CC BY
12УДК [611.441:576.31]57.044
ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ФОЛЛИКУЛЯРНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ
ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС В ПУБЕРТАТНОМ ПЕРИОДЕ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ
ДЛИТЕЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ НИЗКИХ ДОЗ ЭНДОКРИННОГО ДИСРАПТОРА
ДИХЛОРДИФЕНИЛТРИХЛОРЭТАНА
Ю.П. Следнева, Н.В. Яглова, В.В.Яглов
ФГБНУ «НИИ морфологии человека», г. Москва
Лаборатория развития эндокринной системы ФГБНУ «НИИ морфологии человека», заведующий лабораторией д.м.н. Яглова Н.В.
Для корреспонденции: 117418, г.Москва, ул. Цюрупы, д.3;
E-mail: jsledneva@gmail.com, yaglova@mail.ru, vyaglov@mail.ru
РЕЗЮМЕ
Дихлордифенилтрихлорэтан на сегодняшний день является одним из наиболее широко распространенных эндокринных дисрапторов, приводящих к нарушению функции щитовидной железы. Целью исследования было изучение ультраструктуры фолликулярных эпителиоцитов щитовидной железы крыс пубертатного периода, потребляющих низкие дозы эндокринного дисраптора с первых дней жизни. Результаты исследования свидетельствуют о том, что длительное воздействие низких доз дихлордифенилтрихлорэтана приводит к изменениям как в центральных, так и периферических зонах щитовидной железы у крыс в пубертатном периоде. Так, в периферических и центральных зонах железы наблюдалось нарушение баланса между синтезом и резорбцией и протеолизом тиреогло-булина в сторону преобладания синтетических процессов. В клетках центральной зоны синтетические процессы протекали более активно, чем в периферической. В периферической зоне также отмечалось нарушение трансмембранного переноса тироглобулина.
Ключевые слова: щитовидная железа, эндокринные дисрапторы, дихлордифенилтрихлорэтан, фолликулярные эпителиоциты, ультраструктура
SUMMARY
ULTRASTRUCTURAL CHANGES IN THYROID FOLLICULAR CELLS OF PUBERTAL RATS CAUSED BY PROLONGED EXPOSURE TO LOW DOSES OF ENDOCRINE DISRUPTOR
DICHLORODIPHENYLTRICHLOROETHANE
Y.P. Sledneva, N.V. Yaglova, V.V.Yaglov
Dichlorodiphenyltrichloroethane is one of the most widespread endocrine disruptor which interferes in thyroid functioning. The aim of this study was to investigate ultrastructural changes in follicular thyrocytes of rats caused by exposure to low doses of endocrine disruptor dichlorodiphenyltrichloroethane since birth until puberty. Light and electron microscopy found changes both in the central and peripheral regions of the thyroid lobes. Synthesis and excretion of thyroglobulin into the follicular lumena dominate over its reabsor-tion and proteolysis by lysosomes. In the central region synthesis of thyroglobulin was more intensive than in peripheral one. Transmembrane transport of thyroglobulin was depressed in the cells of peripheral regions of the thyroid.
Key words: thyroid, endocrine disruptors, dichlorodiphenyltrichloroethane, follicular epithelial cells, fine structure
Дихлордифенилтрихлорэтан - хлороргани-ческий инсектицид с высокой липофильностью, обладающий дисрапторным действием на эндокринную систему. Учитывая схожее строение с некоторыми гормонами, в том числе c тироксином и трийодтиронином, дихлордифенил-трихлорэтан может имитировать действие ти-реоидных гормонов, модулируя их механизмы действия и связываясь с их рецепторами, приводя к нарушениям функционирования щитовидной железы [3,4,5].
Ранее нами было установлено, что при длительном воздействие низких доз дихлордифенил-трихлорэтана на крыс начиная с рождения в фолликулярных тироцитах происходят морфо-функциональные изменения, приводящие к снижению продукции Т4 [1]. Однако в литературе мало данных об ультраструктурных изменениях при аналогичном воздействии инсектицида. Целью исследования является изучение влияние длительного воздействия низких доз дихлордифенилтрихлорэтана на ультраструк-
турные характеристики щитовидной железы крыс в пубертатном периоде.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на новорожденных самцах (n=12) крыс линии Вистар. Моделировали потребление низких доз дихлордифенил-трихлорэтана аналогичное, потреблению его у человека: в течение подсосного периода новорожденные крысы опытной группы (n=6) потребляли дихлордифенилтрихлорэтан с молоком матери, получавшей вместо воды растворы о,п-ДДТ ("Sigma", США) с концентрацией 20мкг/л, а затем самостоятельно аналогичный раствор дихлордифенилтрихлорэтана. Животных выводили из эксперимента через 6 (пубертатный период) недель после рождения передозировкой золетила. Расчет потребляемой дозы дихлордифенилтрихлорэтана выполняли в соответствии с нормативами содержания дихлорди-фенилтрихлорэтана в продуктах питания в России по СанПин 2.3.2.1078-01. Среднесуточное потребление дихлордифенилтрихлорэтана крысами составило 3,71±0,15мкг/кг. Животные контрольной группы (n=6) получали водопроводную воду. Отсутствие в воде и корме ди-хлордифенилтрихлорэтана, его метаболитов и родственных хлорорганических соединений было подтверждено методом газожидкостной хроматографии. Эксперимент выполнен в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977 г., и этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Исследование гистологических препаратов щитовидной железы после проведения ШИК-реакции проводили методом световой микроскопии и компьютерной морфометрии с использованием программы "Image ProPlus" ("Leica Microsystems", Австрия) с учетом особенностей регионального строения долей щитовидной железы крыс, по отдельности в центральных и периферических зонах долей, составляющих одну
треть и две трети доли, соответственно [2]. Для изучения ультраструктуры фолликулярных ти-роцитов щитовидную железу фиксировали в 2,5% (объем/объем) растворе глутарового альдегида в 0,1М какодилатном буфере (рН 7,3) с постфиксацией в 1% (объем/объем) растворе OsO4 в 0,1М какодилатном буфере (рН 7,3) с последующей заливкой в смесь эпон-аралдит. Контрастирование срезов проводили 2,5% (масса/объем) водными растворами уранилацетата и цитрата свинца. Исследование срезов проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии ("Libra 120", "Carl Zeiss", Германия). Статистическую обработку осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 (Statsoft Inc., США). Сравнение независимых групп по количественному признаку выполняли с помощью t-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, а также критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У самцов крыс контрольной группы в возрасте 6 недель щитовидная железа имела типичное строение. В долях щитовидной железы при проведении микроскопического исследования выделялись две зоны: центральная и периферическая, отличающиеся друг от друга размерами фолликулов. Периферическая зона железы была представлена сравнительно крупными фолликулами, выстланными однослойным кубическим, реже уплощенным эпителием. Содержимое фолликулов было представлено ШИК-положительным, плотной консистенции коллоидом, по периферии которого были видны резорбционные вакуоли. В некоторых фолликулах наблюдалась десквамация единичных клеток эпителия в полость фолликула. В центральной зоне долей железы размер фолликулов был в полтора раза меньше. Коллоид был более жидким. Резорбционные вакуоли и десквамиро-ванные клетки встречались реже. Высота тиро-цитов и размеры их ядер были меньше, чем в периферической зоне долей.
Рисунок 1. Ультраструктура апикальной части фолликулярного тироцита периферической зоны щитовидной железы крысы контрольной группы. На апикальной плазмалемме находятся множественные микроворсинки длиной до 800нм. Под свободным апикальным участком цитоплазмы тироцита видны многочисленные секреторные гранулы (СГ). Митохондрии (Мх) крупные, с очагово просветленным матриксом, деструкцией крист. Множественные лизосомы (Л) различного размера (200-800нм) имеют содержимое высокой электронной плотности. Встречаются единичные мелкие коллоидные капли. Канальцы гранулярной эндоплазматической сети (ГЭПС) умеренно расширены.
При электронно-микроскопическом исследовании апикальные поверхности фолликулярных тироцитов периферической зоны контактировали с коллоидом, базальные — с перикапиллярным пространством. Электронно-микроскопически коллоид представлял собой гомогенную осмиофильную массу средней электронной плотности. На апикальной поверхности тироцитов имелись многочисленные микроворсинки длиной 300-400нм с просветленным гомогенным содержимым. Ядра тироцитов занимали центральное положение, в них преобладал эухроматин. В цитоплазме тироцитов была хорошо развита гранулярная эндоплазматиче-ская сеть, особенно в базальной части клеток. Она была представлена многочисленными канальцами, просвет которых заполнен мелкозернистым содержимым низкой электронной плотности. Митохондрии среднего и малого размера встречались преимущественно в апикальной и латеральной части тироцитов. Редко встречались митохондрии с небольшим отеком матрик-
са и разрушенными кристами, а также митохондрии, сливающиеся с лизосомами с образованием аутофаголизосом и миелинизацией мембран. В цитоплазме имелось умеренное количество лизосом. Лизосомы представляли собой мелкие, диаметром 100-500нм, пузырьки, окруженные одинарной мембраной и заполненные осмио-фильным содержимым низкой, средней и высокой электронной плотности, что было обусловлено степенью их зрелости. В цитоплазме фолликулярных тироцитов под апикальной плазмолеммой имелось умеренное количество секреторных гранул. Встречались коллоидные капли различного размера. Некоторые из них были окружены лизосомами и сливались с ними. В цитоплазме базальной части клеток также присутствовали единичные мелкие коллоидные капли. Прилежащие к перикапиллярному пространству капилляры были выстланы эндоте-лиоцитами и имели открытый просвет.
Рисунок 2. Ультраструктура фолликулярного тироцита периферической зоны долей щитовидной железы крысы опытной группы. На апикальной поверхности тироцитов имелись многочисленные микроворсинки. Большинство микроворсинок имело гомогенное содержимое. В цитоплазме тироцитов была умеренно развита ГЭПС. Она была представлена многочисленными канальцами, просвет которых заполнен мелкозернистым содержимым низкой электронной плотности. Митохондрии среднего и малого размера. Большинство митохондрий не были изменены, реже встречались слегка набухшие митохондрии с просветленным матриксом и разрушенными кристами, а также митохондрии, сливающиеся с лизосомами с образованием аутофаголизосом и миелинизацией мембран (АФЛ). Комплекс Гольджи компактный, представлен уплощенными цистернами с просветленным содержимым. Лизосомы единичные. В цитоплазме под апикальной плазмолеммой имеется большое количество секреторных гранул различного размера и формы, характеризующиеся высокой и
средней электронной плотностью.
В отличие от периферической в центральной зоны долей микроворсинки фолликулярных тироцитов были представлены длинными (до 1мкм) образованиями, отходящими от цито-плазматических выростов шириной 100-300нм. Количество секреторных гранул было умеренным и не отличалось в центральной и периферической зонах. Ядра тироцитов были крупного размера. Гранулярная эндоплазматическая сеть была сильно развита как в базальных, так и апикальных частях клеток и представлена многочисленными канальцами и цистернами. Митохондрии располагались как в апикальной, так и базальной частях цитоплазмы. В отличие периферической основная часть митохондрий центральной зоны имела выраженные изменения: отек матрикса, деструкцию крист, образование аутофаголизосом и миелинизацию мембран. Комплекс Гольджи был умеренно развит.
Количество лизосом было небольшим. Они были чаще представлены незрелыми формами с содержимым низкой электронной плотности, реже с конденсирующимся матриксом. В апикальной части клеток встречались единичные мелкие коллоидные капли. Базальная плазмо-лемма тироцитов имела меньшее количество инвагинаций, чем у тироцитов периферической зоны. Капилляры в основном имели открытый просвет, часто содержали эритроциты. При исследовании гистологических препаратов щитовидной железы крыс опытной группы 6-недельного возраста были выявлены субкапсу-лярно расположенные небольшие участки гибели эпителия и разрушения единичных фолликулов. Периферическая зона долей железы была представлена фолликулами более крупных размеров, чем у крыс контрольной группы, заполненными ШИК-положительным коллоидом.
Резорбционные вакуоли встречались реже. Вы- значениям контрольной группы, но размеры сота фолликулярных тироцитов соответствовала ядер тироцитов были меньше.
Рисунок 3. Ультраструктура фолликулярного тироцита центральной зоны ЩЖ крысы опытной группы. В ядре преобладает эухроматин. Единичные крупные митохондрии (Мх), с просветленным матриксом, деструкцией крист. Канальцы ГЭПС резко расширены. Лизосомы не встречаются. Под свободным апикальным участком апикальной плазмолеммы тироцита видны единичные секреторные гранулы (СГ).
В центральной зоне долей железы встречались фолликулы различного размера от маленьких до крупных. Средняя высота фолликулярных тироцитов превышала значения контрольной группы, а размеры ядер были статистически значимо меньше. Содержание коллоида в просветах фолликулов было высоким. Резорбционные вакуоли встречались чаще, чем в контрольной группе. Десквамация эпителия в полость фолликулов была выражена слабо.
При электронно-микроскопическом исследовании фолликулярные тироциты периферической зоны имели, в основном, кубическую и уплощенную форму. Ядра тироцитов имели округлую и овальную форму, часто встречались ядра с множественными инвагинациями. Эу-хроматин преобладал над гетерохроматином. Гранулярная эндоплазматическая сеть была умеренно расширена. Митохондрии более крупные, чем в контрольной группе, вытянутой формы, локализовалась в апикальной части клеток. В единичных митохондриях имелись участки с отеком матрикса и деструкцией
крист. Комплекс Гольджи компактно располагался в апикальной или латеральной части клеток. Количество лизосом небольшое. Лизосомы имели различную плотность. Коллоидные капли в цитоплазме практически не встречались. Однако в единичных фолликулярных тироци-тах, в цитоплазме имелись огромные скопления резорбированного коллоида в виде больших капель диаметром до 6-8мкм. В цитоплазме апикального отдела тироцитов имелось большое количество секреторных гранул. Строение, размеры и электронная плотность микроворсинок на апикальной поверхности тироцитов не изменялись. Капилляры в основном с открытым просветом, как правило, с эритроцитами в просвете.
В центральных зонах долей щитовидной железы фолликулярные тироциты имели чаще призматическую форму. Цитоплазматические выросты на апикальной поверхности клеток встречались реже, чем в периферической зоне. Ядра округлой и овальной форм, с преобладанием эухроматина. Ядрышки были смещены к
ядерной оболочке. В некоторых ядрах имелось два ядрышка. Гранулярная эндоплазматическая сеть занимала большую часть цитоплазмы и была представлена резко расширенными канальцами, заполненными хлопьевидным содержимым низкой электронной плотности. Митохондрии в центральных зонах в отличие от периферических зон имели округлую форму, были значительно крупнее. Большинство митохондрий с выраженным отеком матрикса и деструкцией крист. В некоторых митохондриях наблюдалась миелинизация мембран. Часть митохондрий плотно контактировала с лизосома-ми с образованием аутофаголизосом. Комплекс Гольджи в основном располагался в апикальной части клеток, его цистерны были расширены и заполнены гомогенным осмиофобным содержимым. Количество лизосом было невелико. Чаще встречались незрелые лизосомы. Количество секреторных гранул в апикальной части фолликулярных тироцитов было умеренным. В цитоплазме выявлялись единичные коллоидные капли, в некоторых клетках - крупные скопления коллоида. Матрикс микроворсинок на апикальной поверхности клеток был просветлен. Часто были видны фигуры перистальтики микроворсинок, свидетельствующие о выделении тироглобулина в полость фолликула. Капилляры в центральной зоне имели открытый и закрытый просвет. Просвет части капилляров был обтурирован эритроцитами. В цитоплазме эндотелиоцитов имелись немногочисленные микропиноцитозные везикулы. Проведенное исследование ультраструктуры фолликулярных тироцитов крыс контрольной группы свидетельствует о высокой функциональной активности клеток, — высокое содержание эухроматина в ядрах, хорошо развитая гранулярная эндоплазматическая сеть, функциональной напряжение митохондрий, наличие секреторных гранул в апикальных частях клеток, коллоидных капель, контактирующих с лизосомами. Наиболее ярко эти признаки выражены в фолликулярных тироцитах центральной зоны долей. Выявленные морфологические изменения щитовидной железы крыс опытной группы указывают на разную выраженность реакции клеток периферических и центральной зон на действие дисраптора. В периферических зонах железы опытной группы наблюдалось нарушение баланса между синтезом и резорбцией тиреоглобулина в сторону преобладания синтетических процессов. Большое количество секреторных гранул под апикальной мембраной и малое количество коллоидных капель свиде-6.
тельствует о замедлении процессов трансмембранного транспорта тироглобулина. В центральных зонах синтетические процессы были более выражены. Как и в периферической зоне долей отмечалось уменьшение количества лизо-сом и коллоидных капель, что приводило к уменьшению протеолиза прогормона.
ВЫВОДЫ
1. Результаты исследования свидетельствуют о том, что длительное воздействие низких доз дихлордифенилтрихлорэтана, приводящее к снижению продукции тиреоидных гормонов, обусловлено изменениями как в центральной, так и периферических зонах долей щитовидной железы у крыс в пубертатном периоде.
2. Ультраструктурные изменения в фолликулярных тироцитах периферической зоны свидетельствуют о нарушении баланса между синтезом, выведением в полость фолликула содержимого секреторных гранул и резорбцией тиреоглобулина в сторону преобладания синтетических процессов, замедлении трансмембранного переноса тироглобулина. В центральной зоне дисбаланс между синтезом, выделением тироглобулина в полость фолликула и его резорбцией и расщеплением были более выраженными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яглова Н.В., Следнева Ю.П., Яглов В.В. Морфофункицональное состояние щитовидной железы после длительного воздействия низких доз ДДТ в различные периоды постнатального онтогенеза. II Клиническая и экспериментальная морфология. 2016.;2(18).C 53-59.
2. Яглова Н.В. Нарушения секреторного цикла фолликулярных тироцитов и их коррекция ти-реотропным гормоном при экспериментальном синдроме нетиреоидных заболеваний I Н.В. Яг-лова II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011.Т.152.№8.С.215-219.
3. Diamanti-Kandarakis E et al. 2009 Endocrine-Disrupting Chemicals: An Endocrine Society Scientific Statement. Endocrine Reviews 30(4):293-342.
4. Langer P, Tajtakova M, Kocan A, Vlcek M, Pe-trik J, Chovancova J, et al. 2006. Multiple orga-nochlorine pollution and the thyroid. Endocr. Re-gul. 40(2):46-52.
5. Meeker JD, Altshul L, Hauser R. 2007. Serum PCBs, p,p'-DDE and HCB predict thyroid hormone levels in men. Environ. Res. 104(2):296-304.
