CC BY
53
АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ФАРМАКОЛОГИИ
С. К. БОГуС, О. А. дольская, А. И. ВИСлОБОКОВ1, П. А. ГАЛЕНКО-ЯРОШЕВСКИй
мембранотропная активность соединения S-8 в сравнении с лидокаином
Кафедра фармакологии Кубанского государственного медицинского университета,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: kybfarma@rambler.ru, тел. 8-928-429-21-22; 1ГОУВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова, Россия, 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8.
E-mail: vislobokov@yandex.ru, тел. (812) 499-71-02
Установлено, что новое соединение с местно-анестезирующей активностью S-8 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 1000 мкМ дозозависимо подавляет натриевые, кальциевые и калиевые ионные токи, подобно местному анестетику лидокаину. Амплитуда калиевых медленных токов при действии обоих соединений в низких концентрациях (от 0,1 до 10 мкМ) возрастала на 5-10% по сравнению с контролем, а при более высоких - снижалась. В концентрации 1000 мкМ амплитуда всех ионных токов снижалась примерно на 50%, т. е. не обнаружено селективности действия исследованных веществ на ионные каналы. Мембранотропное действие лидокаина и S-8 на нейронах может быть реализовано также через влияние на потенциал поверхностного заряда мембраны вблизи ионных каналов, кинетику активации или инактивации ионных токов. Соединение S-8 обладает заметной мембрано-тропной активностью, не уступая при этом лидокаину, но обладает более длительным последействием, чем лидокаин, в особенности при действии на калиевые каналы, т. е. прочнее связывается со всеми ионными каналами. В целом соединение S-8 может быть перспективным, но его применение затрудняется из-за взаимодействия с ионами кальция физиологического раствора.
Ключевые слова: местные анестетики, лидокаин, мембранотропное действие, нейроны, ионные токи.
S. K. BOGUS, О. A. DOL'SKAIY, A. I. VISLOBOKOV1, P. A. GALENKO-YAROSHEVSKY
MEMBRANETROPIC EFFECT OF THE COMPOUND S-8 IN COMPARISON WITH LIDOCAINE
Pharmacology Department of the Kuban State Medical University,
Russia, 350063,Krasnodar, Senina street, 4.
E-mail: kybfarma@rambler.ru, tel. 8-928-429-21-22;
1I. P. Pavlov State Medical University,
Russia, 197022, St. Petersburg, L.Tolstogo street, 6/8. E-mail: vislobokov@yandex.ru, tel. (812) 499-71-02
It was determined that a new compound with the local anesthetising effect S-8 in 0,1, 1, 10, 100 u 1000 |jM concentrations decreased sodium, calcium and potassium ionic currents in a concentration-dependent manner similarly to the local anesthetic lidocaine. An amplitude of potassium slow currents under the effect of both compounds in low concentrations (from 0,1 to 10 (jM)) increased by 5-10% as compared to control, whereas it decreased in higher concentrations. In the concentration 1000 jM an amplitude of all ionic currents decreased approximately by 50%, i. e. selectivity of the effect of the studied compounds on ionic channels was not found. The membranetropic effect of lidocaine and S-8 on neurons might also be carried out through the influence on the potential of the membrane surface charge near ionic channels, kinetics of activation or inactivation of ionic currents. The compound S-8 possesses the evident membranetropic activity like lidocaine, but it has a more long-term aftereffect as compared to lidocaine, especially having the influence on potassium channels, i. e. is more bound to all ionic channels. In general the compound S-8 may be considered to be perspective, but its application is complicated because of the interaction with calcium ions of the physiological solution.
Key words: local anesthetics, lidocaine, membranetropic action, neurons, ionic currents.
Введение
Известно, что местные анестетики, реализующие своё действие на целостный организм через возбудимые клетки нервной и мышечной системы, среди фармакологических средств имеют большое практическое значение [5]. Их влияние на возбудимые мембраны объясняется способностью блокировать натриевые ионные каналы [4,
6, 9, 10]. Действие анестетиков на кальциевые и калиевые каналы изучено в меньшей степени, а их функциональная роль в генерации биопотенциалов и регуляции функций клеток довольно велика [2, 3, 5], поэтому изучение влияния на них местных анестетиков актуально. В литературе есть
данные о влиянии лидокаина на ионные каналы, но об эффектах нового соединения с лабораторным шифром S-8, обладающего местно-анестезирующей активностью, сведения отсутствуют. Целью работы было сравнительное исследование эффектов S-8 в сравнении с лидокаином в широком диапазоне концентраций на натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы нервных клеток.
Методы исследования
Объект исследования - изолированные неиденти-фицированные нейроны [1, 2] брюхоногого моллюска - прудовика большого ^утпаеа stagnalis). Ионные
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009 УДК 615.216.2:577.3:612.822.3
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
мембранные механизмы электрогенеза и закономерности функционирования нейронов моллюсков принципиально сходны с таковыми для нейронов млекопитающих [2]. Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем в течение 40-60 минут подвергали ферментативной обработке путём помещения в 0,25%-ный раствор трипсина на физиологическом растворе для прудовиков.
В работе использовали методику внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала на целой клетке, помещаемой на полиэтиленовую пипетку. Разделение суммарных ионных токов на отдельные кальциевые, натриевые и калиевые производили композицией ионных составов вне- и внутриклеточных растворов нейронов и поддержанием соответствующих мембранных потенциалов [1, 2].
Для исследования использовали лидокаин и соединение S-8 (гидрохлориды, соответственно 0,5%-ный раствор, «ASTA», Швеция, и субстанцию) в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкМ. Соединение S-8 хорошо растворимо в дистиллированной воде, раствор имеет желтый цвет и слабый специфический запах, но при
добавлении до концентрации 1000 мкМ в физиологический раствор, содержащий ионы кальция, оно выпадает в осадок (раствор мутнеет), его концентрация становится неопределенной, поэтому основное внимание было направлено на оценку общей направленности эффектов в сравнении с лидокаином. Вещества добавляли в наружные (перфузирующие) растворы. На основании полученных данных с помощью компьютера были построены вольт-амперные характеристики (ВАХ) мембраны и графики зависимостей эффектов. Исходные величины амплитуд токов принимали за 100%, а установившиеся при действии веществ - выражали в % от исходных и обрабатывали статистически с использованием ^ критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Влияние лидокаина. Под влиянием лидокаина дозозависимо и обратимо снижалась амплитуда кальциевого и натриевого токов (рис. 1, А; 2, Б). Обратимость эффектов после отмывания за 2-3 мин почти соответствовала исходным значениям. При действии в концентрации 1000 мкМ происходило замедление активации
А 120
100
80
sO о4
о 60
40
20
0
□ Ina □ lea □ Iks
£^5
І
Й
і
її
г
-7 -6 -5 -4
С, 1*10", м
І„ ,нА Са
Рис. 1. Изменения ионных токов нейронов прудовика под влиянием лидокаина
А - зависимости «концентрация - эффект» при действии лидокаина. Б - вольт-амперные характеристики натриевых каналов (смещение максимума ВАХ вправо): 1 - контроль, 2 - лидокаин 10 мкМ, 3 - 100 мкМ, 4 - 1000 мкМ. В -вольт-амперные характеристики кальциевых каналов (смещение максимума ВАХ вправо): 1 - контроль, 2 - лидокаин 100 мкМ, 3 - 1000 мкМ, 4 - отмывание. Г - изменения амплитуды и кинетики калиевых медленных токов при действии лидокаина, кривые сверху вниз: 1 - лидокаин 1 мкМ, 2 - 10 мкМ, 3 - контроль, 4 - отмывание, 5 - 1000 мкМ.
По оси абсцисс: А - концентрация анестетиков (С), Б и В - пилообразное смещение мембранного потенциала от -40 до 50 мВ за 10 мс (V), Г - время; по оси ординат - ионный ток (А: I - при действии вещества, 10 - до действия; доверительные интервалы при р = 95%); Б - Г - ионные токи.
Рис. 2. Изменения натриевого тока нейронов под влиянием соединения S-8 и лидокаина
А - уменьшение амплитуды и отсутствие изменений кинетики натриевого тока (верхняя кривая - S-8, 100 мкМ), нижняя - контроль, средняя - частичное отмывание). Б - уменьшение амплитуды и отсутствие изменений кинетики натриевого тока (нижняя кривая - контроль, средняя - лидокаин 100 мкМ, верхняя - 1000 мкМ). В - уменьшение максимума вольт-амперной характеристики натриевых каналов (1 - контроль) и его небольшое смещение влево по оси потенциалов при действии S-8 10 мкМ (кривая 2) и 100 мкМ (кривая 3) или вправо - при действии лидокаина в концентрации 100 мкМ (кривая 4). Г - на другом нейроне, уменьшение максимума вольт-амперной характеристики натриевых каналов при действии S-8 в концентрации 100 мкМ (верхняя кривая), контроль - нижняя кривая, отмывание - средняя кривая.
По оси абсцисс: А, Б - время (Т = 10 мс), В - Г - пилообразное смещение мембранного потенциала от -40 до 50 мВ за 10 мс (V), по оси ординат - ионный ток.
и инактивации кальциевого тока, а максимум вольт-ам-перных характеристик обоих токов незначительно (до 10 мВ) сдвигался вправо по оси потенциалов (рис. 1, Б, В), т. е. потенциал фиксированных зарядов мембраны изменялся (вероятно, снаружи он становился менее отрицательным). Неспецифические токи утечки мембраны при действии лидокаина в низких концентрациях (до 10 мкМ) незначительно повышались, при отмывании -уменьшались до исходного значения, под влиянием более высоких концентраций (вплоть до 1000 мкМ) -обратимо понижались, что указывает на увеличение/ снижение неспецифической проводимости мембраны и изменение ее стабильности. Следует заметить, что подобные изменения неспецифической проводимости мембраны наблюдались также при регистрации натриевых и калиевых токов.
Влияние лидокаина на медленные калиевые каналы (рис. 1, А) было двухфазным: при концентрациях лидо-каина до 10 мкМ амплитуда токов незначительно возрастала, а при более высоких - снижалась (в концентрации 1000 мкМ - примерно до 50%). Восстановление токов в процессе отмывания нейронов происходило так же, как для кальциевых и натриевых токов - полное. Под влиянием лидокаина в концентрациях 100 и 1000 мкМ происходили ускорение инактивации калиевого тока (рис. 1, Г, нижние кривые) и небольшое смещение вольт-амперной характеристики каналов вправо, т. е. потенциал фиксированных зарядов мембраны вблизи калиевых каналов также изменялся.
Влияние соединения S-8. Амплитуда натриевых токов также снижалась (рис. 2, А), в концентрациях около 1, 10 и 100 мкМ соединение S-8 в своем действии
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
напоминало эффекты лидокаина (рис. 2, Б). Восстановление токов после действия S-8 было полным уже за 3-5 мин. Максимум вольт-амперных характеристик мембраны для натриевых каналов при действии лидокаина смещался вправо по оси потенциалов (рис. 2, В, кривая 4), а соединения S-8 - влево (рис. 2, В и Г).
Под влиянием соединения S-8 дозозависимо и обратимо снижалась амплитуда кальциевого тока (рис. 3, А), видно, что максимум вольт-амперной характеристики при действии концентрации 100 мкМ (верхняя кривая, нижние кривые - контроль и отмывание) обратимо уменьшился на 25-30%, сдвига максимума по оси потенциалов не происходило. Под влиянием же лидокаина максимум вольт-амперных характеристик обычно незначительно (до 10 мВ) сдвигался вправо по оси потенциалов. Обратимость эффектов подавления токов после отмывания соответствовала исходным значениям.
Кинетика развития токов изменялась мало, при действии в концентрации 1000 мкМ происходило небольшое замедление активации и инактивации тока, подобно тому, как это было при действии лидокаина. Неспецифические токи утечки мембраны при действии S-8 почти не изменялись. Следует заметить, что подоб-
ное отсутствие изменений неспецифической проводимости мембраны наблюдалось также при регистрации натриевых и калиевых токов.
Изменения амплитуды медленных калиевых токов было двухфазным: в некоторых случаях при концентрациях до 100 мкМ амплитуда токов незначительно возрастала (рис. 3, В - Г), а при более высоких -снижалась (в концентрации 1000 мкМ - примерно но 50-80%), в некоторых случаях изменения были моно-фазными (рис. 3, Б) (подавление). В целом подавление тока соединением S-8 напоминало влияние лидокаина. Восстановление токов в процессе отмывания нейронов происходило так же, как для кальциевых и натриевых токов - полное, но после действия высоких концентраций - медленное.
Под влиянием S-8 в концентрациях 100 и 1000 мкМ происходило ускорение инактивации калиевого тока (рис. 3, В, Г), т. е. при открывании каналов молекула соединения входила и прочно связывалась с ними.
Таким образом, исследованные анестетики лидо-каин и S-8 в концентрациях 0,1 1000 мкМ обладают
выраженным мембранотропным действием, которое проявлялось в изменении ионных токов через потенци-
Рис. 3. Изменения ионных токов нейронов под влиянием соединения S-8
А - вольт-амперные характеристики кальциевых каналов (уменьшение максимума ВАХ): нижние кривые - контроль и отмывание, верхняя - S-8 (100 мкМ). Б - дозозависимое снижение амплитуды калиевого медленного тока под влиянием S-8 (кривые сверху вниз: контроль, 0,1, 1, 10 и 100 мкМ). В - влияние S-8: увеличение амплитуды тока (верхняя кривая - 100 мкМ), нижняя кривая - контроль, средняя кривая - отмывание. Г - влияние S-8: ускорение инактивации тока (верхняя кривая - контроль, средняя - отмывание, нижняя - 1000 мкМ).
По оси абсцисс: А - пилообразное смещение мембранного потенциала от -40 до 50 мВ за 10 мс (V), Б - Г - время (Т); по оси ординат - ионные токи.
алоуправляемые ионные каналы нейронов прудовика. Вызывает интерес ускорение инактивации калиевых токов, а при действии нового соединения S-8 - смещение максимума вольт-амперных характеристик каналов влево по оси потенциалов. В более высоких концентрациях (1000 мкМ) происходило дозозависимое и примерно равнозначное подавление всех токов до 50% от контроля. В целом соединение S-8 напоминало действие лидокаина на ионные каналы и может быть перспективным для применения.
Обсуждение
Молекулярный механизм подавления ионных токов анестетиками связан с тем, что снижается количество функционирующих каналов вследствие связывания их молекул со структурами ионных каналов, вероятно, с сегментами S5-S6 в устье канала [3, 4, 7, 8]. Снижение ионных токов возможно также по причине уменьшения времени открытого состояния одиночных каналов или уменьшения частоты их открывания. Вероятно, это было и в наших опытах, поскольку кинетика развития ионных токов изменялась. Ускорение инактивации калиевых медленных токов указывает на вхождение молекул анестетика в открытые каналы, не исключается и возможность взаимодействия исследованных веществ с воротными механизмами каналов.
Подавление всех ионных токов при действии анестетиков примерно в равной степени и в равных концентрациях свидетельствует о неспецифичности (не-избирательности) их влияния на те или иные ионные каналы. Многие соединения подавляют кальциевые, натриевые и калиевые ионные токи, но вместе с тем часто выявляются и индивидуальные черты их действия. В принципе, для каждого соединения обнаруживаются некоторые особенности их мембранотропного действия, которое, вероятно, определяется структурой молекул этих соединений и их взаимодействием со структурами мембраны (связь «структура - действие») [7, 11, 12].
Специфичным для соединения S-8 оказалась его способность смещать максимум вольт-амперных характеристик натриевых каналов влево по оси потенциалов, что позволяет сделать предположение о возможном нескомпенсированном в молекуле отрицательном заряде, который и уменьшает количество положительных фиксированных зарядов на наружной стороне мембраны.
Неселективное подавление токов можно связывать с какими-то едиными мембранными механизмами действия: примерно с одинаковым вхождением веществ в устье разных ионных каналов, ввиду того что имеется определенное сходство молекулярных структур натриевых и кальциевых ионных каналов (основная каналообразующая а1-субъединица). Возможно также, что вследствие липофильности молекул анестетиков [5,
7, 11] их взаимодействие с липидами мембраны приводит к сходным нарушениям функционирования всех ионных каналов. Не исключаются проникновение анестетиков внутрь клетки и их действие с внутриклеточной стороны. Возможно, что с этим может быть связано длительное последействие анестетиков, поскольку их вымывание из клетки затруднено.
Местные анестетики оказывают существенное влияние на активность электровозбудимых клеток, возможно, через прямое действие на структуру
потенциалоуправляемых ионных каналов, что, вероятно, сопровождается изменением информационных свойств белковой молекулы каналов. Изменение информационных свойств макромолекул канала может быть также опосредовано изменением ферментативной активности фосфолипаз, происходящей в результате взаимодействия анестетиков с билипидным слоем мембраны.
Неспецифический мембранный ток утечки (неспецифическая проводимость), как показатель стабильности мембраны, также указывает на изменения информационной подвижности макромолекул, зависящей от концентрации фармакологического агента. Обычно в случае малых доз конформационная активность молекул может быть повышена, а в случае больших - снижена, и может наблюдаться повреждающее действие. Под влиянием S-8 неспецифическая проводимость мембраны почти не изменялась.
Таким образом, полученные результаты о сходной активности в подавлении ионных токов соединением S-8 по сравнению с лидокаином убедительно свидетельствуют о достаточно сильном мембранотропном действии, выражающемся в дозозависимом подавлении (иногда увеличении) токов, в изменениях потенциала поверхностного заряда мембран. Интересные вопросы о месте связывания этих препаратов в ионном канале [3, 8-10] или на рецепторах мембраны требуют дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вислобоков А. И., Игнатов Ю. Д., Мельников К. Н. Фармакологическая модуляция ионных каналов мембраны нейронов. - СПб: издательство СПбГМУ, 2006. - 288 с.
2. Костюк П. Г., Крышталь О. А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М.: Наука, 1981. - 208 с.
3. Decher N., Pirard B., Bundis F. et al. Molecular basis for Kv1.5 channel block: conservation of drugs binding sites among voltage-gated K+ channels // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. № 1. - P. 394-400.
4. Fozzard H. A., Lee P. J., Lipkind G. M. Mechanism of local anesthetic drug action on voltage-gated sodium channels // Curr. Pharm. - 2005. - Vol. 11 (21). - P. 2671-2686.
5. Hille B. Ion channels of excitable membranes. Third Edition. -University of Washington, 2001. - 722 p.
6. Lipkind G. M., Fozzard H. A. Molecular modeling of local anesthetic drug binding by voltage-gated sodium channels // Mol. Pharmacol. - 2005. - Vol. 68 (6). - P. 1611-1622.
7. MillerK. W. The nature of sites of general anaesthetic action // Br. J. Anaesth. - 2002. - Vol. 89. № 1. - P. 17-31.
8. Nilsson J., Madeja M., Arhem P. Local anesthetic block of Kv channels: role of the S6 helix and the S5-S6 linker for bupivacaine action // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 63. - P. 1417-1429.
9. Scholz A. Mechanisms of (local) anaesthetics on voltage-gated sodium and other ion channels // Br. J. Anaesth. - 2002. -Vol. 89 (1). - P. 52-61.
10. Sheets M. F., Hanck D. A. Molecular action of lidocaine on the voltage sensors of sodium channels // J. Gen. Physiol. - 2003. -Vol. 121 (2). - P. 163-175.
11. Urban B. W. Current assessment of targets and theories of anaesthesia // Br. J. Anaesth. - 2002. - Vol. 89 (1). - P. 167-183.
12. Yano T., Ibusuki S., Takasaki M. A. comparison of intracellular lidocaine and bupivacaine concentrations producing nerve conduction block in the giant axon of crayfish in vitro // Anesth. Analg. - 2006. - Vol. 102 (6). - P. 1734-1738.
Поступила 07.08.2009
Кубанский научный медицинский вестник № 8 (113) 2009
