CC BY
63
УДК 615.216.2:577.3:612.822.3 Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
с. к. богус, о. а. дольская, п. а. галенко-ярошевский,
А. И. ВИСлОБОКОВ1, Ю. Д. ИГНАТОВ1, К. Н. МЕльНИКОВ1, В. А. БОРИСОВА1
изменения ионных токов нейронов моллюска под влиянием лидокаина и соединения S-1
Кафедра фармакологии Кубанского государственного медицинского университета,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: kybfarma@rambler.ru, тел. 8-928-429-21-22; 1ГОУВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова, Россия, 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8.
E-mail: vislobokov@yandex.ru, тел. (812) 499-71-02
Установлено, что местные анестетики лидокаин и новое соединение с местно-анестезирующей активностью S-1 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 1000 мкМ дозозависимо подавляли натриевые, кальциевые и калиевые токи. Амплитуда калиевых медленных токов при действии лидокаина в низких концентрациях (от 0,1 до 10 мкМ) возрастала на 5-10% по сравнению с контролем, а при более высоких - снижалась. В концентрации 1000 мкМ амплитуда всех ионных токов снижалась примерно на 50%, т. е. не обнаружено селективности действия исследованных веществ на ионные каналы. Мембранотропное действие лидокаина и S-1 на нейронах может быть реализовано также через влияние на неспецифическую проводимость мембраны, потенциал поверхностного заряда мембраны вблизи ионных каналов, кинетику активации или инактивации ионных токов. Соединение S-1 в большей степени подавляло натриевые, кальциевые (на 20%) и калиевые (на 10%) ионные токи, чем лидокаин, и оказывало более длительное последействие (в 2-3 раза), т. е. прочнее связывалось с ионными каналами.
Ключевые слова: местные анестетики, лидокаин, мембранотропное действие, нейроны, ионные токи.
s. k. bogus, o. a. dol'skaiy, p. a. galenko-yaroshevsky, a. i. vislobokov,
Yu. D. Ignatov1, K. N. MEL’NIKoV, V. A. BoRISoVA1
CHANGES OF IONIC CURRENTS OF NEURONS IN THE SNAIL UNDER THE INFLUENCE OF LIDOCAINE AND THE COMPOUND S-1
Pharmacology Department of the Kuban State Medical University,
Russia, 350063, Krasnodar, Senina street, 4. E-mail: kybfarma@rambler.ru, tel. 8-928-429-21-22;
1I. P. Pavlov State Medical University,
Russia, 197022, St. Petersburg, L. Tolstogo street, 6/8. E-mail: vislobokov@yandex.ru, tel. (812) 499-71-02
It was shown that the local anesthetics lidocaine and new compound with the local anesthetising effect S-1 in 0,1, 1, 10, 100 u 1000 |jM concentrations decreased sodium, calcium and potassium ionic currents in a concentration-dependent manner. An amplitude of potassium slow currents increased by 5-10% as compared to control under the influence of lidocaine in low concentrations (from 0,1 to 10 jM), whereas it decreased in higher concentrations. In the concentration 1000 jM an amplitude of all ionic currents decreased approximately by 50%, thus selectivity of the effect of the studied compounds on ionic channels was not found. The membranetropic effect of lidocaine and S-1 on neurons might also be carried out through the influence on nonspecific membrane conductivity, potential of membrane surface charge near ionic channels, kinetics of activation or inactivation of ionic currents. The compound S-1 inhibited the sodium, calcium (by 20%) and potassium ionic currents (by 10%) in a larger degree than lidocaine and had a 2-3 times more long-term aftereffect, i. e. was more bound to ionic channels.
Key words: local anesthetics, lidocaine, membranetropic effect, neurons, ionic currents.
Введение
Известно, что местные анестетики, реализующие своё действие на целостный организм через возбудимые клетки нервной и мышечной системы, среди фармакологических средств имеют большое практическое значение [3]. Их влияние на возбудимые мембраны объясняется способностью блокировать натриевые ионные каналы [1, 5, 7, 8, 11]. Действие анестетиков на кальциевые и калиевые каналы изучено в меньшей степени, а их функциональная роль в генерации биопотенциалов довольно велика [2, 4], поэтому изучение влияния на них местных анестетиков до сих пор актуально. В литературе есть данные о влиянии лидокаина на ионные каналы, но об эффектах нового соединения с лабораторным шифром S-1, обладающего местно-анестезирующей активностью, сведения отсутствуют. В этой связи целью работы было срав-
нительное исследование эффектов S-1 в сравнении с лидокаином в широком диапазоне концентраций на натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы нервных клеток.
Методы исследования
Объектом исследования были изолированные неи-дентифицированные нейроны [2] брюхоногого моллюска - прудовика большого ^утпаеа stagnalis). Ионные мембранные механизмы электрогенеза и закономерности функционирования нейронов моллюсков принципиально сходны с таковыми для нейронов млекопитающих [4]. Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем в течение 40-60 минут подвергали ферментативной обработке путём помещения в 0,25%-ный раствор трипсина на физиологическом растворе для прудовиков.
В работе использовали методику внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала [4] на целой клетке, помещаемой на полиэтиленовую пипетку. Разделение суммарных ионных токов на отдельные кальциевые, натриевые и калиевые производили композицией ионных составов вне- и внутриклеточных растворов нейронов и поддержанием соответствующих мембранных потенциалов [2, 4].
Перфузирующий раствор подавали в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий - внутрь этой пипетки. Для исследования использовали местные анестетики лидокаин и
А 120 110 100
^ 90
га
О 80
о
Б 70 60 50 40
-7 -6 -5 -4 -3
С, 1*10 м
S-1 (гидрохлориды, соответственно 0,5%-ный раствор, «ASTA», Швеция, и субстанцию) в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 1000 мкМ.
Исследуемые вещества в различных концентрациях добавляли в перфузирующий раствор. Эффект развивался быстро и стабилизировался через 2-3 мин, отмывание вели 5-7 мин. Оценку изменений амплитуды и кинетики ионных токов при действии исследованных соединений вели визуально с экрана осциллографа или после распечатки кривых токов, введённых в компьютер. На основании полученных данных были построены вольт-амперные характеристики мембраны для
Г
Рис. 1. Изменения кальциевого тока нейронов прудовика под влиянием лидокаина и соединения S-1
А - зависимости «концентрация-эффект» при действии лидокаина (верхняя кривая, п = 9) и S-1 (нижняя кривая, п = 12). Б - изменения амплитуды и кинетики тока при действии лидокаина, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 - лидокаин 10 мкМ, 3 - 1000 мкМ, 4 - отмывание. В - вольт-амперные характеристики натриевых каналов (смещение максимума ВАХ вправо): 1 - контроль, 2 - лидокаин 100 мкМ, 3 - 1000 мкМ, 4 - отмывание. Г - то же при действии соединения S-1 (смещение максимума ВАХ влево): 1 - контроль, 2 - 10 мкМ, 3 - 1000 мкМ, 4 - отмывание (пунктир). По оси абсцисс: А - концентрация анестетиков (С), Б - время (Т = 10 мс), В и Г - пилообразное смещение мембранного потенциала от -40 до 50 мВ за 10 мс (V), по оси ординат - ионный ток (А: I - при действии вещества, 10 - до действия; доверительные интервалы при р = 95%; 1Са - кальциевый ток).
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
различных каналов и зависимости «концентрация -эффект» (по 5-13 измерений для каждой точки кривой). Исходные величины ионных токов принимали за 100%, а установившиеся при действии всех веществ выражали в процентах к исходным и обрабатывали статистически с использованием ^ критерия Стьюдента.
результаты исследования
Под влиянием лидокаина и S-1 дозозависимо и обратимо снижалась амплитуда кальциевого тока, при этом лидокаин подавлял ее на 15-20% слабее (рис. 1). Обратимость эффектов подавления токов после отмывания почти соответствовала исходным значениям, при этом лидокаин отмывался в 2-3 раза быстрее (за 2-3 мин), чем S-1 (за 5-10 мин).
Кинетика развития кальциевых токов под влиянием анестетиков изменялась мало, при их действии в концентрации 1000 мкМ происходило примерно одинаковое замедление активации и инактивации тока (рис. 1, В), под влиянием лидокаина максимум вольт-ампер-ных характеристик незначительно (до 10 мВ) сдвигался вправо по оси потенциалов (рис. 1, В), т. е. потенциал фиксированных зарядов мембраны изменялся (вероятно, снаружи он становился менее отрицательным), а под влиянием S-1 - влево (рис. 1, Г), т. е. в противоположную сторону (как обычно при действии анионов). Неспецифические токи утечки мембраны при действии анестетиков в низких концентрациях (до 10 мкМ) незначительно повышались, при отмывании - уменьшались до исходного значения, под влиянием более высоких концентраций (вплоть до 1000 мкМ) - обратимо понижались, что указывает на увеличение/снижение неспецифической проводимости мембраны и изменение стабильности мембраны. Следует заметить, что подобные изменения неспецифической проводимости мембраны наблюдались также при регистрации натриевых и калиевых токов.
Амплитуда натриевых токов при действии анестетиков снижалась (рис. 2), в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ соединение S-1 несколько сильнее (до 20%) подавляло токи, чем лидокаин (рис. 2, А). Восстановление токов после действия анестетиков было полным уже за 3-5 мин, но после S-1 восстановление было более медленным.
Характер изменения натриевых токов под влиянием анестетиков показан на рис. 2, Б (снижение амплитуды и незначительное замедление инактивации). Максимум вольт-амперных характеристик мембраны для натриевых каналов при действии лидокаина смещался вправо по оси потенциалов (рис. 2, В), а соединения S-1 - влево (рис. 2, Г, кривая 2), как и при действии на кальциевые каналы.
Влияние лидокаина на медленные калиевые каналы (рис. 3, А) было двухфазным: при концентрациях лидокаина до 10 мкМ амплитуда токов незначительно возрастала, а при более высоких - снижалась (в концентрации 1000 мкМ - примерно до 50%), а под влиянием S-1 изменения были монофазными (подавление). В целом подавление тока соединением S-1 было сильнее (до 10%), чем лидокаином. Восстановление токов в процессе отмывания нейронов происходило так же, как для кальциевых и натриевых токов - полное, но для лидокаина - более быстро.
Под влиянием анестетиков в концентрациях 100 и 1000 мкМ происходило ускорение инактивации калиевого тока (рис. 3, Б и Г, нижние кривые), при действии
S-1 оно было более сильным, т. е. оно несколько активнее входило и связывалось в канале. При действии анестетиков в концентрации 1000 мК наблюдалось небольшое смещение вольт-амперной характеристики каналов вправо (рис. 3, Г, кривая 4), т. е. потенциал фиксированных зарядов мембраны вблизи калиевых каналов также изменялся.
Характер влияния анестетиков на быстрые калиевые токи внешне напоминал их влияние на медленные калиевые, но изменений в кинетике их развития не было.
Таким образом, исследованные анестетики лидокаин и S-1 в концентрациях 0,1 1000 мкМ обладают
выраженным мембранотропным действием, которое проявлялось в изменении ионных токов через потенциалоуправляемые ионные каналы нейронов прудовика. Вызывают интерес активация калиевых медленных токов под влиянием низких концентраций лидокаина (до 10 мкМ), ускорение инактивации калиевых токов, а при действии нового соединения S-1 - смещение максимума вольт-амперных характеристик каналов влево по оси потенциалов. В более высоких концентрациях (1000 мкМ) происходило дозозависимое и примерно равнозначное подавление всех токов до 50% от контроля. В целом лидокаин на 10-20% слабее подавлял ионные токи, чем S-1, а отмывался быстрее.
обсуждение
Из литературы известно, что лидокаин в концентрациях 10 - 3000 мкМ блокировал активированные и инактивированные натриевые каналы на одиночных кардиомиоцитах предсердия человека, в концентрации 400 мкМ на миокардиальных клетках крысы увеличивал постоянную времени медленной натриевой инактивации [6]. Наши данные о характере подавления ионных токов нейронов моллюсков анестетиками не противоречат данным литературы, а полученные результаты можно экстраполировать и на каналы теплокровных животных.
Молекулярный механизм подавления токов изученными анестетиками связан с тем, что снижается количество функционирующих каналов вследствие связывания их молекул со структурами ионных каналов [5, 9-11 ]. Снижение ионных токов возможно также по причине уменьшения времени открытого состояния одиночных каналов или уменьшения частоты их открывания. Вероятно, это было и в наших опытах, поскольку кинетика развития ионных токов изменялась. Ускорение инактивации калиевых медленных токов указывает на вхождение молекул анестетика в открытые каналы, не исключается и возможность взаимодействия исследованных веществ с воротными механизмами каналов.
Подавление всех ионных токов при действии анестетиков примерно в равной степени и в равных концентрациях свидетельствует о неспецифичности (не-избирательности) их влияния на те или иные ионные каналы. Многие соединения подавляют кальциевые, натриевые и калиевые ионные токи, но вместе с тем часто выявляются и индивидуальные черты их действия. В принципе, для каждого соединения обнаруживаются некоторые особенности их мембранотропного действия, которое, вероятно, определяется структурой молекул этих соединений и их взаимодействием со структурами мембраны (связь «структура - действие»). Так, из наших результатов можно видеть тенденцию
Рис. 2. Изменения натриевого тока нейронов прудовика под влиянием лидокаина и соединения S-1
А - зависимости «концентрация - эффект» при действии лидокаина (верхняя кривая, п = 9) и S-1 (нижняя кривая, п = 13). Б - изменения амплитуды и кинетики тока при действии лидокаина, кривые снизу вверх: 1 - контроль, 2 - лидокаин 10 мкМ, 3 - отмывание, 4 - 100 мкМ, 5 - 1000 мкМ. В - вольт-амперные характеристики натриевых каналов: 1 - контроль, 2 - лидокаин 10 мкМ, 3 - 100 мкМ, 4 - 1000 мкМ. Г - то же при действии соединения Э-1: 1 - контроль, 2 - 10 мкМ, 3 - 100 мкМ, 4 - 1000 мкМ, 5 - отмывание. По оси абсцисс: А - концентрация анестетиков (С), Б - время (Т = 10 мс), В и Г - пилообразное смещение мембранного потенциала от -40 до 50 мВ за 10 мс (V), по оси ординат - ионный ток (А: I - при действии вещества, 10 - до действия; доверительные интервалы при р = 95%; Б - Г: 1Ма - натриевый ток).
более сильного подавления лидокаином и S-1 натриевых токов, а соединением S-1 - и калиевых, которое проявлялось при концентрации 1000 мкМ.
Специфичной для соединения S-1 оказалась его способность смещать максимум вольт-амперных характеристик натриевых и кальциевых каналов влево по оси потенциалов, что позволяет сделать предположение о возможном нескомпенсированном в молекуле отрицательном заряде, который и уменьшает количество положительных фиксированных зарядов на наружной стороне мембраны.
Неселективное подавление токов можно связывать с какими-то едиными мембранными механизмами действия: примерно с одинаковым вхождением веществ в устье разных ионных каналов, возможно также, что вследствие липофильности молекул анестетиков [9] их взаимодействие с липидами мембраны приводит к сходным нарушениям функционирования всех ионных
каналов. Не исключаются проникновение анестетиков внутрь клетки и их действие с внутриклеточной стороны. Возможно, что с этим может быть связано длительное последействие анестетиков, поскольку их вымывание из клетки затруднено.
Местные анестетики оказывают существенное влияние на активность электровозбудимых клеток, возможно, через прямое действие на структуру потенциалоуправляемых ионных каналов, что, вероятно, сопровождается изменением информационных свойств белковой молекулы каналов. Изменение информационных свойств макромолекул канала может быть также опосредовано изменением ферментативной активности фосфолипаз, происходящей в результате взаимодействия анестетиков с билипидным слоем мембраны.
Неспецифический мембранный ток утечки (неспецифическая проводимость), как показатель стабильности мембраны, также указывает на изменения
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
-7 -6 -5 -4 -3
С, 1*10 n, м
Рис. 3. Изменения калиевого медленного тока нейронов прудовика под влиянием лидокаина и соединения S-1
А - зависимости «концентрация - эффект» при действии лидокаина (верхняя кривая, п = 6) и соединения S-1 (нижняя кривая, п = 7). Б - изменения амплитуды и кинетики тока, кривые сверху вниз под стрелкой: 1 - отмывание, 2 - контроль, 3 - лидокаин 10 мкМ, 4 - 100 мкМ, 5 - 1000 мкМ. В - вольт-амперные характеристики: 1 - контроль, 2 - отмывание, 3 - S-1 100 мкМ, 4 - 1000 мкМ. Г - то же, что и В, но при действии S-1: 1 - контроль, 2 - S-1 0,1 мкМ, 3 - отмывание, 4 - S-1 100 мкМ, 5 - S-1 1000 мкМ. По оси абсцисс: А - концентрация анестетиков (С), Б и Г - время (Т); В - пилообразное смещение мембранного потенциала от -30 до 50 мВ за 100 мс (V), по оси ординат - ионный ток (А: I - при действии вещества, 10 - до действия; доверительные интервалы при р = 95%; Б - Г: 1Кз - калиевый ток).
конформационной подвижности макромолекул, зависящей от концентрации фармакологического агента. В случае малых доз конформационная активность молекул может быть повышена, а в случае больших - снижена, и может наблюдаться повреждающее действие.
Таким образом, полученные результаты о большей активности в подавлении ионных токов соединением S-1 по сравнению с лидокаином убедительно свидетельствуют об их сильном мембранотропном действии, выражающемся в дозозависимом подавлении (иногда увеличении) токов, в изменениях неспецифических токов утечки, кинетики токов, в изменениях потенциала поверхностного заряда мембран.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вислобоков А. И., Зайцев А. А., Игнатов Ю. Д., Савось-кин А. Л. Мембранные механизмы действия на нервные клетки анестетиков, анальгетиков и противоаритмических средств // Мед. акад. вестник. - 2001. - Т. 1. № 1. - С. 25-33.
2. Вислобоков А. И., Игнатов Ю. Д., Мельников К. Н. Фармакологическая модуляция ионных каналов мембраны нейронов. -СПб: издательство СПбГМУ, 2006. - 288 с.
3. Галенко-Ярошевский А. П., Хоронько В. В., Пономарев В. В. и др. Многосторонность аспектов действия местных анестетиков // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2005. - Т. 140. № 9. -С. 28-32.
4. Костюк П. Г., Крышталь О. А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М., 1981. - 204 с.
5. Decher N., Pirard B., Bundis F. et al. Molecular basis for Kv1.5 channel block: conservation of drugs binding sites among voltage-gated K+ channels // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. № 1. - P. 394-400.
6. MillerK. W. The nature of sites of general anaesthetic action // Br. J. Anaesth. - 2002. - Vol. 89. № 1. - P. 17-31.
7. Nerbonne J. M. Molecular basis of functional voltage-gated K+ channel diversity in the ammalian myocardium // J. Physiol. - 2000. -Vol. 525. № 2. - P. 285-298.
8. Nilsson J., Madeja M., Arhem P. Local anesthetic block of Kv channels: role of the S6 helix and the S5-S6 linker for bupivacaine action // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 63. - P. 1417-1429.
9. Shimooka T., Shibata A., Terada H. The local anesthetic tetracaine destabilizes membrane structure by interaction with polar headgroups of phospholipids // Bioch. et Bioph. Acta. - 1992. -Vol. 1104. № 2. - P. 261-268.
