CC BY
61УДК 619: 615: 616.99
ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИМЕНЕНИЯ «ИНСПЕКТОР КВАДРО»
1М.В.Арисов - доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией;
2И.П.Белых - кандидат ветеринарных наук, ст.н.с.;1В.В.Артемов - аспирант.
1ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И.Скрябина», г.Москва (117218, г.Москва, Б.Черемушкинская, 28; e-mail: arisov_vet@mail.ru).
2ЗАО «Научно-производственная фирма «Экопром» (140070, Московская обл., Люберецкий р-н, пос. Томилино, ул.Гаршина, 11, литер Ф, а/я 917; e-mail: belykh@ekoprom.org).
В статье представлены результаты изучения аллергизирующих свойств нового комбинированного лекарственного препарата для ветеринарного применения «Инспектор Квадро» (празиквантел, фипронил, пири-проксифен, моксидектин), предназначенного для лечения и профилактики арахноэнтомозов, нематодозов, цестодозов у собак и кошек. Для исследования были взяты 50 морских свинок массой 300-320 г. Эпикутанную сенсибилизацию проводили на 40 морских свинках путем 20 повторных (по 5 раз в неделю) накожных аппликаций на участки боковой поверхности туловища без шерсти размером 2*2 см в дозе 0,05 мл (1 капля) раствора, нанося равномерным слоем на весь участок. Через 10 сут после сенсибилизации проводили кожную (эпикутанную), внутрикожную, конъюнктивальную и назальную пробы; сыворотку от сенсибилизированных и контрольных животных тестировали в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток (НРДТК). Для каждой пробы использовали 10 сенсибилизированных свинок и 10 несенсибилизированных - контроль (наносили физиологический раствор). При оценке эпикутанной пробы установлено, что в течение 72 ч после нанесения препарата сенсибилизированным и контрольным животным по характеру кожной реакции (отсутствие гиперемии, инфильтрации) обработанные участки не отличались у опытных и контрольных свинок. При постановке внутрикожной пробы по истечении 48 ч на коже сенсибилизированных и контрольных свинок было отмечено легкое шелушение. Зафиксированные отклонения в течение 12 ч наблюдения, при постановке конъюнктивальной и назальной проб в обеих группах свидетельствуют о слабовыраженном действии препарата на слизистые оболочки. Показатели, полученные при постановке реакции непрямой дегрануляции тучных клеток, не отличались в группах сенсибилизированных и контрольных животных, что также свидетельствует об отсутствии у препарата аллергизирующих свойств. На основании полученных результатов тестирования установлено, что препарат при 20-ти кратной накожной сенсибилизации в дозе 0,05 мл не вызывает аллергенной активности организма животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: лекарственный препарат, раствор, празиквантел, фипронил, пирипроксифен, моксидектин, сенсибилизация, дегрануляция, морские свинки.
Механизм развития аллергической реакции зависит от физико-химических свойств фармакологического средства, дозы, способа и продолжительности введения, способности соединятся с белками организма и др. В связи с этим аллергические реакции развиваются по «немедленному» или «замедленному» типу. Реакции немедленного типа развиваются быстро (10-20 мин), в механизме их участвуют как основное звено реакции антиген-антитело в тканях и в жидких тканевых средах организма, так еще одна составляющая в механизме возникновения аллергической реакции большое значение имеет высвобождение гистамина. Реакции замедленного типа развиваются в течение нескольких часов, иногда суток. Это в основном реакции пролиферативного типа, когда роль играют процессы раздражения эпидермальных соединительнотканных структур и формирование различных типов воспаления. Воспаление обусловлено действием медиаторов, которые высвобождаются из сенсибилизированных лимфоцитов [1, 2].
Исследование новых фармакологических средств на аллергенность должно включать в себя набор методов аллергодиагностики in vivo и in vitro, из которых в каждом конкретном случае можно выбрать оптимальное сочетание тестов, позволяющих выявить разные типы гиперчувствительности. Поскольку исследуемый препарат используют путем топикального (точечного) нанесения препарата на кожу плотоядным животным, выбраны тесты invivo: кожная (эпикутанная), внутрикож-ная, конъюнктивальная и назальная пробы; invitro: реакция непрямой дегрануляции тучных клеток (РНДТК).
Материалы и методы. Настоящие исследования проводили в соответствии Методическими указаниями по определению аллергенных свойств новых про-тивопаразитарных препаратов (2009), и руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005).
Аллергизирующие свойства препарата изучали на 50 морских свинках массой 300-320 г. Эпикутанную сенсибилизацию проводили на 40 морских свинках
ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕИ
путем 20 повторных (по 5 раз в неделю) накожных аппликаций на участки боковой поверхности туловища без шерсти размером 2x2 см в дозе 0,05 мл (1 капля) раствора, нанося равномерным слоем на весь участок.
Через 10 сут после сенсибилизации проводили кожную (эпикутанную), внутрикожную, конъюнктиваль-ную и назальную пробы; сыворотку от сенсибилизированных и контрольных животных тестировали в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток (НРДТК) [5]. Для каждой пробы использовали 10 сенсибилизированных свинок и 10 несенсибилизированных - контроль (наносили физиологический раствор).
Для проведения эпикутанной пробы препарат наносили на выстриженные участки кожи спины (2x2 см) в дозе 0,1 мл (близкая к рекомендованной для клинических испытаний терапевтическая доза). После нанесения препарата, через 15, 30 мин, 24, 48 и 72 ч осматривали кожный покров, состояние которого оценивали в баллах по следующей шкале: 0 - видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по периферии; 2 - ярко-розовая эритема по всему участку или по его периферии; 3 - красная эритема по всему участку; 4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы, образование корки; 5 - эритема, выраженная инфильтрация, корочки на коже, очаговые изъязвления, возможны геморрагии.
Для проведения внутрикожной пробы сенсибилизированным и контрольным животным (по 10 свинок) однократно вводили 0,01 мл препарата внутрикожно на выстриженном участке 1x1 см. Результаты учитывали через 20-30 мин (аллергическая реакция немедленного типа), через 4-6 ч (немедленно-замедленного типа), через 24 ч (замедленного типа). Отмечали реакцию кожи - возможные появления эритемы, инфильтрата.
Для конъюнктивальной и назальной проб на слизистую конъюнктивы (под верхнее веко) и носовой полости закапывали по 1 капле препарата сенсибилизированным и контрольным животным, соответственно. Оценку конъюнктивальной реакции проводили визуально под лупой при увеличении х2 через 15 мин (реакция немедленного типа) и через 24-48 ч (замедленного типа) по бальной шкале: 0 - видимых реакций нет; 1 -легкое покраснение слезного протока; 2 - покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице; 3 - покраснение всей конъюнктивы и склеры [3, 4].
При оценке назальной реакции учитывали состояние слизистой оболочки, наличие чихания и усиления секреции слизи в сопоставлении с контрольными животными.
Для постановки непрямой реакции дегрануля-ции тучных клеток (НРДТК) получали сыворотку от 10 сенсибилизированных животных. Тучные клетки выделяли из перитониальной жидкости 2-х белых крыс массой 300 г после внутрибрюшинного введения физиологического раствора с гепарином в объеме 8-10 мл, подогретого до 37°С. Затем, на предметные стекла, предварительно окрашенные 0,3% спиртовым
раствором нейтрального красного, наносили по 0,03 мл исследуемой сыворотки крови от опытных животных, тучных клеток и аллергена - препарат в разведении 1:100 [6]. Препараты микроскопировали под увеличением объектива х20, подсчитывали 100 клеток и среди них отмечали дегранулированные (НРДТК оценивали в процентах). Учет реакции: отрицательная - до 10% дегранулированных клеток; слабовы-раженная - 11-19%; положительная - 20-29%; резко положительная - 30% и выше.
В контрольную пробу брали тучные клетки и сыворотку крови от тех же свинок. Пробы микроскопировали и подсчитывали 100 тучных клеток, среди которых отмечали дегранулированные в процентах. Реакцию оценивали как отрицательную, если процент деграну-лированных тучных клеток в пробе не превышал 10.
Результаты исследований. При оценке эпику-танной пробы установлено, что в течение 72 ч после нанесения препарата сенсибилизированным и контрольным животным по характеру кожной реакции (отсутствие гиперемии, инфильтрации) обработанные участки не отличались у опытных и контрольных свинок. Реакция оценена по шкале в баллах: 0 - видимой реакции нет. Отрицательная кожная реакция свидетельствует об отсутствии гиперчувствительности немедленного и замедленного типа как у сенсибилизированных, так и контрольных животных.
При постановке внутрикожной пробы после введения препарата у сенсибилизированных и контрольных свинок на месте инъекции появилось покраснение в виде «пуговки». В течение 12 ч покраснение у животных обеих групп на месте введения препарата рассасывалось и постепенно переходило в бледно-розовый оттенок с мелким шелушением эпидермиса. По истечении 48 ч на коже сенсибилизированных и контрольных свинок было отмечено легкое шелушение.
Конъюнктивальная реакция при закапывании препарата не отличалась у сенсибилизированных и контрольных животных. В течение 1 ч отмечали покраснение всей конъюнктивы и склеры, в последующем покраснение уменьшалось. Через 24 и 48 ч не было отмечено каких-либо изменений слизистой оболочки и склеры глаз в обеих группах. При оценке назальной реакции установлено, что при закапывании испытуемого препарата наблюдали чихание, усиление секреции слизи и незначительную гиперемию слизистой оболочки в обеих группах. Через 24 и 48 ч никаких отклонений на слизистой оболочке носа отмечено не было.
Зафиксированные отклонения в течение 12 ч наблюдения при постановке конъюнктивальной и назальной проб в обеих группах свидетельствуют о слабовы-раженном действии препарата на слизистые оболочки.
О выраженности сенсибилизирующих свойств препарата судили по реакции дегрануляции тучных клеток. Тканевые тучные клетки и базофилы крови играют важную роль при аллергических реакциях,
принимая участие в высвобождении гистамина, гепарина, серотонина и др. Образующиеся при аллергии иммуноглобулины Е в комплексе с аллергеном, адсо-рбируясь на тучных клетках, способствуют высвобождению из них вазоактивных аминов, что выражает-
ся в их разбухании, образовании вакуолей и выхода содержимого клетки за ее пределы. Это явление называется дегрануляцией тучных клеток, что и фиксируем как положительную реакцию. Результаты исследований приведены в таблице.
Таблица
Результаты исследования реакции дегрануляции тучных клеток
№ животного Процент дегрануляции тучных клеток в опыте Процент дегрануляциитучных клеток в контроле Разница дегрануляции тучных клеток в опыте и контроле, %
1 5 6 1
2 7 8 1
3 6 7 1
4 8 7 1
5 7 5 2
6 6 5 1
7 5 7 2
8 6 6 0
9 8 7 1
10 7 6 1
M±m 6,5+0,77 6,4+0,69 1,1+0,4
Согласно полученным данным процент дегрануляции тучных клеток у опытных животных был на уровне 6,5±0,77, в контроле - 6,4±0,69. Считается, что препарат не обладает сенсибилизирующими свойствами, если количество дегранулированных тучных клеток в пробе не превышает 10%.
Заключение. Из проведенных исследований следует, что при эпикутанном, внутрикожном, конъюн-ктивальном и назальном тестировании наблюдается отсутствие гиперчувствительности немедленного и замедленного типа как у сенсибилизированных, так и контрольных животных. Отклонения, отмеченные в опытной и контрольной группах, при постановке конъ-
Литература
юнктивальной и назальной проб, свидетельствуют о слабо выраженном действии препарата на слизистые оболочки. Показатели, полученные при постановке реакции непрямой дегрануляции тучных клеток, не отличались в группах сенсибилизированных и контрольных животных, что также свидетельствует об отсутствии у препарата аллергизирующих свойств. Таким образом, на основании полученных результатов тестирования установлено, что лекарственный препарат для ветеринарного применения «Инспектор Квадро» при 20-ти кратной накожной сенсибилизации в близко терапевтической дозе не вызывает аллергенной активности организма животных.
1. Адо, А.Д. Общая аллергология / А.Д.Адо. - М.: Медицина, 1978. - 426 с.
2. Алексеева, О.Г. Аллергия к промышленным химическим соединениям / О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева. - М.: Медицина, 1978. - 271 с.
3. Курочкина, К.Г. Методические указания по определению аллергенных свойств новых противопаразитар-ных препаратов / К.Г.Курочкина. - М., 2009. - 15 с.
4. Методы определения сенсибилизации организма животных. Методические рекомендации. - Новочеркасск, 1987. - 31 с.
5. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных: приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. - М., 1977. - 7 с.
6. Радунская, С.Ф. Тест непрямой дегрануляции ТК крыс как метод оценки специфической активности инфекционных аллергенов: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 14.00.36 / С.Ф.Радунская. - М., 1982. - 16 с.
7. Фрадкин, В.А. Аллергодиагностика in vitro / В.А.Фрадкин. - М.: Медицина, 1975. - 143 с.
ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕЙ
STUDY OF ALLERGENIC PROPERTIES OF THE DRUG FOR VETERINARY USE "INSPECTOR QUADRO"
'ArisovM.V. - Doctor of Veterinary Sciences; 2Belykh I.P. - Candidate of Veterinary Sciences;
1Artemov V.V. - postgraduate.
1All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants
named after K.I.Skryabin (e-mail: arisov_vet@mail.ru).
JSC "Research and Production Company "Ekoprom" (e-mail: belykh@ekoprom.org).
The article presents the results of studying the allergenic properties of the new combined drug for veterinary use "Inspector Quadro" (praziquantel, fipronil, pyriproxifen, moxidectin) intended for the treatment and prevention of arachnoentomosis, nematodosis, cestodosis in dogs and cats. For the study, 50 guinea pigs weighing 300-320 g were taken. Epicutaneous sensitization was carried out on 40 guinea pigs by 20 repeated (5 times per week) cutaneous applications on the sides of the trunk without wool 2 x 2 cm in a dose of 0.05 ml (1 drop) solution, applying a uniform layer on the entire site. Ten days after sensitization, the cutaneous (epicutaneous), intradermal, conjunctival and nasal samples were performed; serum from sensitized and control animals was tested in an indirect mast cell degranulation (NTDT) reaction. 10 sensitized guinea pigs and 10 non-sensitized controls were used for each sample (saline was applied). When assessing the epicutaneous test, it was established that within 72 hours after the application of the preparation to the sensitized and control animals, the treated areas did not differ in the pattern of the skin reaction (absence of hyperemia, infiltration) in the experimental and control guinea pigs. When the intradermal test was performed after 48 hours, slight peeling was observed on the skin of the sensitized and control guinea pigs. Fixed deviations during 12 hours of observation, with conjunctival and nasal samples in both groups, indicate a mild effect of the drug on the mucous membranes. The indicators obtained during the reaction of indirect degranulation of mast cells did not differ in the groups of sensitized and control animals, which also indicated the absence of allergic properties in the preparation. On the basis of the obtained test results the preparation with a 20-fold cutaneous sensitization in a dose of 0.05 ml is not found to cause allergenic activity of animal's organism.
KEYWORDS: drug, solution, praziquantel, fipronil, pyriproxifen, moxidectin, sensitization, degranulation, guinea pigs.
References
1. Ado, A.D. Obshchaya allergologiya [General Allergology] / A.D.Ado. - M.: Medicine, 1978. - 426 p.
2. Alekseeva O.G. Allergiya k promyshlennym himicheskim soedineniyam [Allergy to industrial chemicals] / O.G.Alekseeva, L.A.Dueva. - M.: Medicine, 1978. - 271 p.
3. Kurochkina, K.G. Metodicheskie ukazaniya po opredeleniyu allergennyh svojstv novyh protivoparazitarnyh preparatov [Guidelines for determining the allergenic properties of new antiparasitic drugs] / K.G.Kurochkina. - M., 2009.
- 15 p.
4. Metody opredeleniya sensibilizacii organizma zhivotnyh. Metodicheskie rekomendacii [Methods for determining the sensitizing animals. Guidelines]. - Novocherkassk, 1987. - 31 p.
5. The Rules of work with experimental animals: order of the Ministry of Health of the USSR number 755 of 12.08.77.
- M., 1977. - 7 p.
6. Radunskaya, S.F. Test nepryamoj degranulyacii TK krys, kak metod ocenki specificheskoj aktivnosti infekcionnyh allergenov: abstract dis. ... candidate of biological sciences: 14.00.36 [Test of indirect degranulation of mast cells of rats, as a method of evaluation of the specific activity of infectious allergens] / S.F.Radunskaya. - M., 1982. - 16 p.
7. Fradkin, V.A. Allergodiagnostika in vitro [Allergodiagnostics in vitro] / V.A.Fradkin. - M.: Medicine, 1975. -143 p.
