CC BY
82
Информация об авторах:
Каукова Александра Николаевна - аспирант кафедры эндокринологии, e-mail: sandraef@mail.ru, 170642, Тверь, ул. Советская, д. 4; Белякова Наталья Александровна - заведующий кафедрой эндокринологии, профессор, д.м.н., e-mail: tverendo@mail.ru; Миллер Дмитрий Анатольевич - д.м.н., профессор кафедры факультетской терапии; Васюткова Ольга Алексеевна - заведующий диабетологическим центром города Твери.
Information About the Authors:
Kaukova Alexandra - postgraduate student of Department of endoalnology, e-mail: sandraef@mail.ru; Belyakova Natalia - MD, PhD, DSc, Professor, Head of the endokrinologiya, e-mail: tverendo@mail.ru; Miller Dmitriy -MD, PhD, DSc, Professor Department of
terapiya; Vasyutkova Olga - Head of the Diabetogy centr.
© ЩЕРБАТЫХ A.B., ЛЕОНОВА З.А., ШМАКОВ Д.А. - 2015 УДК 616.366-002-06-089.81
изучение активности щелочной фосфатазы в стенке желчного пузыря при желчнокаменной болезни
Андрей Викторович Щербатых, Зоя Алексеевна Леонова, Дмитрий Андреевич Шмаков (Иркутский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра факультетской хирургии, зав. - д.м.н., проф. А.В. Щербатых)
Резюме. В стенке желчного пузыря, удалённого у больных с желчнокаменной болезнью в период обострения, были изучены активность щелочной фосфатазы и концентрация глутатиона. Проанализированы данные, полученные для слизистого и серозного слоёв желчного пузыря. Корреляционный анализ показал взаимосвязь между показателями активности щелочной фосфатазы в слоях пузыря и не показал между активностью щелочной фосфатазой в стенке желчного пузыря и плазы крови.
Ключевые слова: желчный пузырь, щелочная фосфатаза, слизистый слой, серозный слой, глутатион.
alkaline phosphatase activity study in the wall of the gallbladder in cholelithiasis
A.V. Sherbatykh, Z.A. Leonova, D.A. Shmakov (Irkutsk State Medical University, Russia)
Summary. The gallbladder wall, remote in cases with acute cholecystitis alkaline phosphatase activity and the concentration of glutathione were studied. The data obtained for the mucous and serous layers of the gallbladder. Correlation analysis showed the relationship between the activity of alkaline phosphatase activity in the layers of the bladder and has not shown between the activity of alkaline phosphatase in the wall of the gall bladder and blood plaza.
Key words: gallbladder, alkaline phosphatase, mucous layer, serous layer, glutathione.
Со времён первого сообщения о щелочной фосфа-тазе (Robinson, 1921) прошло более 90 лет, но несмотря на это, биологическая функция и субстрат (субстраты) фермента in vivo не известны. Вместе с тем, чрезвычайная распространённость щелочной фосфатазы (ЩФ) в природе (бактерии, растительные и животные ткани) предполагает, что фермент должен быть ответственен за фундаментальные биохимические процессы. При обзоре литературы по данной теме найдены единичные работы в основном 60-80х годов (отечественные и зарубежные) по исследованию ЩФ в органах. В связи с чем, целью нашего исследования явилось изучение активности фермента в стенке желчного пузыря, удалённого у больных с ЖКБ в период обострения.
Фермент у здоровых людей обнаруживается практически во всех органах: наибольшая активность в эпителии тонкой кишки, эпителии канальцев почки, остеобластах, гепатоцитах и плаценте. Встречается почти во всех биологических жидкостях организма - моче, желчи, слюне и др. [2,5].
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1.) in vitro гидролизу-ет моноэфиры ортофосфорной кислоты, является гли-копротеином, димером, содержащим в активном центре атомы цинка. Лишённый цинка фермент не активен, но после добавления металла, активность восстанавливается. В присутствии магния активность увеличивается.
Фермент плотно связан с клеточной мембраной гидрофобным карбоксильным концом полипептидной цепи, прикреплён с помощью фосфатидилинозитолгли-канового якоря. Гидрофобный конец идентичен для всех изоформ. Степень гликозилирования разных изоформ фермента различна, что отражается на молекулярной массе (130-220 кДа), заряде молекулы и её подвижности
в электрическом поле, термолабильности.
Изучена работа трёх генов, кодирующих изоформы фермента: первый отвечает за синтез печёночной, костной и почечной изоформы, второй - за синтез кишечной, третий - за синтез плацентарной изоформы. Возможно существуют и другие гены - для зародышевой изоформы, лейкоцитарной, жировой ткани и др. [2].
Повышение активности ЩФ происходит как в условиях активного роста костной ткани, так и при её разрушении, что приводит к увеличению её активности в крови. Также, известными причинами повышения ЩФ в крови являются интенсивно протекающие процессы деструкции в других тканях (например, при ожогах), внутрипечёночная обструкция желчных протоков и экстрагепатобилиарная обструкция, особенно отягощенная злокачественной этиологией. Определение активности ЩФ в лейкоцитах (но не в сыворотке крови) может использоваться в дифференциальной диагностике инфекционного гепатита и обтурационной желтухи [1,5,6].
Повышение активности ЩФ в сыворотке крови без исследования изоферментов не всегда позволяет с достаточной степенью достоверности составить представление об органотопической патологии. Как известно, в сыворотке крови больных с холестазом обнаруживается «печёночная» форма ЩФ, которая представляет собой везикулы трёхслойной структуры, характерной для плазматической мембраны гепатоцита [2,5]. Помимо ЩФ эти фрагменты содержат и другие мембранно-связанные ферменты - ГГТ, лейцинаминопепидазу, 5'-нуклеотидазу. Доказано, что возрастание активности печёночной ЩФ при закупорке желчных путей является результатом повышенного синтеза энзима и вклю-
чения его в мембрану клетки. Что касается попадания фермента в кровь, то сосуществуют две гипотезы, объясняющие данное явление. Согласно первой гипотезе ЩФ поступает в желчные канальцы и оттуда через интрацеллюлярные пространства в сыворотку крови (парацеллюлярный шунт). Альтернативная гипотеза заключается в том, что ЩФ попадает в сыворотку прямо с плазматической мембраны. В норме ЩФ локализована на наружной поверхности желчной каналикулярной мембраны. Имеются данные, что при обтурации желчных протоков она может изменить свою локализацию. В таком случае её можно обнаружить внутри клетки, а также и во всех частях плазматической мембраны гепа-тоцита [5].
Есть данные о том, что ЩФ in vivo участвует в регуляции роста клеток, взаимодействуя с поверхностными рецепторами эпидермального ростового фактора и инсулина [5].
Материалы и методы
Активность ЩФ была определена отдельно для слизистого и серозного слоёв в 46 желчных пузырях, оперативно удалённых у больных с желчнокаменной болезнью в период обострения, с помощью колориметрического метода по измерению в конечной точке. В настоящее время наиболее известны три таких метода; 1) Бодански, 2) Кинга и Амстронга, 3) Бессея, Лоури, Брока. Методы отличаются субстратами для ЩФ (соответственно - ^-глицерофосфат, фенилфосфат и пара-нитрофенилфосфат), продуктами гидролиза, определяемыми колориметрически (соответственно - фосфат, фенол и паранитрофенол) и составом буфера, позволяющего определить получающийся продукт. Метод Бессея, Лоури, Брока (по инструкции ВИТАЛ), которым мы воспользовались, в настоящее время используется наиболее широко, в том числе и в автоматизированных исследованиях, в связи с быстротой выполнения исследования - ЩФ расщепляет паранитрофенол в 1,15 раз быстрее, чем фенилфосфат и в 30 раз быстрее, чем ^-глицерофосфат [2]. В связи с тем, что раньше преимущественно использовался метод по Бодански в различных руководствах и справочниках приводятся переводные коэффициенты, которые удобно использовать при соотнесении результатов.
В желчных пузырях непосредственно после операции вырезали фрагмент дна 2х2 см. После промывки физиологическим раствором №С1, ополаскивания дистиллированной водой и просушки фильтровальной бумагой, из вырезанного фрагмента выделяли серозную и слизистую оболочки. Затем каждый срезанный слой делили на две части: в одной части определяли активность ЩФ, в другой концентрацию GSH. Все последующие операции шли на холоде (с применением льда). Как и в более ранней работе [3], при подготовке желчного пузыря к исследованию использовалась одна из стандартных сред выделения в соотношении 1 : 3 (масса : объём). Разведение в дальнейшем учитывалось в расчётах. Гомогенизацию проводили с помощью гомогенизатора с тефлоновым пестиком в течение 3 минут при 2890 об/ мин. Фракцию надосадочной жидкости получали центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при 13000 об/ мин в течение 30 минут.
Кроме того, для 33 больных и 10 здоровых людей активность ЩФ была определена в сыворотке крови, согласно инструкции ВИТАЛ. Параллельно в слоях пузыря определяли концентрацию глутатиона (GSH) стандартным спектрофотометрическим методом [3]. С этой целью срез гомогенизировали с 5% сульфосалициловой кислотой.
Работа была одобрена локальным этическим комитетом университета. Все участники подписывали протокол добровольного информированного согласия на участие в исследовании.
При статистической обработке результатов исполь-
зовались критерии Фишера и Стьюдента, корреляционный анализ проводился с расчётом рангового коэффициента Спирмена. Различия считались значимыми, если вероятность случайности р не превышала 0,05.
Результаты и обсуждение
Выявлено отличие в активности ЩФ в слизистом и серозном слоях, а именно, активность фермента в слизистом слое была значимо выше на 35%, чем в серозном (соответственно 157,4±12,4 и 102,6±11,1 нмоль/мин на 1 мг белка (рис. 1).
200 150 100
■ слизистая сероза
W
Рис. 1. Активность ЩФ (нмоль/мин. на 1 мг белка).
Возможности провести сравнение между здоровым желчным пузырём и желчным пузырём при ЖКБ не было, но согласно данным литературы, активность всех эстераз в слизистой желчного пузыря при хроническом холецистите как калькулёзном, так и бескаменным, значимо снижается, что вероятно предполагает участие фосфатаз слизистой в патогенезе ЖКБ [9]. Из других данных этих же авторов следует, что активность ЩФ желчных пузырей с пигментными камнями значительно ниже, чем таковая в пузырях с холестериновыми камнями или при бескаменном холецистите [8]. Коэффициент корреляции для показателей активности ЩФ в разных слоях пузыря был равен +0,585, что говорит о влиянии одинаковых факторов на активность фермента в обоих слоях.
Согласно данным Мансуровой И.Д. активность ЩФ печени, определяемая по Бодански, составляет 3,9 единиц, но при гепатитах она значимо возрастает до 18,6 единиц в остром периоде заболевания и до 10,3 единиц при ремиссии. Возможно, это результат активации ок-сидативным стрессом, что весьма характерно для многих печёночных ферментов при острых процессах [3]. Используя коэффициенты перевода активностей можно сделать вывод об обнаруженной нами гораздо более низкой активности ЩФ в пузыре при ЖКБ по сравнению со здоровой печенью.
Согласно данным А. ОееШа, который исследовал активность разных ферментов в слизистом слое желчного пузыря и сравнивал полученные данные с показателями активности ферментов в пузыре без камней, в пузыре с камнями происходит снижение ферментов системы глутатиона, №+, К+-АТФазы, кальциевой АТФазы, щелочной фосфатазы [7]. Данный автор отмечает характерные функциональные и морфологические изменения в пузыре, такие как вазодилятацию, снижение секреции в желчь гликопротеидов, некротические и фиброзные изменения слизистой.
Активность ЩФ в сыворотке крови здоровых людей составила 302±16,0 нмоль/с на 1 л, что соответствует норме по прописям ВИТАЛ (278-830 нмоль/с на 1 л). Средний таковой показатель 33 больных составил 254,0±17,5 нмоль/с на 1 л, снижение показателя по сравнению с нормой на 16% было не значимым. Корреляций между активностью фермента в сыворотке крови и стенке пузыря не обнаружено. Отсутствие данных коррелятивных связей ставит под сомнение использование определения активности фермента с диагностической целью при воспалительных заболеваниях желчного пузыря только в качестве экскреторного фермента, скорее связь с патогенезом более тесная. Вероятно, снижение активностей многих ферментов в стенке пузыря при ЖКБ является не только следствием длительного хро-
нического воспалительного процесса, вызываемого наличием камней, но и другими факторами патогенеза.
Концентрация ОвН в слизистом и серозном слоях составила 1,49±0,16 и 1,22±0,13 мкмоль/г соответственно, в слизистом слое была значимо выше по сравнению с серозным на 18% (рис. 2).
Рис. 2. Концентрация ОвЫ в слизистой и серозе (мкмоль/г).
Согласно данным, полученным ранее [3], значимое снижение концентрации ОвН в слизистой по сравнению
с серозой происходит при обострении воспалительного процесса, что свидетельствует о большем расходовании ОвН ферментами системы глутатиона, и отсутствует в стадии ремиссии. Была выявлена корреляция для ОвН слоёв - г = +0,569 (р<0,05). Корреляций между ЩФ и ОвН выявлено не было.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Прозрачность исследования. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователи несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.
Декларация о финансовых и иных взаимодействиях. Все авторы принимали участие в разработке концепции и дизайна исследования и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за исследование.
Работа поступила в редакцию: 01.05.2015 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондарев Л.С., Вепринская С.И. О клиническом значении определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах периферической крови при инфекционном гепатите и обтурацион-ной желтухе // Лабораторное дело. - 1970. - №3. - С.142-144.
2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике
- М.: МЕДпресс-информ, 2004. - 911 с.
3. Леонова З.А., Чикотеев С.П., Каня О.В., Зайцева Л.В. Изменение системы глутатиона стенки желчного пузыря при хроническом калькулёзном холецистите // Сибирский медицинский журнал (Иркутск) - 2010. - №2. - С.83-85.
4. Мансурова И.Д. К методике микрохимического исследования активности некоторых ферментов в пунктатах печени больных с болезнью Боткина // Лабораторное дело. - 1962.
- №9. - С.26-29.
5. Пехливанов Б.Л., Цветкова Т., Пипернов Т., Чичовска М.
Щелочная фосфатаза: современное состояние вопроса (обзор литературы) // Лабораторное дело. - 1989. - №11. - С.4-7.
6. Старикова М.А., Сидоркин В.Г., Сидоркина А.Н., Стрелкова И.Г. Активность 5'-нуклеотидазы и щелочной фосфатазы сыворотки крови в динамике ожоговой болезни // Казанский медицинский журнал - 2009. - Т. 90. №5. -С.691-695.
7. Geetha A. Evidence for oxidative stress in the gall bladder mucosa of gall stone patients // J. Biochem. Mol. Biophys. - 2002. - Vol. 6. №6. - P.427-432.
8. Kouroumalis. Hopwood D, Ross P.E., Bouchier I. A. Mucosal alkaline phosphatase and bile lipids in the gallbladder in cholecystitis // J. Patol. - 1983. - Vol. 141. №2. - Р.169-179.
9. Kouroumalis E, Hopwood D, Ross P.E., Bouchier IA. Human gallbladder epithelium: non-specific esterases in cholecystitis // J. Patol. - 1984. - Vol. 142. №2. - Р.151-159.
REFERENCES
1. Bondarev L.S., Veprinskaya S.I. On clinical significance of determination of alkaline phosphatase in peripheral blood leukocytes in infectious hepatitis and obstructive jaundice // Laboratornoe delo. - 1970. - №3. - P.142-144. (in Russian)
2. Kamyshnikov V.S. Handbook of clinical and biochemical studies and laboratory diagnosis - Moscow: MED-press, 2004. -911 p. (in Russian)
3. Leonova Z.A., Chikoteev S.P., Kania O.V., Zaitseva L.V. Change of glutathione gallbladder wall in chronic calculous cholecystitis // Sibirskij Meditsinskij Zurnal (Irkutsk). - 2010. -№2. - P.83-85. (in Russian)
4. Mansurov I.D. By the method of micro-chemical study of the activity of certain enzymes in the liver of patients with punctates disease Botkin // Lab. delo. - 1962. - №9. - P.26-29. (in Russian)
5. Pehlivanov B.l., Tsvetkova T., Piperno T., Chichovska M. Alkaline phosphatase: the current state of the issue (review) // Lab. delo. - 1989. - №11. - P.4-7. (in Russian)
6. Starikov M.A., Sidorkin V.G., Sidorkina A.N., Strelkova I.G. The activity of 5'-nucleotidase and alkaline phosphatase in the blood serum of burn disease dynamics / Kazanskij Meditsikskij Zhurnal. - 2009. - Vol. 90. №5. - P.691-695. (in Russian)
7. Geetha A. Evidence for oxidative stress in the gall bladder mucosa of gall stone patients // J. Biochem. Mol. Biophys. - 2002. - Vol. 6. №6. - P.427-432.
8. Kouroumalis. Hopwood D, Ross P.E., Bouchier I. A. Mucosal alkaline phosphatase and bile lipids in the gallbladder in cholecystitis // J. Patol. - 1983. - Vol. 141. №2. - P.169-179.
9. Kouroumalis E, Hopwood D, Ross P.E., Bouchier IA. Human gallbladder epithelium: non-specific esterases in cholecystitis // J. Patol. - 1984. - Vol. 142. №2. - P.151-159.
Информация об авторах:
Щербатых Андрей Викторович - заведующий кафедры факультетской хирургии, д.м.н., профессор; Леонова Зоя Алексеевна - старший преподаватель кафедры химии и биохимии, к.б.н.; Шмаков Дмитрий Андреевич - аспирант кафедры факультетской хирургии, e-mail: shmakov.dima.a@gmail.com
Information About the Authors:
Scherbatykh Andrey V. - Head of the Department of Faculty Surgery, MD, PhD, DSc; Bolsheshapov Andrey A. - Senior Lecturer, Department of Chemistry and Biochemistry, MD, PhD; Shmakov Dmitry A. - graduate student of Faculty Surgery,
e-mail: shmakov.dima.a@gmail.com
