CC BY
24
ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕ Т ОЧНЫХ СТРУКТУР У КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВЗВЕШЕННЫХ ПЫЛЕВЫХ
ЧАСТИЦ (РМ2,5, РМю)
Намазбаева Зулкия Игеновна
д-р мед. наук, профессор, руководитель лаборатории экологической биохимии и генетики Национального центра гигиены труда и профессиональных
заболеваний, Республика Казахстан, г. Караганда
E-mail: zin9357@mail. ru Базелюк Людмила Тимофеевна д-р биол. наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории экологической биохимии и генетики Национального центра гигиены труда и профессиональных заболеваний, Республика Казахстан, г. Караганда
E-mail: bazeluk42@mail. ru Агеев Дмитрий Владимирович младший научный сотрудник лаборатории экологической биохимии и генетики Национального центра гигиены труда и профессиональных заболеваний,
Республика Казахстан, г. Караганда E-mail: ageevdimon88@mail. ru СабировЖанбол Байжанович младший научный сотрудник лаборатории экологической биохимии и генетики Национального центра гигиены труда и профессиональных заболеваний,
Республика Казахстан, г. Караганда E-mail: audacious zap@mail. ru
СНАЧСЕ8 IN THE FUNCTIONAL STATE OF THE CELL STRUCTURES IN RATS UNDER THE INFLUENCE OF SUSPENDED DUST PARTICLES
(PM25, РМю )
Zulkiya Namazbaeva
MD, Professor, Head of Laboratory, "National Center of Hygiene and Occupational
Diseases ", Republic of Kazakhstan, Karaganda
Lyudmila Bazelyuk
Sc.D.,Professor, Senior Researcher "National Center of Hygiene and Occupational
Diseases", Republic of Kazakhstan, Karaganda
Dmitriy Agueyev
research Associate "National Center of Hygiene and Occupational Diseases ",
Republic of Kazakhstan, Karaganda Zhanbol Sabirov
research Associate "National Center of Hygiene and Occupational Diseases ",
Republic of Kazakhstan, Karaganda
АННОТАЦИЯ
Целью данного исследования является экспериментальное изучение токсичности взвешенных частиц (РМ2;5, РМ10). В ходе 30-го дневного
эксперимента на подопытных животных (крысах) были проведены биохимические и цитологические исследования. В результате выявлен общетоксический эффект (свободно -радикальное окисление, дисбаланс ПОЛ/АОЗ, генерация метаболитов оксида азота, накопление средних молекул, на клеточном уровне — накопление нейтрофилов, снижение количества нормальных макрофагов, накопление деструктивных изменений в клетках внутренних органов.)
ABSTRACT
The purpose of this study is to investigate the toxicity of dust particles (РМ25, РМ10). During the 30-day experiment in experimental animals (rats) were carried out biochemical and cytological studies. He result revealed a general toxic effect (free-radical oxidation, the imbalance POL / AOS, the generation of nitric oxide metabolites, the accumulation of middle molecules, at a cellular level, neutrophil accumulation, reducing the amount of normal macrophages, the accumulation of destructive changes in the cells of internal organs).
Ключевые слова: ксенобиотики; токсичность; клетки лёгких; желудка; печени; щитовидная железа; почки.
Keywords: хепоЬ^^; toxicity; light, stomach; liver cells; thyroid; kidney.
Загрязнение атмосферного воздуха является одной из основных причин нарушения экологического равновесия и, как следствие, возникновения кризисных экологических ситуаций в промышленных регионах и оказывает наибольшее влияние на состояние здоровья большинства населения. По данным ВОЗ [6], воздействие атмосферного воздуха ежегодно приводит к смерти от 200 до 570 тыс. человек и на долю этого фактора приходится около 0,4—1,1 % всех случаев смерти в год. Определение концентрации пыли различных фракций (РМ25, РМ10) необходимо для получения фактических данных о качестве воздуха, оценки вреда, наносимого здоровью. Во многих странах мира накоплены обширные эпидемиологические и клинические
данные, свидетельствующие о серьёзных угрозах здоровью населения, обусловленному загрязнением атмосферного воздуха взвешенными частицами (TSP). В настоящее время атмосферная пыль становится одним из приоритетных загрязнителей при организации мониторинга окружающей среды [3, с. 41—43, 7, с. 2—4].
Многокомпонентные и сложные по составу взвешенные частицы (TSP) способны в силу своего химического состава и дисперсности глубоко проникать в организм и оказывать токсическое воздействие на метаболическом, клеточном, гормональном уровнях [2, с. 5—9].
Исследование воздействия взвешенных частиц — РМ25, РМ10, (TSP) проведено с целью выявления его токсичности в эксперименте, как наиболее распространенного загрязнителя на урбанизированных территориях и вместе с тем, как наименее изученного в качестве поллютанта.
Материалы и методы:
В эксперименте использовано 30 особей нелинейных крыс, весом 200— 220 гр., содержавшихся в условиях вивария. Опыты проводились с учетом требований работы с экспериментальными животными [4, c. 17]. Использована внутрибрюшинная методика введения TSP в дозе 25мг/мл (однократно). По истечении 30 дней проводили декапитацию крыс. Длительность эксперимента была выбрана с учетом способности TSP вызывать метаболические нарушения, с учетом отдаленных эффектов. По истечению срока эксперимента проводили цитологические, биохимические исследования.
Содержание органических веществ в пыли и воздухе определялось с помощью газовой хроматографии на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометром 5975 inert XL (USA). Содержание бенз(а)пирена определялось на высокоэффективном жидкостном хроматографе LC-20 Prominence фирмы Shimadzu (Япония).
Содержание тяжелых металлов в пробах пыли определялось с помощью атомно-абсорбционного метода на атомно -абсорбционном спектрометре с графитовой печью МГА-915.
Химический состав мелкодисперсной пыли (мг/мл) составил: углеводороды — 27; минеральные масла — 195; сажа — 14,8; ксилол — 12,3; бензол — 1,2; толуол — 2,3; формальдегид — 1,02; фенол — 0,14;бенз(а)пирен
— 0,00002; железо — 2,3; медь — 0,03; цинк — 0,67; марганец — 0,05; свинец
— 0,02; хром — 0,032; мышьяк — 0,008; кадмий — 0,015; никель — 0,027.
Биохимические исследования проводились на спектрометре СФ-2000 (Россия). Анализ цитоморфологических характеристик проводился на микроскопе МС-200 (Австрия, 2004). Одним из объективированных критериев безопасности, согласно концепции общей токсикологии, нами были оценены цитологические реакции со стороны следующих клеточных структур — бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), лёгкие, желудок, печень, щитовидная железа и почки. Под слабым эфирным наркозом вскрывали мышцы передней поверхности шеи, выделяли трахею, вводили в её просвет стальную иглу, которую фиксировали лигатурой. Через иглу в лёгкие вводили дробно 5 мл физиологического раствора и тут же отсасывали перфузат. Такая методика позволила получить бронхиальные смывы, не содержащие примеси крови. Центрифугирование проводили в течение 10 минут, при 2000 оборотов в минуту, надосадочную жидкость выливали, а из осадка делали мазки на БАЛ. С лёгких, желудка, печени, щитовидной железы и почек делали мазки — отпечатки, которые высушивали при комнатной температуре. Мазки окрашивали по Романовскому-Гимза. При микроскопировании с увеличением в 1000 раз, подсчитывали 200 клеток с каждого мазка [1, c. 30].
Результаты обрабатывали с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5.5 [5, c. 312].
Условные сокращения:
РМ — от англ. particulate matter — твёрдые примеси в атмосфере, мелкодисперсные фракции взвешенных веществ (РМ25 — РМ10)
TSP — взвешенные вещества, недифференцированная по составу пыль, аэрозоль в атмосферном воздухе
ПОЛ — перекисное окисление липидов
АОЗ — антиоксидантная защита
КД — диеновые конъюганты (первичный продукт)
ДК — диенкетоны (вторичный продукт)
NO — оксид азота
БАЛ — бронхолёгочный лаваж
АМ — альвеолярные макрофаги
БКК — большие канальцевые клетки
МКК — малые канальцевые клетки
ДМКК — дегенерированные малые канальцевые клетки
ДБКК — дегенерированные большие канальцевые клетки
ГК — главные клетки
ДГК — дегенерированные главные клетки
ДАМ — дегенерированные альвеолярные макрофаги
ДЦК — дегенерированные цилиндрические клетки
ДНЛ — дегенерированные нейтрофильные лейкоциты
ДОК — дегенерированные обкладочные клетки
ДСОК — дегенерированные слизеобразующие обкладочные клетки
СОК — слизеобразующие клетки
НЛ — нейтрофильные лейкоциты
ОК — обкладочные клетки
ПН-I — пневмоциты I- типа
ПН-II — дегенерированные пневмоциты II- типа
ДПН-I — дегенерированные пневмоциты I - типа
ДПН-II — дегенерированные пневмоциты II- типа
ТК — тёмные клетки
СК — светлые клетки
ДСК — дегенерированные светлые клетки.
Результаты:
После 30-дневного введения мелкодисперсной пыли внутрибрюшинно, биохимическими методами выявили возрастание первичных и конечных продуктов ПОЛ в бронхолёгочном лаваже, в легких и печени.
Значительное снижение ДК свидетельствует о начальной деструкции мембран и является неблагоприятным прогностическим тестом, так как в местах образования ДК создаются ионофорные участки, что приводит к увеличению концентрации внутриклеточных ионов натрия, в след за которым следует вода, происходит набухание клетки, а в последующем ее некроз, либо некробиоз. Возрастает количество вторичных продуктов в БАЛ, легких, печени, указывающие на высокую степень окисленности клеточных структур (табл. 1).
Таблица 1.
Показатели ПОЛ при воздействии мелкодисперсной пыли в дозе 25 мг/мл
БАЛ Легкие Печень
Показатели Контро ль п=12 Опытная группа п=18 Контро ль п=12 Опытная группаn= 18 Контрол ь п=12 Опытная группа п=18
КД (ус.ед.) 9,3±0,7 20,5±6,4 15,5±3,8 14,0±5,9 9,36±0,36 16,5±2,3
ДК (ус.ед.) 147,0±9, 3 30,0±21,4* * 153,2±3, 9 200±7,18 140±5,7 92,4±10,9 **
Вторич-
ные продукт ы 0,05± 0,001 1,93±0,06* * 0,05±0,0 1 0,18± 0,06** 0,05± 0,001 0,23±0,08 **
(ус.ед.)
Метабол
и-ты 0,063± 0,19±0,018 0,0064± 0,05± 0,0028± 0,026±
Ш(мк- 0,002 ** 0,0021 0,01** 0,001 0,043**
моль/л)
Каталаза (мкат/л) 0,05±0,0 2 0,02±0,001 0,05±0,0 2 0,03±0,03 0,37±0,05 0,4±0,02
* р<0,05 ** р<0,01
По -видимому, воздействие РМ вызывает интоксикацию, проявляющуюся снижением эффективности окислительного фосфорилирования. При этом, возможно, включаются компенсаторные механизмы, активизируется
электронный транспорт через альтернативные пути, что приводит к увеличению концентрации кислородных радикалов. Необходимо обратить внимание на однонаправленность изменений вторичных продуктов.
Вторичные продукты ПОЛ-триенкетоны способны мигрировать за счет двойных связей полиненасыщенных жирных кислот, образуя высоко реактивные дитриены. Одним из показателей, свидетельствующих об эндогенной интоксикации, является накопление метаболитов NO и средних молекул в биохимических жидкостях (табл. 2).
Таблица 2.
Метаболиты NO и содержание средних молекул при воздействии пыли в
дозе 25 мг/мл
Показатели СМ (усл.ед.) Метаболиты NO (мкмоль/л)
Контроль п=12 Опыт п=18 Контроль п=12 Опыт п=18
БАЛ 0,08±0,01 0,15±0,01* 20,3±0,6 12,4±0,32*
Сыворотка крови 0,17±0,01 0,31±0,04* 91,4±3,4 12,03±1,9*
* p<0,05
Согласно цитоморфологическим исследованиям, выявлено нарушение, проявляющееся повышением в БАЛ количества ДАМ на 89 %, ДЦК в 2,5 раза, по сравнению с контрольной группой (табл. 3). Со стороны лёгких отмечено повышение количества клеток ДАМ в 4 раза, снижение количества ПН-[ в 4,5 раза, повышение количества ДПН-1 в 2,9 раз и ДПН-П типа в 6 раз. У 50 % животных в макрофагах и ПН-1 и ПН-П типа обнаружена мутагенная активность (центральная ядерная перетяжка, двуядерные клетки) и в среднем составило (1,8+0,44 %), что на 38 % выше контрольных величин. Количество клеток с микробной обсеменённостью (стрептококки и стафилококки) повышено в 2,2 раза (табл. 4). Со стороны клеток желудка отмечено снижение количества главных клеток в 3,5 раза, обкладочных клеток в 3 раза, повышение количества ДОК в 2,1 раза и ДСОК в 8,8 раз и повышение количества микрофлоры в 7,5 раз, по сравнению с контрольной группой животных (табл. 5). Со стороны печени нами обнаружено повышение количества ДСК
гепатоцитов в 3,5 раза, в основном, встречались гепатоциты с вакуольной дистрофией (табл. 6). Со стороны щитовидной железы обнаружено снижение количества гранулированных В-клеток в 2,3 раза и повышение количества дегранулированных В-клеток в 6,6 раз (табл. 7). Со стороны почек обнаружено снижение количества БКК на 45% и МКК в 2 раза, повышение количества ДБКК в 2,8 раза и двуядерных клеток, по сравнению с контрольной группой в 32,1 раза (табл. 8).
Подводя итог наших исследований, можно сделать следующие выводы:
1. В экспериментальных исследованиях, при воздействии взвешенных частиц урбанизированных территорий, в состав которой входят соединения металлов и стойкие органические вещества, установлен токсический эффект, где общим метаболическим синдромом явилось: свободно -радикальное окисление, дисбаланс ПОЛ/АОЗ, генерация метаболитов оксида азота, накопление средних молекул.
2. На клеточном уровне в бронхиальных смывах у крыс выявлен цитоток-сический эффект пыли, проявляющийся повышением количества дегенерированных альвеолярных макрофагов и дегенерированных цилиндрических эпителиальных клеток, повышением количества микрофлоры, что приводит к снижению числа жизнеспособных клеток бронхоальвеолярного лаважа.
3. Со стороны лёгких обнаружено повышение количества дегенерированных альвеолярных макрофагов, снижение количества пневмоцитов I типа и пневмоцитов II типа, и повышение количества ДПН-1 типа и ДПН-П типа, что может приводить к нарушению газообмена в лёгких.
4. Со стороны желудка при действии пыли обнаружено снижение количества полноценных главных, обкладочных и повышение количества дегенерированных этих же клеток, что приводит к нарушению секреторной и всасывающей функции желудочных желёз.
5. В клетках печени мы обнаружили повышенное количество дегенерированных светлых гепатоцитов с вакуольной дистрофией, что приводит к нарушению детоксикационной функции печени.
6. Со стороны щитовидной железы отмечено снижение активных В-клеток, которые секретируют трийодтиронин (Т3) и отмечено резкое повышение дегранулированных В-клеток.
7. В почках наблюдается снижение количества нормальных больших и малых канальцевых клеток и повышение дегенерированных больших канальцевых клеток, резко повышено количество двуядерных клеток, что приводит к снижению клубочковой и фильтрационной функции почек.
Таблица 3.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток БАЛ крыс у самок при в/б введении пыли в дозе 25 мг/мл (п = 30;
М±ш)_
Группы животн ых НЛ ДНЛ АМ ДАМ Цилиндрические Эозинофил ы Микробная обсеменён-ность
норма дегенери-рованные
Контроль П = 12 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 78,60±2,6 3 17,96 ±2,45 1,42 ±0,92 2,02 ± 0,55 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00
пыль п = 6 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 60,9 ±8,99 34,08±3,97 * 0,0 ± 0,00 * 5,00 ±0,53 0,0 ± 0,00 34,16 ±12,35
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Таблица 4.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток легких крыс у самок при в/б введении пыли в дозе 25 мг/мл (п = _30; М±ш)_
Центр. ядерна Микроб
Группы животных АМ ДАМ ПН 1 типа ДПН 1 типа ПН 2 типа ДПН 2 типа НЛ Лимфо циты я перете ж-ка, 2-х ядерн. ная обсеменё н ность
Контроль 24,93± 0,57±0, 41,93±8, 8,21±0,9 9,86±2,6 1,22±0, 2,00±0, 11,28±4, 1,30±0, 26,43±4,5
п=12 4,23 15 46 1 4 68 75 00 15 3
пыль 36,16± 2,33±0, 9,17±2,5 23,75±5, 12,00±1, 7,42±1, 0,42±0, 8,75±2,1 1,80±0, 58,30±14,
п=6 6,26 53* 6* 11* 67 94* 17 1 44* 11*
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Таблица 5.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток желудка крыс у самок при в/б введении пыли в дозе 25 мг/мл (п =
30; М±ш)
Группы животн ых ГК ДГК ОК ДОК СОК ДСОК НЛ Тучны е клетки Микробна я обсеменён-ность
Контроль п = 12 23,71 ±2,54 5,66 ±1,20 53,71 ±3,92 10,87± 1,66 4,92 ±1,38 0,46 ±0,27 0,46 ±0,14 0,0 ±0,00 13,33 ±2,77
пыль п = 18 6,75 ± * 2,64 4,58 ±1,23 17,42±2, * 91 23,42±4,5 8* 7,33 ±1,23 40,50±7,8 * 5 0,00 ±0,00 0,0 ±0,00 * 100 ±17,64
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Таблица 6.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток печени крыс у самок при в/б введении пыли в дозе 25 мг/мл (п =
30; М±ш)
Группы животн ых Гепатоциты НЛ Эозиноф илы Двуядер-ные Купферов- ские (макрофаги) Фибробла с-ты
ТК СК ДСК
Контроль п = 12 27,37 ± 1,89 52,21 ±3,14 6,37 ± 1,61 2,37 ± 0,51 1,42 ± 0,32 2,46 ± 0,60 3,51 ± 1,02 4,29 ± 1,06
пыль 31,91±7, 33,80 22,50 0,83 ±0,26 0,00 3,66 3,80 ±0,70 3,50 ±1,76
п = 18 23 ±7,06 ±3,70 ±0,00 ±0,53
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Таблица 7.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток щитовидной железы крыс у самок при в/б введении пыли в дозе
25 мг/мл (п = 30; М±m)
Группы животны х А-клетки В-клетки С-клетки
Гранулиров ан-ные Дегранулиро-ванные Гранулированные Дегранулиро-ванные Гранулированные Дегранулиро-ванные
Контроль П = 12 34,62 ± 3,32 3,00 ± 0,64 45,70 ± 4,11 7,58 ± 1,43 8,39 ± 1,98 0,71 ± 0,09
пыль п = 18 26,00 ±4,94 3,50 ± 0,79 20,00 ± * 4,76 * 50,50 ±11,20 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Таблица 8.
Цитоморфологические показатели (в%) клеток почек крыс у самок при в/б введении пыли в дозе 25 мг/мл (п = _30; М±ш)_
Группы животны х БКК ДБКК МКК ДМКК НЛ ДНЛ Двуядер ные Эозино-филы Фибро-бласты
Контроль п = 12 65,08±4, 15 12,71±1,94 13,93±2,2 1 2,02 ±0,60 0,60± 0,11 0,0 ± 0,00 0,19 ± 0,04 0,47 ± 0,09 5,0 ± 0,73
пыль 45,00 ± 35,50 * 6,7 ±2,64 1,25 0,00 0,0 ± 6,10 ± 0,00 ± 5,45 ±
п = 18 * 7,58 ±6,88* ±0,09 ±0,00 0,00 1,41* 0,00 1,59
Примечание: */Достоверные изменения с контрольной группой (р<0,05)
Список литературы:
1. Базелюк Л.Т., Искакова С.А. Цитоморфологический прогностический тест для определения интоксикации парами серы: методические рекомендации. Астана, 2010. — 30 с.
2. Кулкыбаев Г.А. Концептуальные основы научной программы «Экология промышленного региона и здоровье населения» // Проблемы медицинской экологии. Караганда, 1995. — С. 5—9.
3. Новиков С.М., Иваненко А.В., Волкова И.Ф., Корниенко А.П., Скворцова Н.С. Оценка ущерба здоровью населения Москвы от воздействия взвешенных веществ в атмосферном воздухе // Гигиена и санитария. М, — 2009 — № 6. — С. 41—43.
4. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных: методические рекомендации. М., 1984. — 17 с.
5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2006. — 312 с.
6. Apheis. Air Pollution and Health a European Information System. Monitoring the Effects of Air Pollution on Health in Europe. Scientific report 1999—2000.
7. Harley J.F., Donnan P.T. Effects of air pollution on Health. // Report for the Externt Project, EC DGXII (Joule Programme). In European Commission, 1997, — P. 2—4.
