CC BY
21
УДК 616-097+613.954:502.3
ОСОБЕННОСТИ АННЕКСИНОВОГО ТЕСТА У ДЕТЕЙ,
проживающих в условиях техногенной нагрузки
(на примере Пермского края)
Н. В. Зайцева, О. В. Долгих *, Д. Г. Дианова
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, г. Пермь, Россия
PECULIARITIES OF ANNEX TEST IN CHILDREN LIVING IN CONDITIONS OF MAN-CAUSED LOAD (At the example of Perm Krai)
N. V. Zaitseva, O. V. Dolgikh, D. G. Dianova
Federal Research Centre of Medico-Preventive Technologies of Population Health Risk Management, Perm, Russia
Цель. Оценка гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте у детей, проживающих на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий.
Материалы и методы. В работе использованы гигиенические, химико-аналитические и цитофлюро-метрические методы исследования. Всего, включая группу контроля, обследовано 153 ребенка дошкольного возраста (средний возраст 6,09±0,11 года). Мониторинг качества атмосферного воздуха осуществлялся на стационарных постах наблюдения (по данным Росгидромета). Пробы воздуха исследовали на содержание взвешенных частиц (TSP), мелкодисперсной пыли размерами менее 2,5 мкм (PM2,5) и размерами менее 10 мкм (PM10). Использован метод сопряжения расчетных и натурных данных (аппроксимация). Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили методом, основанным на определении экспрессии фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с FITC (Fluorescein Isothiocyanate) (Annexin V-FITC) «Becman Coulter» («BC», USA), в качестве витального красителя был использован 7AAD (7-Amino-actinomycin D) («BC», USA) на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA). Определение содержания металлов в биосредах (кровь) обследуемых детей осуществляли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии в соответствии с методическими указаниями. Результаты. В работе представлены результаты обследования детей, проживающих на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий.
Выводы. Длительная комбинированная контаминация гаптенов может привести к дисфункции иммунной системы. Установлено достоверное снижение интенсивности процесса клеточной гибели в аннекси-новом тесте у детей, что указывает на нарушения процессов адаптации в условиях повышенной экспозиции мелкодисперсной пыли, марганца и хрома.
Ключевые слова. Гибель лимфоцитов, аннексиновый тест, марганец, хром, взвешенные частицы.
Aim. To assess lymphocyte death in children living in the territories of antropogenic effect of industrial enterprises using annex test.
© Коллектив авторов, 2012 е-mail: [email protected] тел. 8 (342) 236 39 30
[Долгих О. В. (* контактное лицо) — доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики; Зайцева Н. В. — доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН, директор; Дианова Д. Г. — кандидат медицинских наук, отдел иммунобиологических методов диагностики, старший научный сотрудник лаборатории клеточных методов диагностики].
Materials and methods. Hygienic, chemoanalytical and cytoflurometric methods of investigation were used in the work. Altogether, 153 children of pre-school age (mean age 6,09±0,11 years) including the control group were examined. Atmospheric air quality monitoring was performed at the stationary look-out station (by Rosgidromet data). Air samples were investigated for the content of suspended particles (TSP) and fine-dyspersated dust with the sizes less than 2,5 mcm (PM2,5) and less than 10 mcm (PM10). The method of accounting and natural data conjugation (approximation) was used. Lymphocyte apoptosis registration was conducted with the method based on determination of phosphatydylserin expression by means of annexin V conjugated with FITC (Fluorescein Isothiocyanate) (Annexin V-FITC) «Becman Coulter» («BC», USA). 7AAD (7-Aminoactinomycin D) («BC», USA) served as a vital dye used in flow cytometer FACSCalibur of «Becton Dickinson» Company («BD», USA). Metal content in children's biomedia (blood) was determined with atomic absorption spectrophotometry according to methodic guidelines.
Results. The work presents the results of examining children living in the territories of antropogenic effect of industrial enterprises.
Conclusion. Long combined hapten contamination can lead to immune dysfunction. Reliable reduction of cell death intensity in children's annex test was stated that indicates disturbance of adaptation processes in conditions of elevated fine-dyspersated dust, manganese and chrome exposition. Key words. Lymphocyte death, annex test, manganese, chromium, suspended particles.
Антропогенное загрязнение окружающей среды ведет к возникновению нарушений адаптационных процессов у детского населения [5]. Физиологический клеточный гомеостаз характеризуется позитивным балансом между клеточной гибелью и пролиферацией. Нарушение процесса клеточной гибели при экспозиции техногенных химических факторов может идти как в сторону активации, так и в сторону ингибирования данного процесса, что играет одну из ключевых ролей в развитии ряда патологических состояний.
Следовательно, одним из наиболее актуальных исследований по оценке степени неблагоприятного воздействия химических факторов окружающей среды на здоровье является определение апоптотической и некротической гибели иммунокомпетентных клеток.
Цель исследования — оценка гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте у детей, проживающих на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы гигиенические, химико-аналитические и цитофлюрометри-
ческие методы исследования. Всего, включая группу контроля, обследовано 153 ребенка дошкольного возраста (средний возраст 6,09±0,11 года). Биомедицинские исследования у детей выполнены в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов медико-биологических исследований, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 года с дополнениями 1983 года.
Мониторинг качества атмосферного воздуха осуществлялся на стационарных постах наблюдения (по данным Росгидромета). Выполнен расчет рассеивания загрязняющих веществ в атмосферном воздухе. Натурные исследования качества атмосферного воздуха выполнялись на территориях детских садов и проб воздуха помещений детских дошкольных учреждений. Пробы воздуха исследовали на содержание взвешенных частиц (TSP), мелкодисперсной пыли размерами менее 2,5 мкм (PM2,5) и размерами менее 10 мкм (PM10). Использован метод сопряжения расчетных и натурных данных (аппроксимация).
Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили методом, основанным на определении экспрессии фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с FITC (Fluorescein Isothiocyanate) (Annexin V-FITC)
«Becman Coulter» («BC», USA), в качестве витального красителя был использован 7AAD (7-Amino-actinomycin D) («BC», USA) на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA).
Определение содержания металлов в биосредах (кровь) обследуемых детей осуществляли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии в соответствии с методическими указаниями [7].
Основную группу составили 53 ребенка дошкольного возраста, проживающие на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий. Критериями включения в исследование явились: возраст детей от 4 до 7 лет, проживание на техногенно-нагру-женных территориях. Критерии исключения: невозможность или нежелание родителей обследуемых детей подписать информационное согласие на участие в исследовании, участие обследуемых детей в другом исследовании. Все родители (опекуны) подписали информированное согласие на участие в исследовании и использовании персональных данных.
Контрольная группа — 100 детей дошкольного возраста, проживающие вне зоны антропогенного влияния промышленных предприятий. Основная и контрольная группы были сопоставимы по полу, возрасту, соматической заболеваемости.
Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики с помощью программы Microsoft® Office Excel 2003 и пакета прикладных программ Statistica 6.0. (StatSoft,
USA). Статистический анализ данных проводился методами описательной статистики и сравнения выборок (с использованием t-кри-терия Стьюдента), корреляционного анализа (с использованием коэффициента корреляции и коэффициента детерминации). Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные признаки представлены как M±m (среднее арифметическое ± ошибка среднего). Характер статистического распределения по выборкам устанавливали по критерию согласия х2. Различия между группами считали значимыми при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Уровень определяемых тяжелых металлов (хром, марганец) и взвешенных веществ в атмосферном воздухе не превышал ПДК (предельно допустимая концентрация) (табл. 1).
По результатам проведенных инструментальных исследований качества воздуха следует, что при соотнесении полученных концентраций с предельно допустимыми концентрациями на территории детских садов и в помещениях садов отсутствуют превышения по всем измеряемым компонентам, а именно по мелкодисперсным пылям PM10, PM2,5 и в целом по TSP. РМ2,5 определялась в 7 пробах из 34, процентное содержание данных частиц составляло до 70%. Мелкодисперсная пыль размерами менее 10 мкм регистрировалась в 19 пробах, процент-
Таблица 1
Результаты исследований качества атмосферного воздуха
Показатель Марганец Хром TSP PM2,5 PM10
Максимальная из разовых концентраций, доли ПДК — — 0,22 0,194 0,207
Среднесуточная концентрация, доли ПДК 0,05 0,03 0,22 0,119 0,127
ное содержание данных частиц составляло до 98%.
Полученные аппроксимированные данные показали существенно иную картину загрязнения (табл. 2). Были выявлены зоны высокого загрязнения на территории ближайшей жилой застройки. Таким образом, зафиксированы превышения в жилой застройке по взвешенным веществам и мелкодисперсным пылям (РМ10) по максимально разовым и среднегодовым концентрациям. В точках проживания детей наблюдается повышение уровня максимально разовых концентраций по взвешенным веществам, а также превышение уровня среднегодовых концентраций по взвешенным веществам и мелкодисперсным пылям.
Установлено, что концентрация марганца и хрома в крови детей основной группы в целом достоверно не превышает значений, зафиксированных в группе контроля (табл. 3). Однако у 15 детей (28%), проживающих в условиях техногенной нагрузки, выявлено статистически значимое повышение марган-
ца (0,0300±0,0001 мг/дм3; р<0,05) относительно величин, полученных в контрольной группе. Также в биосредах 30 (55%) детей основной группы отмечено достоверное превышение содержания хрома (0,0235±0,0011 мг/дм3; р<0,05) в сравнении с контрольными значениями.
При оценке количества Аппехт V-FITC+7AAD--лимфоцитов (1,49±0,15%) у детей, проживающих на территориях антропогенного влияния промышленных предприятий, достоверных изменений относительно величин, полученных в контрольной группе (1,72±0,1б%), не отмечается. Уровень Аппехт V-FITC+7AAD+-лимфоцитов определяется в качестве фактора, сопряженного с активностью некротической гибели лимфоцитов. Выявлено, что у детей основной группы количество клеток, вступивших в стадию некроза (4,18±0,28%), было статистически значимо ниже Аппехт V-FITC+7AAD+-клеток, чем у обследуемых детей контрольной группы (6,70±0,37%; р<0,05). Выявлена достоверная отрицательная зависимость содержания
Таблица 2
Аппроксимированные данные распределения концентраций TSP и РМ10
Место определения Регламент Доли ПДК
TSP PM10
Жилая застройка ПДК м. р. 5,53 4,13
ПДК с. г. 1,56 2,69
Точка проживания ПДК м. р. 3,79 0,41
ПДК с. г. 1,4 1,08
Таблица 3
Уровень контаминации низкомолекулярных химических соединений в крови обследованных детей
Показатели Контрольная группа (п=100), M±m Основная группа (п=45), M±m
Марганец, мг/дм3 0,0194±0,0015 0,0207±0,0009
Хром, мг/дм3 0,0163±0,0022 0,0198±0,0011
апоптотических клеток (г=—0,24; р<0,05) от концентрации РМ2,5 в атмосферном воздухе.
В состав взвешенных частиц входят пыль, зола, сажа, дым, сульфаты, нитраты и другие твердые составляющие. TSP образуются в результате сгорания всех видов топлива и при производственных процессах. Воздушные частицы взвешенных веществ больших и малых размеров, включая мелкие частицы, представляют собой сложное соединение органических и неорганических субстанций, в том числе марганца и хрома.
Экспериментально отмечено, что ионы марганца блокируют апоптоз фагоцитов, вызванный различными агентами. Предотвращение апоптоза было связано с активацией марганцевой супероксиддисмутазы (Mn-SOD), а также антиоксидантной функцией свободных катионов Mn2+ [12]. Также проапоптотический эффект марганца проявляется посредством изменения уровня Bcl-2 [12]. Bcl-2 обеспечивает жизненный цикл Т-клетки. Гены семейства Bcl-2 контролируются геном р53, но эффект последнего неоднозначен, он может стимулировать и пролиферацию, и апоптоз, поэтому исход зависит от особенности программы клеточной линии, наличия цитокинов, а также ряда других факторов. Физиологические концентрации марганца потенцируют экспрессию NOS2 и синтез NO, что способствует активации NF-карраВ-фактора [11], который предотвращает активационно-индуцированную гибель клетки путем индукции синтеза инги-биторного фактора (FLIP). Двойственность функции NO в регуляции апоптоза зависит от уровня его продукции [6] и взаимодействия с ионами металлов [1]. Длительное избыточное образование оксида азота действует как проапоптический модулятор, который активирует каспазы посредством высвобождения цитохрома С в цитозоль, увеличиваете экспрессии гена р53 и изме-
няет продукции протеинов Blc-2. Однако низкие или физиологические концентрации NO защищают клетки от апоптоза [8] благодаря способности оксида азота ингибировать фосфориляцию р53 [2].
Хром способен определять поляризацию иммунного ответа по №2-типу [3], что в дальнейшем предполагает возникновение клинико-морфологических и иммунологических особенностей адаптационного процесса. Необходимо отметить, что медиаторы ТЫ-лимфоцитов способствуют развитию апоптоза, а медиаторы ТЪ2-лимфоцитов ему препятствуют, и преобладание эффектов №2-клеток способствует подавлению апоптоза при антигенной стимуляции [4]. В системе in vitro отмечено, что эффект, оказываемый хромом на иммунокомпетентные клетки, носит дозозависимый характер. Показано, что Cr(VI) индуцирует апоптоз при низких концентрациях и некроз в высоких дозах [10]. Активные формы кислорода и p53 способствуют апоптозу, вызываемому хромом [9].
Вывод
У детей, проживающих на территориях, отличающихся низким качеством внешней среды, зафиксировано достоверное снижение интенсивности процесса клеточной гибели в аннексиновом тесте, что указывает на нарушения процессов адаптации в условиях повышенной экспозиции мелкодисперсной пыли, марганца и хрома.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Бехало В. А., Сысолятина Е. В., Нагур-ская Е. В. Роль ультрафиолетового облучения и оксида азота в регуляции воспаления и апоптоза. Иммунология 2009; 30 (4): 237-241.
2. Волкова Т. О, Зыкина Н. С., Немова Н. Н. Участие опухолевого супрессора р53 в индукции эритроидной дифференцировки клеток линии К562. Цитология 2007; 4 (9): 45.
3. Девитт Ж. Д., Леруае К, Басанец А В, Буту М. Профессиональная бронхиальная астма, обусловленная воздействием хрома. Украшский медицинский часопис 1999; 4 (12): 105-107.
4. Долгих О. В, Зайцева Н. В, Дианова Д. Г. Особенности лимфоцитарно-клеточного звена у детей, проживающих на техноген-но-нагруженных территориях. Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация»: сборник статей. Пущино 2011; 2: 478-483.
5. Зайцева Н. В., Долгих О. В., Дианова Д. Г. Особенности запрограммированной клеточной гибели в условиях воздействия техногенных химических факторов. Гигиенические и медико-профилактические технологии управления рисками здоровью населения. Пермь 2011; 355—361.
6. Новицкий В. В, Рязанцева Н. В, Часов-ских Н. Ю. Модуляция апоптоза мононук-леаров в условиях окислительного стресса. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2008; 145 (3): 251—254.
7. Сборник методик по определению химических соединений в биологических сре-
дах МУК МЗ РФ № 763-99-4.1.779-99. Москва 1999; 152.
8. Стариков Ю. В., Бычков В. А. Влияние оксида азота на реализацию программированной клеточной гибели нейтрофиль-ных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro. Материалы Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины». Абакан 2007; 27—29.
9. Evans H, Taioli E, Toniolo P. Serum utonti-body to nervous system proteins: Isotypes in workers exposed to cadmium and nickel. Toxicologist 1994; 14: 291.
10. Granchi D, Cenni E, Ciapetti G. Cell death induced by metal ions: necrosis or apopto-sis? J. of Materials Science: Materials in Medicine 1998; 9 (1): 31—37.
11. Moreno J. A., Sullivan K. A., Carbone D. L Manganese potentiates nuclear factor-кВ-dependent expression of nitric oxide syn-thase 2 in astrocytes by activating soluble guanylate cyclase and extracellular responsive kinase signaling pathways. J. of Neuroscience Research 2008; 86 (9): 2028—2038.
12. Schrantz N, Blanshar D, Mitenne F. Manganese causes апоптоз human V-cages: kas-pazy-dependent cellular death it is blocked Bcl-2 Cell Death and Differentiation 1999; 6 (5): 445—453.
Материал поступил в редакцию 03.12.2011
