CC BY
42
Особенности апоптотической программы лимфоцитов в условиях техногенного загрязнения
^ Д.Г. Дианова, Н.В. Зайцева, О.В. Долгих
ФБУН “Федеральный научный центр медико-профилактических технологий
управления рисками здоровью населения”, г. Пермь
Состояние иммунной регуляции у детского населения, проживающего в условиях интенсивной техногенной нагрузки, характеризуется особенностями апоптотической программы лимфоцитов и модификацией клеточного цикла. На фоне повышенной контаминантной нагрузки (марганец, хром) наблюдается снижение интенсивности процесса клеточной гибели в аннексиновом тесте, что свидетельствует о срыве адаптационных процессов.
Ключевые слова: клеточный цикл, среда обитания, апоптотическая программа лимфоцитов.
Введение
Неудовлетворительное качество атмосферного воздуха приводит к формированию особенностей внешней среды, что сопровождается накоплением техногенных факторов в биосредах человека, в первую очередь детей. Накоплены научные данные, свидетельствующие о том, что на территориях интенсивного промышленного освоения с высокой степенью техногенной химической нагрузки окружающей среды эти проблемы стоят наиболее остро. Особую роль играет поступление в организм ребенка токсических веществ промышленного происхождения. Следовательно, индуцирующее влияние неблагоприятных техногенных химических факторов на детский организм диктует необходимость углубленного изучения состояния иммунной системы у данной категории населения.
Цель работы — оценка иммунного статуса у детей, проживающих на территории интенсивного промышленного освоения.
Контактная информация: Долгих Олег Владимирович, oleg@fcrisk.ru
Материал и методы
В работе использованы гигиенические, химико-аналитические и цитофлуори-метрические методы исследования. Всего, включая группу контроля, обследовано 153 ребенка дошкольного возраста (средний возраст 6,09 ± 0,11 года). Биомедицинские исследования у детей выполнены в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов медико-биологических исследований, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 г. с дополнениями 1983 г.
Мониторинг качества атмосферного воздуха осуществлялся на стационарных постах наблюдения (по данным Росгидромета). Выполнен расчет рассеивания загрязняющих веществ в атмосферном воздухе. Натурные исследования качества атмосферного воздуха выполнялись на территориях детских садов. Пробы воздуха исследовали на содержание взвешенных частиц (ТБР), мелкодисперсной пыли размером менее 2,5 мкм (РМ2 5) и менее 10 мкм (РМ10). Использован метод сопряжения
расчетных и натурных данных (аппроксимация).
Химико-аналитические исследования уровня контаминации биологических сред выполнены на базе лабораторно-испытательного центра Федеральное бюджетное учреждение науки “Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения”. Определение содержания металлов в крови обследуемых детей осуществляли методом атомно-абсорбционной спектро-фотометрии в соответствии с методическими указаниями.
Фенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы Becton Dickinson (BD, США). Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD95+, CD3+CD16+CD56+ (NKT), CD4+CD25+, CD4+CD25+CD127) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител к мембранным CD-рецепторам (BD, США). Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили методом, основанным на определении экспрессии фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом (Annexin V-FITC) Becman Coulter (BC, США), в качестве витального красителя был использован 7-амино-актиномицин D (7AAD) (BC, США).
Идентификация медиаторов межклеточной иммунной регуляции — маркеров цито-кинового профиля (интерлейкин (ИЛ)-ф, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, интерферон-у (ИФН-у), фактор некроза опухоли а (ФНО-а)) осуществлялась методом им-муноферментного анализа (тест-системы фирмы “Вектор-Бест”, г. Новосибирск) на анализаторе ELx808IU (BioTek, США).
Основную группу составили 53 ребенка дошкольного возраста, проживающие на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий. Критериями включения в исследование явились: воз-
раст детей от 4 до 7 лет, проживание на техногенно-нагруженных территориях. Критерии исключения: невозможность или нежелание родителей обследуемых детей подписать информированное согласие на участие в исследовании, участие обследуемых детей в другом исследовании. Все родители (опекуны) подписали информированное согласие на участие в исследовании и использование персональных данных.
В контрольную группу вошло 100 детей дошкольного возраста, проживающих вне зоны антропогенного влияния промышленных предприятий. Основная и контрольная группы были сопоставимы по полу, возрасту, соматической заболеваемости.
Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики с помощью программы Microsoft Office Excel 2003 и пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). Статистический анализ данных проводился методами описательной статистики и сравнения выборок (с использованием t-критерия Стьюдента), корреляционного анализа (с использованием коэффициента корреляции и коэффициента детерминации). Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных значений, количественные признаки представлены как M ± m (среднее арифметическое ± ошибка среднего). Характер статистического распределения по выборкам устанавливали по критерию согласия — х2. Различия между группами считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Уровень тяжелых металлов (хром, марганец) и взвешенных веществ в атмосферном воздухе не превышал предельно допустимой концентрации (ПДК). По данным расчетов рассеивания, выполненных на основе актуализированной базы данных, среднесуточные концентрации по металлам находились в диапазоне от 0,03 ПДК (хром)
до 0,05 ПДК (марганец). ТБР образуются в результате сгорания всех видов топлива и в процессе производства. Воздушные частицы взвешенных веществ больших и малых размеров, включая мелкие частицы, представляют собой сложное соединение органических и неорганических субстанций (в том числе марганца и хрома). Значения показателей ТБР, РМ10 и РМ25 не превышают среднесуточную ПДК. Среднесуточная концентрация для ТБР составляла 0,22 ПДК, для РМ25 - 0,119 ПДК, для РМ10 - 0,127 ПДК. ’
Сравнение полученных концентраций с ПДК по результатам инструментальных исследований качества воздуха на территории и в помещениях детских садов свидетельствует об отсутствии превышения по всем измеряемым компонентам: по мелкодисперсным пылям РМ10, РМ25 и в целом по ТБР. РМ2 5 определялась в 7 из 34 проб, процентное содержание данных частиц составило до 70%. РМ10 регистрировалась в 19 пробах, процентное содержание данных частиц составило до 98%.
Полученные аппроксимированные данные указывают на иную картину загрязнения: на территории ближайшей жилой застройки выявлены зоны высокого загрязнения (табл. 1). Таким образом, для ТБР и РМ10 в жилой застройке зафиксировано превышение по максимальным разовым и среднегодовым концентрациям. В точках проживания детей наблюдалось повышение уровня максимальных разовых концентраций по взвешенным веществам и среднегодовых концентраций по взвешенным веществам и мелкодисперсным пылям.
Установлено, что концентрация марганца и хрома в крови детей основной группы в целом достоверно не превышала значений, зафиксированных в группе контроля (табл. 2). Однако у 15 (28%) детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки, выявлено статистически значимое повышение концентрации марганца относительно величин, полученных в контроль-
Таблица 1. Аппроксимированные данные рас-
пределения концентраций Т8Р и РМ10
Место определения Доля ПДК ТвР РМ10
Жилая застройка ПДК ^ м.р 5,53 4,13
ПДКс.г 1,56 2,69
Точка ПДК ^ м.р 3,79 0,41
проживания ПДК„ 1,40 1,08
Обозначения: ПДКир - максимальная разовая ПДК г - среднегодовая ПДК. ПДК,
Таблица 2. Уровень низкомолекулярных химиче-
ских соединений в крови обследованных детей
Показатель, мг/дм3 Контрольная группа (п = 100), М ± т Основная группа (п = 45), М ± т
Марганец 0,0194 ± 0,0015 0,0207 ± 0,0009*
Хром 0,0163 ± 0,0022 0,0198 ± 0,0011*
* Разница достоверна по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
Таблица 3. Характеристика отдельных показателей иммунной системы обследуемых
Показатель Контрольная группа (пм=48), М ± т Основная группа (п = 53), М ± т
СБ3+, % 72,58 ± 0,74 69,01 ± 1,48
С О , 0 л 1,83 ± 0,06 2,09 ± 0,10
СБ4+, % 40,60 ± 0,99 37,87 ± 0,82*
СБ4+, 109/л 1,02 ± 0,04 1,13 ± 0,05
С О оо % 25,94 ± 0,77 26,36 ± 0,64
С о оо , 09 л 0,66 ± 0,03 0,81 ± 0,04
СБ19+, % 13,79 ± 0,50 15,30 ± 0,65
С 1 9 , 09 л 0,35 ± 0,02 0,46 ± 0,03
СВ3+СВ16+СБ56+, % 11,56 ± 0,75 8,60 ± 0,60*
СВ3+СВ16+СБ56+, 109/л 0,29 ± 0,02 0,27 ± 0,02
Аппехіп У^ГТС+7ААБ-, % 1,72 ± 0,16 1,49 ± 0,15
Аппехіп V-FГTC+7AAD+, % 6,70 ± 0,37 4,18 ± 0,28*
* Разница достоверна по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
Результаты исследований
Таблица 4. Характеристика цитокинового профиля обследуемых детей
Показатель, пкг/мл Контрольная группа (n=47), M ± m Основная группа (ПМ= 15)’ M ± m
ИЛ-ф 3,40 ± 1,34 1,18 ± 0,19*
ИЛ-4 1,39 ± 0,47 0,68 ± 0,45
ИЛ-6 1,53 ± 0,93 10,89 ± 7,81*
ИЛ-8 1,62 ± 0,62 15,87 ± 13,53*
ИЛ-10 3,99 ± 1,15 6,49 ± 0,61*
ИФН-у 1,69 ± 0,44 1,62 ± 0,43
ФНО-а 2,04 ± 1,20 2,80 ± 2,46
* Разница достоверна по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
ной группе (р < 0,05). Также в биосредах 30 (55%) детей основной группы отмечено достоверное превышение содержания хрома в сравнении с данными контрольной группы (р < 0,05).
Оценка иммунного статуса выявила статистически значимое снижение численности СБ4+- и СБ3+СБ16+ СБ56+-лимфоцитов у детей основной группы в сравнении с группой контроля (р < 0,05) (табл. 3). При оценке количества Аппехт У^1ТС+7ААВ-лимфоцитов у детей, проживающих на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий, достоверных изменений относи -тельно величин, полученных в контрольной группе, не отмечалось. Уровень Аппехт У^ГТС+7ААВ+-лимфоцитов определяется в качестве фактора, сопряженного с активностью некротической гибели лимфоцитов. Выявлено, что у детей основной группы количество Аппехт У^1ТС+7ААВ+-клеток было статистически значимо ниже, чем у обследуемых детей контрольной группы (р < 0,05). Выявлена достоверная отрицательная зависимость содержания апопто-тических клеток (г = -0,24, р < 0,05) от концентрации РМ2,5 в атмосферном воздухе.
Оценка цитокинового профиля выявила статистически значимое снижение в крови концентрации ИЛ-ф (р < 0,05) и по-
вышение экспрессии ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 (р < 0,05) у детей основной группы в сравнении с показателями, полученными в группе контроля (табл. 4).
СБ4+-антиген участвует в передаче в клетку активационного сигнала. Через молекулу CD4 в клетку могут передаваться супрессорные сигналы и сигналы, индуцирующие гибель клеток по механизму апо-птоза. Снижение экспрессии CD4+-маркера на иммунокомпетентных клетках может спровоцировать ухудшение реализации апоптотической программы лимфоцитов. NKT-клетки периферической крови конститутивно экспонируют на мембране CD56, тогда как экспрессия CD16 ассоциирована с терминальной стадией их диффе-ренцировки и приобретением наибольшей цитолитической активности. На ранней стадии апоптоза эффекторы врожденного ответа NKT способны взаимодействовать с дендритными клетками, модулируя их состояние активности. Дендритные клетки играют центральную роль в узнавании апоптотической клетки и инициации иммунного ответа на маркеры стресса и/или экспрессию различных протеинов на плазматической мембране, высвобождение провоспалительных цитокинов и продуктов последней стадии деградации клетки. Считается, что NKT-клетки отвечают за повышенную выработку ИЛ Th2-профиля в ответ на антигенную стимуляцию. Физиологические медиаторы Th2-ram (ИЛ-4, ИЛ-6) проявляют противоапоптотическую активность. Следовательно, NKT-клетки регулируют продукцию и сами являются продуцентами важнейших цитокинов, направляющих течение иммунной реакции.
Интерлейкин-ip повышает чувствительность клетки к лиганду Fas, однако механизмы, посредством которых цитокины модулируют ответ, остаются неясными. Известно, что взаимодействие Fas и лиганда Fas может привести не только к апоптозу клетки, но и к продукции провоспалитель-ного ИЛ-8, т.е. одни и те же сигнальные пути используются для реализации раз-
личных клеточных программ. Ряд авторов утверждает, что ИЛ-ф и ИЛ-8 способны подавлять апоптоз полиморфноядерных лейкоцитов в результате паракринного эффекта. В эксперименте доказано, что про-апоптотический ФНО-а может косвенно вызвать синтез хемокина ИЛ-8 (последний способен подавлять апоптоз клеток). Интерлейкин-10 имеет решающее значение для поляризации ТИ2-типа иммунного ответа в естественных условиях. Повышение или снижение продукции тех или иных внутриклеточных факторов (цитокинов -интерлейкинов, ИФН, ФНО) приводит к изменению интенсивности апоптоза. Преобладание противоапоптотических медиаторов приводит к подавлению реализации апоптотической программы лимфоцитов.
Таким образом, у детей, проживающих на территориях интенсивного промышленного освоения, зафиксировано изменение
иммунного статуса, что сопровождается особенностями апоптотической программы лимфоцитов и модификацией клеточного цикла. На фоне повышенной конта-минантной нагрузки (марганец, хром) наблюдается достоверное снижение относительного содержания СБ4+ Т-лимфоцитов (р < 0,05), ККТ-лимфоцитов (р < 0,05) с одновременным повышением в сыворотке крови уровня противоапоптоти-ческих регуляторов клеточного цикла -ТИ2-цитокинов (ИЛ-6), что способствует снижению интенсивности процесса клеточной гибели в аннексиновом тесте. Полученные результаты свидетельствуют о срыве адаптационных процессов в условиях повышенной экспозиции мелкодисперсной пыли, марганца и хрома.
Срекомендуемой литературой вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Features of Lymphocyte Apoptotic Program Associated with Technogenic Pollution D.G. Dianova, N.V. Zaitseva, and O.V. Dolgikh
Immune regulation in children in areas with high technogenic pollution is characterized by some features of lymphocyte apoptotic program and cell cycle modification. High contamination levels (manganese, chromium) inhibit cell death, measured by Annexin assay, which indicates the failure of adaptation processes.
Key words: cell cycle, environment, lymphocyte apoptotic program.
Продолжается подписка на журнал, предназначенный в помощь практическому врачу для проведения образовательных мероприятий
“АСТМА и АЛЛЕРГИЯ”
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства “Роспечать” - 300 руб., на один номер - 150 руб.
Подписной индекс 45967.
Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ.
Редакционную подписку на этот и любой другой журнал издательства “Атмосфера” можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51
