CC BY
131
УДК 547.458.8+577.15
ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОЙ И ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ
© А.Л. Бычков1,2 , К.Г. Королёв1,2, Е.И. Рябчикова3, О.И. Ломовский1
1Институт химии твёрдого тела и механохимии СО РАН, Россия,
Новосибирск, ул. Кутателадзе, 18, 630128 (Россия).
E-mail: bychkov_a@solid.nsc.ru
2НОЦ « Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии»,
Новосибирск, ул. Пирогова, 2, 630090 (Россия)
3Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, ул. Лаврентьева, 8, Новосибирск, 630090 (Россия)
Методом просвечивающей электронной микроскопии и химическим анализом изучено влияние механической обработки (стесненного удара) на морфологию клеточной стенки дрожжей Saccharomyces сerevisiae и масличной пальмы Elaeis guineensis. Представлены особенности разрушения клеточной стенки. изменение надмолекулярной структуры биополимеров клеточной стенки наблюдается у менее устойчивой клеточной стенки дрожжей.
Ключевые слова: механохимическая активация, дрожжи, пальма масличная, клеточная стенка
Работа выполнена при поддержке грантов: BRHE Y4-C-08-04, Минобразования РФ РПН 2.2.2.2.3.1029,
PharmaMed R UX0-008-N0-06.
Введение
Механическая активация [1] признана одним из эффективных методов повышения реакционной способности твёрдых фаз и многофазных систем, в частности минерального сырья. Значительный практический интерес представляют методы, позволяющие получать активированные гетерогенные системы, область применения которых разнообразна. известно много удачных технологических решений, например, в фармации и экологии [2, З].
Механохимия внесла ощутимый вклад в развитие методов обработки полимеров как синтетического, так и природного происхождения [4, 5]. На основе этих методов предложены высокоэффективные ресурсосберегающие технологии [6, 7]. Тенденцией последних лет стало применение механохимических методов в переработке возобновляемых видов сырья - отходов лесоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства, промышленно выращиваемых микроорганизмов [S—13]. Решение задачи переработки и утилизации растительного сырья осложняется многоуровневым структурированием исходного материала (ткани, клетки, клеточные стенки), что принципиально отличает растительное сырье от минерального и обусловливает необходимость детального изучения его изменений в ходе механохимической переработки. Сведения о физико-химических механизмах, лежащих в основе механохимических методов переработки биогенного сырья, носят отрывочный характер. К основным факторам, ответственным за повышение реакционной способности биогенного сырья, относят механическое разрушение тканей и клеток, уменьшение размера частиц, изменение структуры компонентов сырья, что и определило задачи настоящей работы:
1. изучение физико-химических последствий механохимической обработки стенок дрожжевых и растительных клеток.
* Автор, с которым следует вести переписку.
2. Поиск путей совмещения процессов механохимической обработки и ферментативного гидролиза структурообразующих компонентов клеточной стенки.
В качестве объектов исследования использовали биомассу дрожжей X свгвуг^чав и волокнистую ткань гроздей многолетнего растения Е1ав1&' guineensis.
Клеточная стенка окружает дрожжевую клетку и контактирует с ее плазматической мембраной [14, 15]. Масса клеточной стенки дрожжей может достигать 25% массы клетки, толщина ее колеблется в пределах 100-250 нм. Клеточная стенка содержит около 40% маннанопротеинов, около 60% глюкана и около 2% хитина [14].
Основным элементом дрожжевой стенки, ответственным за поддержание ее прочности, является Р-глюкан, формирующий средний слой клеточной стенки и покрытый с внешней и внутренней сторон манна-нопротеинами [14-16]. Термин «дрожжевой глюкан» объединяет несколько типов молекул полисахаридов, образованных остатками глюкозы, соединенными Р-1,3- и р-1,6-связями. В большей степени, нежели остальные компоненты, жёсткость и прочность клеточной стенки, устойчивость её к воздействиям окружающей среды обеспечивает р-1,3-глюкан [16, 17]. Строение дрожжевого глюкана сходно со строением целлюлозы, его молекулы, подобно целлюлозе, содержат кристаллическую и аморфную части, образуют микро- и макрофибриллы. Белки клеточной стенки дрожжей образуют ковалентные связи с маннаноолигосахаридами [14, 15], формируя маннанопротеины, а также с глюканом, поддерживая макромолекулярную организацию клеточной стенки.
Маннаноолигосахариды (МОС) клеточной стенки дрожжей - олигосахариды, образованные остатками маннозы, обладают способностью блокировать бактериальные лектины (белки, ответственные за связывание бактерий с поверхностью клеток слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта млекопитающих), а также связывать микотоксины [18-20]. Обычно для выделения МОС из клеточной стенки используют индуцированный автолиз, длительное нагревание в автоклаве, гидролиз кислотами и щелочами с последующим разделением продуктов [21-23]. Большинство этих процедур имеет недостатки, например, необходимость длительно поддерживать высокую температуру, использовать агрессивные, летучие и легковоспламеняющиеся реагенты.
С точки зрения химического строения стенка растительных клеток отличается от стенки дрожжей основными структурными компонентами. Рассмотрим химический состав и молекулярную организацию растительных клеточных стенок на примере волокон гроздей масличной пальмы Elaeis guineensis. Растительная клеточная стенка построена в основном из полисахаридов, главным образом целлюлозы [24, 25]. Кроме полисахаридов, в ее состав могут входить лигнины, белки, минеральные соли, пигменты, липиды. Содержание лигнина сравнимо с содержанием полисахаридов и составляет около 18%, доля других компонентов обычно не выходит за рамки нескольких весовых процентов. Содержание целлюлозы и гемицеллюлозы составляет 62 и 28% соответственно [26].
Целлюлоза - основной компонент клеточной стенки, она является полимером глюкозы, молекулы которой соединены р-1,4-связью. Молекулы целлюлозы формируют микрофибриллы толщиной от 10 до 25 нм, которые, в свою очередь, объединяются в макрофибриллы толщиной около 0,5 мкм и длиной до 4 мкм. Благодаря наличию областей разупорядоченного и упорядоченного расположения молекул в микрофибриллах целлюлоза обладает аморфно-кристаллическими свойствами.
Целлюлозный каркас клеточной стенки заполнен матриксом переплетающихся нецеллюлозных молекул, в том числе полисахаридов, называемых гемицеллюлозами, лигнина и некоторых других веществ, содержащихся в незначительном количестве. Гемицеллюлозы - разветвленные полимеры, образующие короткие фибриллярные структуры, кристаллической структуры не имеют. Матрикс оболочки заполняет пространство между целлюлозными микрофибриллами, его макромолекулы образуют гликозидные, водородные и ковалентные связи друг с другом и с микрофибриллами, повышая прочность оболочки. Белки матрикса связаны с остатками арабинозы и образуют гликопротеиды, содержание которых в матриксе не превышает нескольких процентов. Лигнин - смешанный аморфный полимер фенольного ряда, его содержание может достигать 30%. Лигнин откладывается в конце роста оболочки (процесс лигнификации (одревеснение)) и приводит к изменениям ее механических свойств: потере пластичности, резкому повышению твердости и прочности, снижению проницаемости клеточной оболочки для воды.
Экспериментальная часть
Реактивы и материалы. NH3 х.ч. ГОСТ 3760-79, AgNO3 х.ч. ТУ 6-09-3703-74, Б(+)-глюкоза (99%, «Acros organics»), Б(+)-манноза (99%, «Acros organics»); дрожжи Saccharomyces cerevisiae ГОСТ 171-81 (Новосибирский дрожжевой завод); ферментативный комплекс «Целлолюкс 2000» 2000 ед./г. (АО Сиббиофарм, Бердск Новосибирской обл.); грозди Elaeis guineensis (пальма масличная, вид Elaeis guineensis, семейство Palmaceae, предоставлены Государственным институтом СИРИМ, Малайзия).
Механическая активация S. cerevisiae и Elaeis guineensis. Навеску дрожжей S. cerevisiae или гроздей Elaeis guineensis механически обрабатывали в активаторе планетарного типа АГО-2 в течение 2 мин (центробежное ускорение, развиваемое мелющими телами 200 м/с2). Продукт механической активации использовали для микроскопического исследования.
Механическая и ферментативная (механоферментативная) обработка S. cerevisiae. Навеску дрожжей
S. cerevisiae, содержащую 10% ферментативного комплекса «Целлолюкс 2000», механически обрабатывали в активаторе планетарного типа АГО-2 в течение 2 мин (центробежное ускорение, развиваемое мелющими телами 200 м/с2). Полученный механокомпозит запрессовывали в таблетку при давлении 10 кг/см2 и прогревали при 45 °С в течение 28 ч. Продукт ферментативного гидролиза использовали для микроскопического исследования.
Обработка препаратов аммиачными комплексами серебра. Реакция восстановления комплексных аммиачных солей серебра и образования металлического серебра использована для выявления участков клеточной стенки, содержащих концевые альдегидные группы глюкана и оценки степени дефектности таких участков. К 200 мг навески исходного сырья или продукта механической обработки добавляли 1,00 мл рабочего раствора, содержащего 10,0 мл воды, 1,00 мл 1,0 мМ раствора AgNO3, 300 мкл концентрированного раствора аммиака. Затем смесь выдерживали при комнатной температуре в течение суток и использовали для проведения электронно-микроскопического исследования.
Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Образцы исходного сырья и продукта механической обработки дрожжей и Elaeis guineensis фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида либо 1%-ным раствором осмиевой кислоты. В качестве буфера использовали раствор Хенкса. Обезвоживание проводили в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в смесь эпон-аралдит. Ульт-ратонкие срезы готовили на ультратоме Райхерт (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследование препаратов проводили на электронном микроскопе Н-600 (Хитачи, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ, электронном микроскопе Jem 1400 (Джеол, Япония) и световом микроскопе Axio-imager Z (Цейсс, Германия). Фотосъемку осуществляли с помощью цифровых камер микроскопов.
Обсуждение результатов
Электронно-микроскопическое изучение изменений клеточных стенок дрожжей, вызванных механической обработкой в условиях стесненного удара, выявило выраженное повреждение клеток, в которых наблюдались разрушение органелл, деформация клеточной стенки и ее разрывы (рис. 1, 2).
Основная часть препарата представлена клеточным детритом, имеющим вид электронно-плотной массы, в которой просматриваются мембраноподобные структуры различного размера и остатки клеточной стенки. Последние имеют вид как отдельных фрагментов, так и сплющенных стенок целой клетки с разрывами. По сравнению с клетками исходного препарата ультраструктура клеточной стенки разупорядочена, стенка выглядит гомогенной, что свидетельствует о нарушении межмолекулярного взаимодействия как внутри структурных слоев, так и между слоями в целом.
Химический анализ показал, что механическая активация дрожжевой биомассы усиливает реакционную способность р-глюкана к последующему ферментативному гидролизу.
Для обозначения сочетания предварительной механической активации и последующего ферментативного гидролиза использовался термин «механоферментативный гидролиз». Механоферментативный гидролиз проводили в присутствии естественной влаги биомассы. Образцы подвергали механической активации в смеси с ферментом и последующему прогреву в виде компактированной массы.
Ультратонкий срез дрожжевой биомассы, подвергнутой механоферментативной обработке, приведен на рисунке 3. Клеточные стенки повреждены, цитоплазма и органоиды разрушены и образуют сплошную неструктурированную осмиофильную массу, локализованную между клеточными стенками. В клеточных стенках обнаружены электронно-плотные зернистые структуры размером 12-25 нм, которые предположительно являются комплексами гликопротеинов.
Для выявления изменений, происходящих при механоферментативном гидролизе глюкансодержащих участков клеточных стенок дрожжей, использована реакция восстановления аммиачного комплекса нитрата серебра. В исходных клетках, обработанных аммиачными комплексами серебра, электронно-плотные частицы локализуются внутри клетки, что говорит о внутриклеточном восстановлении серебра (рис. 4). В нативной клеточной стенке полисахариды формируют устойчивые структуры с низким содержанием доступных восстанавливающих центров, что определяет слабый контраст клеточной стенки. Ввиду незначительного содержания углеводов в водорастворимой части препарата (подтверждено химическим анализом) восстановление серебра в околоклеточном пространстве протекает незначительно, электронно-плотный продукт не образуется.
Механическая активация (рис. 5а) приводит к разрывам клеточных стенок, их фрагменты имеют гомогенную структуру и низкую электронную плотность, обусловленную низкой концентрацией восстанавливающих альдегидных групп.
Механоферментативный гидролиз биомассы дрожжей приводит к заметному увеличению реакционной способности клеточной стенки по отношению к аммиачным комплексам нитрата серебра. Гидролиз полисахаридов сопровождается значительным накоплением в стенке восстанавливающих альдегидных групп - потенциальных центров зародышеобразования металлических частиц серебра при реакции с аммиачными комплексами серебра. Результатом восстановления серебра является возникновение электронно-плотных отложений в клеточных стенках (рис. 5б).
Полученные ультраструктурные данные подтверждаются результатами химического анализа. Благодаря механической активации выход при экстракции свободных маннаноолигосахаридов и связанных с белками маннанопротеинов увеличивается в 2,4 раза.
Рис. 1. Ультратонкий срез исходных клеток дрожжей. Отчетливо видны клеточная стенка, органеллы, ядро
Рис. 2. Дрожжевые клетки после механической активации: а - клетка с частично поврежденной стенкой и разрушенными органоидами, б - клеточные стенки разрушенных клеток (имеют вид полос средней электронной плотности) окружены электронно-плотным клеточным детритом. Ультратонкие срезы, фиксация осмиевой кислотой
Рис. 3. Дрожжевая биомасса после механоферментативной обработки. Электронноплотный клеточный детрит и фрагменты клеточных стенок. Ультратонкий срез, фиксация осмиевой кислотой
Рис. 4. Исходная клетка дрожжей, препарат обработан аммиачными комплексами серебра. В клетке локализуются электронно-плотные частицы серебра. Ультратонкий срез, без контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца
Рис. 5. Препарат дрожжей, подвергнутых механоферментативной обработке: а - клеточные стенки после механической активации, б - фрагменты мембраноподобных структур после механической активации и ферментативного гидролиза. Участки высокой электронной плотности соответствуют отложениям металлического серебра. Ультратонкие срезы, без контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца
Таким образом, в процессе механической обработки дрожжевой биомассы происходит радиальный разрыв клеточной стенки. Нарушение структуры клеточной стенки сопровождается нарушением межмолеку-лярных взаимодействий внутри и между структурными слоями, разрывами ковалентных связей полимеров. Продукт механической активации обладает повышенной реакционной способностью.
Основным элементом растительной клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности, является целлюлозный каркас. Анализ литературных данных позволяет предположить, что клетки растительного сырья более устойчивы к механической активации, чем клетки дрожжевой биомассы [15, 16, 25, 26]. В световом микроскопе строение необработанных волокон гроздей масличной пальмы соответствует данным литературы [26-28]. Волокна образованы удлиненными сосудистыми клетками в центральной части и изометрическими клетками в периферийной части (рис. 6а).
Механическая обработка волокон приводит к измельчению материала, фрагментация волокон происходит преимущественно по границе между клеточными стенками (рис. 6б).
Клеточная стенка исходных волокон (рис. 7) не имеет выраженной периодической структуры, нет чёткого чередования электронно-плотных и электронно-прозрачных слоев, как в дрожжевой клеточной стенке, однако различимы слои шириной 70-100 нм, имеющие сходную электронную плотность.
В процессе механической обработки растительное сырье данного типа ведет себя отличным от дрожжевой клеточной стенки образом. Механическая активация вызывает разрушение волокон и образование крупных фрагментов (рис. 8а), которые формируются путем распространения трещин вдоль направления волокон, происходит расслоение клеточных стенок и отделение фрагментов. Следует отметить, что механическая активация не приводит к разупорядочению слоев клеточной стенки, однако в стенках становятся различимы слои толщиной около 30 нм (рис. 8а, б), до активации были видны лишь слои толщиной 70-100 нм. наиболее вероятный механизм этого структурирования - скольжение слоев относительно друг друга.
Рис. 6. а - поперечный срез волокна гроздей масличной пальмы после предварительной обработки в дезинтеграторе до размеров 2-4 см, б - фрагменты волокон после интенсивной механической обработки. Полутонкие срезы, окраска азуром-2
Рис. 7. Ультратонкие срезы клеточных стенок необработанных гроздей масличной пальмы
Рис. 8. Клеточные стенки механически обработанных гроздей масличной пальмы. Ультратонкие срезы
Гроздья масличной пальмы устойчивы к механическому воздействию благодаря строению клеточных стенок. Для повышения эффективности обработки механическую активацию проводили в присутствии 5% карбоната натрия, который в данном случае играет роль абразива.
Результатом такой обработки явились более выраженные изменения морфологии клеточных стенок: усилилась их фрагментация, уменьшился размер фрагментов (рис. 9а). Между соседними клеточными стенками наблюдалось образование протяженных трещин размером около 500 нм, стенки отслаивались друг от друга (рис. 9б). Разупоря-доченность структурных слоев при механической активации с абразивом не отмечается (рис. 9в).
Рис. 9. Клеточные стенки гроздей масличной пальмы, механически обработанные в присутствии карбоната натрия. Ультратонкие срезы
Проведенное исследование выявило некоторые особенности процессов, протекающих при механической активации дрожжевой биомассы и растительной ткани гроздей масличной пальмы. Установлено, что дрожжевая клеточная стенка обладает низкой устойчивостью к механическому воздействию, механическая активация дрожжевой биомассы приводит к радиальному разрыву клеточной стенки и разупорядочению ее структурных слоев. После механической активации остатки клеточных стенок выглядят гомогенными, что дает возможность сделать вывод о нарушении межмолекулярного взаимодействия как внутри структурных слоёв, так и между слоями в целом. Нарушение межмолекулярных взаимодействий сопровождается разрывом ковалентных связей в структурных полимерах клеточной стенки. Увеличение степени дефектности глюканового слоя позволяет повысить его реакционную способность по отношению к гетерогенным процессам, например реакции ферментативного гидролиза.
При механической активации волокон масличной пальмы происходит расслоение клеточных стенок вдоль волокон, образование сколов. При увеличении интенсивности обработки в клеточной стенке образуются трещины, сколы материала отмечается чаще и имеют меньшие размеры. Разупорядочение структурных слоев клеточной стенки не наблюдается даже в случае механической активации с абразивным материалом, что говорит о большей механической устойчивости структуры растительной клеточной стенки по сравнению со структурой дрожжевой стенки.
Выводы
Выявлены и проанализированы процессы, происходящие при механической активации в клеточных стенках дрожжей и гроздей масличной пальмы Elaeis guineensis.
Тип процессов зависит от выбранного сырья и структурных особенностей клеточной стенки. Увеличение реакционной способности, происходящее в результате механической активации, определяется механическим разрушением клеточной стенки, разупорядочением надмолекулярных структур биополимеров клеточной стенки.
В результате механической активации дрожжевой биомассы происходит разупорядочение надмолекулярной структуры клеточной стенки, увеличивается дефектность глюканового слоя, вследствие чего значительно возрастает реакционная способность структурообразующего компонента - глюкана.
В результате механической активации волокон гроздей масличной пальмы Elaeis guineensis разрушение материала идет по границе клеточных стенок. В случае низкой интенсивности механического воздействия разрушение происходит путем образования осколков вдоль волокон стенки, а в случае высокой интенсивности механической активации - путем расслоения клеточных стенок. По-видимому, при механической активации ультраструктура слоёв клеточной стенки Elaeis guineensis не изменяется, однако слои могут смещаться друг относительно друга.
Список литературы
1. Boldyrev V.V., Tkacova K. Mechanochemistry of solids: Past, Present, and Prospects // J. materials synthesis and processing. 2000. V. 8. Pp. 121-132.
2. Shakhtshneider T.P., Boldyrev V.V. In Reactivity of Molecular Solids / Ed. E. Boldyreva and V. Boldyrev, John Wiley & Sons, LTD, England. 1999. Pp. 271-311.
3. Ломовский О.И. Прикладная механохимия: Фармацевтика и медицинская промышленность // Обработка дисперсных материалов и сред: периодический сборник научных трудов. Одесса, 2001. С. 81-100.
4. Алтунина Л.К., Госсен Л.П., Тихонова Л.Д. Исследование структуры целлюлозосодержащих материалов в процессе механической активации // Журнал прикладной химии. 2002. Т. 75. С. 166-167.
5. Берлин А.А. О некоторых биологических проблемах механохимии природных полимеров // Биофизика. 1963. Т. 8. С. 28-33.
6. Липатова И.М., Одинцова О.И., Падохин В.А. Новые загущающие препараты на основе механохимически модифицированной Na-кабоксиметилцеллюлозы // Текстильная химия. 1997. Т. 2. С. 26-29.
7. Луканин А.В., Кривой Б.А., Вышелесский А.Б. Автолизаты - белково-витаминные и кормовые добавки // Биотехнология: состояние и перспективы развития: тез. докл. III междун. конгресса. М., 2005. С. 268.
8. Ставицкая С.С., Миронюк Т.И., Картель Н.Т. Сорбционные свойства «пищевых волокон» во вторичных продуктах переработки растительного сырья // Журнал прикладной химии. 2001. Т. 74. С. 575-578.
9. Горохова В.Г., Петрушенко Л.Н., Шишко А.А., Чернова В.Г. Импульсная механохимическая обработка полимеров растительного происхождения // Доклады Академии наук. 1995. Т. 343. С. 62-64.
10. Гофман П.М., Чупрова Н.А., Репях С.М. Совмещенное измельчение и экстракция древесной зелени хвойных в аппарате «струя-преграда» // Химия древесины. 1990. Т. 3. С. 108-112.
11. Ефанов М.В., Забелина А.В. Нитрование механохимически активированной лузги подсолнечника // Химия природных соединений. 2002. Т. 6. С. 4S2-4S7.
12. Ефанов М.В. О превращениях древесины осины и ее основных производных компонентов в реакции О-ацилирования // Химия природных соединений. 2001. Т. 5. С. 410-421.
13. Першина Л.А., Базарнова Н.Г., Ефанов М.В. Исследование превращений лигнина в процессе этерификации механохимически активированной древесины осины. 1. Этерификация гидроксильных групп лигнина // Химия растительного сырья. 1999. Т. 1. С. 107-111.
14. Калебина Т.С., Кулаев И.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 105-130.
15. Бирюзова В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки. М., 1993. 224 c.
16. Harthmann C., Delgado A. Numerical simulation of the mechanics of a yeast cell under high hydrostatic pressure // Journal of Biomechanics. 2004. V. 37. Pp. 977-9S7.
17. Pereira R.S. Detection of the absorbtion of glucose molecules by living cell using atomic force microscopy // FEBS Letters. 2000. V. 475. Pp. 43-46.
1S. Wold J., Mestecky M. Tomana Secretory immunoglobulin a carries oligosaccharide receptorsfor Escherichia coli Type 1 fimbrial lectin // Infection and Immunity. 1990. V. 5S. N9. Pp. 3073-3077.
19. Emmerik L.C.V., Kuijper E.J., Fijen C.A.P. Binding of mannan-binding protein to various bacterial pathogens of meningitis // Chin. Exp. Immunol. 1994. V. 97. Pp. 411-416.
20. Pat. USA №704S937 B2. Method and compositions for control of coccidiosis / K.A. Dawson, A.E. Sefton / 23.05.2006.
21. Белоусова Н.И., Гордиенко С.В., Ерошин В.К., Ильченко В.А. Получение смесей аминокислот на основе автолизатов дрожжей Saccharomyces, выращенных на этаноле или сахарах // Биотехнология. 1990. Т. 3. С. 6-9.
22. Pat. USA №4S10509. Method for producing yeast extract / Y. Kanegae, Y. Sugiyama, K. Minami / 07.05.19S9.
23. Pat. USA №60600S9. Product based on polysaccharides from bakers’ yeast and use as a technological coadjuvant for bakery products / F. Lazzari / 09.05.2000.
24. Рейвн П., Эверт P., Айкхорн С. Современная ботаника. М., 1990. Т. 2. 344 с.
25. Raven P.H., Evert R.F., Eichhorn S.E. Biology of Plants. Worth Publishers, Inc., London, 19S6.
26. Law K-N., Daud W.R.W., Ghazali A. Morphological and chemical nature of fibre strands of oil palm empty-fruit-bunch (OPEFB) // BioResources. 2007. V. 2. N3. Pp. 351-362.
27. Васильев А.Е., Воронин Н.С., Еленевский А.Г., Серебрякова Т.И. Ботаника. Анатомия и морфология растений. М., 197S. 4S0 с.
2S. RunCang Sun, Fang J.M., Mott L., Bolton J. Fractional isolation and characterization of polysaccharides from oil palm trunk and empty fruit bunch fibres // Holzforschung. 1999. V. 53. Pз. 253-260.
Поступило в редакцию 20 августа 2009 г.
