bai L.P., Zhao Z.Z., Cai Z.W., Jiang Z.H.: DNA-binding affinities and sequence selectivity of quaternary benzophenanthridine alkaloids sanguinarine, chelerythrine, and nitidine. Bioorg. Med. Chem. 14. 2006. pp. 5439-5445.
6. Das S., Kumar G.S., Ray A., Maiti M. Spectroscopic and thermodynamic studies on the binding of sanguinarine and berberine to triple and double helical DNA and RNA structures; Journal Biomol. Struct. Dynam. 20. 2003. pp. 703-713.
7. Vavreckova C., Ulrichova J. Biologicka aktivita kvartemich benzo[c]fenanthridinovych alkaloidu sanguinarinu a chelerytrinu; Chem. Listy. 88. 1994. pp. 238 - 248.
ДИНАМИКА РЫНКА ПАРАФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Черницова М.А.
ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ставрополь, Россия
Актуальность исследования. На протяжении последних лет наблюдается развитие всемирного рынка парфюмерно-косметической продукции (ПКП), мотивирующееся усиливающимся стремлением потребителей к приобретению действенных, многофункциональных и специализированных средств.
Цель исследования. Определить динамику развития рынка и выявить основные тенденции продажи ПКП.
Материалы и методы. Исследование основано на научных концепциях, освещенных в трудах отечественных и зарубежных авторов в области инновационного менеджмента фармацевтической отрасли, общей теории инновации и теории управления, статистической информации о развитии фармацевтического рынка РФ и потреблении ПКП, данных о состоянии фармацевтического рынка РФ и его субъектов на интернет- сайтах Минздрава РФ, Росстата, «РБК. Исследования рынков». Автором проведен анализ статей ведущих ученых - авторов в журналах «Ремедиум», «Российские аптеки», «Аптечный бизнес», «Фармацевтический вестник», «Косметика и медицина».
Результаты.
В ходе последнего десятилетия отмечается развитие мирового рынка парфюмерно-косметической продукции (ПКП), обосновывающееся все возрастающими потребностями потребителей получать новые эффективные, универсальные и специали зированные средства [12].
Парфюмерно-косметическая продукция (ПКП), согласно ГОСТу и Косметической директиве стран ЕС, предназначена только для наружного применения с целью очищения и (или) изменения внешнего вида кожи, волос, ногтей, губ, зубов, слизистой оболочки полости рта и наружных половых органов без нарушения их целостности, придание им приятного запаха и (или) коррекции запаха, поддержание их в нормальном функциональном состоянии [5].
Вопреки кризису, доля ПКП в сегменте продаж
растет.
Как было отмечено на ежегодной выставке Intercharm professional (г. Москва, апрель 2010г), индустрия красоты не столь сильно понесла убытки от экономического кризиса 2008-2009 гг. - всего 16% россиян сократили свои расходы на косметику. За минувшее десятилетие количество россиян, приобретающих ПКП в аптеке, возросло с 5 до 10%. К такому выводу пришли эксперты маркетингового агентства Nielsen на основе исследования индекса потребительского доверия в нашей стране. Однако рост ПКП был обеспечен, главным образом, ростом цен на импортную продукцию. По данным исследования Департамента консалтинга РБК "Российский парфюмерно-косметический ритейл: развитие в новых рыночных условиях", темпы прироста оборота ПКП составили в 2009 году 13-14%, что ниже темпов роста рынка в целом. Причина - снижение спроса за счет роста цен, сокращение доходов россиян. В 2010 году рынок начал постепенно восстанавливаться после кризиса, что связано с укреплением курса рубля, ростом доходов населения и повышением индекса потребительских ожиданий. Российские покупательницы постепенно начали увеличивать расходы на косметику и парфюмерию, возвращаясь к докризисному уровню трат. Все это увеличило доли сетей до 30-35% к 2011 году.
По оценке аналитиков (DISCOVERY Research Group) в 2012 году рост рынка парфюмерии и косметики составил 15% по сравнению с 2011 годом. Таким образом, объем рынка составил $13,8 млрд. При этом примерно $11,32 млрд. или 72% рынка составляет косметика.
Важную роль имеют лечебно-косметические товары, степень которых в объеме продаж образует около 20-30%, при этом наблюдается тенденция роста на 15-20% ежегодно. Наблюдается следующий ценовой диапазон в структуре продаж: преобладают ПКП стоимостью до 300 руб. - 60%, от 300 до 500 руб. - 25%, свыше 500 руб. - 15%.
