CC BY-ND
39
32
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
К СРАВНИТЕЛЬНОМ ХАРАКТЕРИСТИКЕ ТОКСИЧНОСТИ И ОПАСНОСТИ ЧАСТИЦ РАЗНОГО РАЗМЕРА В НАНО- И МИКРОМЕТРОВОМ ДИАПАЗОНАХ
Б.А. Кацнельсон1, Л.И. Привалова1, Т.Д. Дегтярёва, С.В., Кузьмин1, М.П. Сутункова1, И.А. Минигалиева1, О.С. Ерёменко1, Е.П. Киреева1, М.Я. Ходос2, А.Н. Козицина2, В.Я. Шур3, Е.В. Николаева3, И.Е. Валамина4, Я.Б. Бейкин5, Л.Г. Тулакина5
COMPARATIVE CHARACTERIZATION OF THE BIOLOGICAL GRESSIVITY OF PARTICLES HAVING DIFFERENT DIMENSIONS IN NANO- AND MICROMETRIC RANGES
B.A. Katsnelson, L.I. Privalova, T.D. Degtyareva \,S.V. Kuzmin, M.P. Sutunkova, I.A. Minigalieva, O.S. Yeremenko, E.P. Kireyeva, M.Y. Khodos, A.N. Kozitsina, V.Y. Shur, E.V. Nikolaeva, I. E. Valamina,
L.G. Tulakina, S.V. Pichugova, J.B. Beykin
'ФГУН «Екатеринбургский Медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Роспотребнадзора, 2Научно-производственное внедренческое предприятие «ИВА» при Уральском государственном экономическом университете, 3Центр коллективного пользования «Современные нанотехнологии» при Уральском государственном университете, 4Уральская государственная медицинская академия, 5МУ «Клинико-диагностический центр» г. Екатеринбург
Токсичность частиц магнетита (Fe3O4) на нанометровом (10 и 50 нм) и микрометровом (1 мкм) диапазонах была оценена: (а) по сдвигам клеточного состава жидкости бронхо-альвеолярного лаважа через 24 ч после интратрахеального введения водных суспензий этих частиц; (б) по проявлениям их фагоцитоза in vivo, оцененным с помощью оптической, электронной и атомно-силовой микроскопии; (в) по набору показателей состояния организма после повторных внутрибрюшинных введений таких суспензий. При дозах, равных по массе, на-ночастицы проявляют значительно более выраженную биологическую агрессивность, чем частицы микрометрового диапазона, однако они вызывают и более активную защитную реакцию лёгочного фагоцитоза. В пределах нанометрового диапазона соотношение между диаметром и резорбтивной токсичностью частиц является сложным и неоднозначным, что может быть связано с различиями их токсикокинетики, контролируемой как физиологическими механизмами, так и прямой пенетрацией наночастиц через биологические барьеры, а также неодинаковой растворимостью. Полученные результаты позволяют полагать, что концепция о беззащитности организма против наночастиц требует критической переоценки.
Ключевые слова: манометровый и микрометровый диапазоны, наночастицы, ток-сикогенетика, пенетрация наночастиц, фагоцитирование.
The toxicity of magnetite (Fe3O4) particles in the nanometer (10 nm and 50 nm) and micrometer (1 ^m) range was assessed: (a) by shifts in the cell composition of the bronchoalveolar lavage fluid 24 hours after intratracheal instillation of the above particles in water suspensions; (b) by signs of particle phagocytosis in vivo estimated by optical, electron and atomic-force microscopy; and (c) by a set of indices for the status of the organism following repeated intraperitoneal injections of those suspensions. Given equal mass doses, nanoparticles feature a considerably more marked biological aggressiveness than particles in the micrometer range but they also cause a more active protective reaction of pulmonary phagocytosis. Within the nanometer range, the relationship between the diameter and the resorptive toxicity of particles is intricate and non-unique, which may be attributed to differences in the toxicokinetics controlled by both physiological mechanisms and direct penetration of nanoparticles through biological barriers and. At the same time, our results demonstrate that the concept of quasi-defenselessness of organism against nanoparticles should be critically re-evaluated.
Keywords: nanometer and micrometer ranges, nanoparticles, toxicogenetics, penetration of nanoparticles, englobing.
С развитием нанотехнологий и применением наноматериалов в самых разнообразных сферах техники, науки, медицины и пр. изучение токсичности частиц нанометрового диапазона приобретает все большую актуальность. Однако образование наночастиц (НЧ) и их действие на организм человека не является
проблемой, совершенно новой для специалистов в области гигиены труда и окружающей среды. НЧ составляют значительную фракцию аэрозолей конденсации, образующихся при таких технологиях, как электросварка, электротермическое производство кремнийсодер-жащих ферросплавов и технически чистого
МАЙ №5 (218)
33
кремния, стеклодувные работы (в особенности с кварцевым стеклом) и других, и загрязняющих как воздух рабочих помещений, так и атмосферный воздух. Последний загрязняется НЧ (ультратонкими) в составе выхлопных газов авто-, авиамоторов и различных дымовых выбросов, а также в составе вулканической золы, распыляющейся морской воды, дыма лесных пожаров, сульфатов, образующихся в атмосфере в результате окисления сернистого ангидрида и т. д.
Как известно, ключевым механизмом самоочищения пульмонарной области является мобилизация на её свободную поверхность клеток, способных фагоцитировать мельчайшие частицы микрометровых размеров, тем самым препятствуя их пенетрации в легочный ин-терстициум и способствуя выведению по пути
мукоцилиарного транспорта. Основным эффектором фагоцитарного звена пульмонарно-го клиренса являются лёгочные альвеолярные макрофаги, а вспомогательным — нейтрофиль-ные лейкоциты. Доказано, что мобилизация нейтрофилов действительно играет важную компенсаторную роль, а сама контролируется количеством продуктов макрофагального разрушения и поэтому тем интенсивнее, чем выше повреждающее действие (цитотоксичность) частиц для макрофага. Поэтому отношение нейтрофилов к макрофагам в клеточной популяции бронхо-альвеолярного лаважа служит косвенным показателем цитотоксичности различных частиц, которая зависит не только от их размера, но и от химической структуры [1].
Предметом дискуссии пока служит то, в какой мере эти закономерности, надёжно обо-
Таблица 1. Распределение фагоцитирующих клеток с различной нагрузкой частицами магнетита сравниваемых размеров
Альвеолярные макрофаги (АМ) Нейтрофильные лейкоциты (НЛ)
% АМ с 0—20 частицами % АМ с > 20 частицами % НЛ с 0—20 частицами % НЛ с > 20 частицами
Через 24 ч после введения частиц 10 нм
9,38 ± 0,25" 90,62 ± 0,35" 42,66 ± 0,28" 57,34 ± 0 ,38"
Через 24 ч после введения частиц 50 нм
19,09 ± 0,21 *" 80,91 ± 0,21 *" 72,55 ± 0,18 * ■ 27,45 ± 0,19 *"
Через 24 ч после введения частиц 1 000 нм
64,00 ± 0,16 * 36,00 ± 0,16 • 97,75 ± 0,08 * 2,25 ± 0,08 *
Примечание. Значками помечены: (Р < 0,001 рассчитывалось исходя значений критерия Стьюдента). «•» - статистически значимое различие с группой «10 нм»; «■» - с группой «1 мкм» из нормальной аппроксимации биномиального распределения по таблице стандартных
I О,!
Е
0,6 -
0,4 -
ш
с;
ш <
с!
и
Т 0,0
0,079±0,002
КОНТРОЛЬ
10 ни
50 нм
1 мкм
(а)
г »
Е
<н0,02 <
ш
то,01
ч
а т
0,0215±0,0005
0,0099±0,0002
О
и
0,0052±0,0004! Э,0045±0,0002
0,00
(б)
10 нм
1 мкм
Рис. 1. Плотность микровдавлений (а) всех диаметров и (б) диаметром > 1 мкм на поверхности клеток в зависимости от диаметра фагоцитированных частиц (х ± 8х)
* — статистически значимое различие с группой «контроль»; • — с группой «50 нм»; ■ — с группой «1 мкм» (р < 0,05 по критерию Манна-Уитни)
34
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
снованные для частиц микрометрового диапазона, справедливы и для наночастиц. Высказываются утверждения, согласно которым наночастицы плохо распознаются защитными механизмами вообще и, в частности, вызывают слабую аттракцию альвеолярных макрофагов и поэтому неэффективно выводятся из лёгких [2; 3]. Однако наземные позвоночные столкнулись с ингаляцией наночастиц тогда же, когда и с ингаляцией микрочастиц, а основные механизмы лёгочного клиренса (как фагоцитоз частиц, так и мукоцилиарный транспорт) обнаруживаются уже у земноводных, то есть ещё до завершения морфологического структурирования лёгких [4]. Можно полагать, что эти столь древние механизмы защиты, высоко эффективные по отношению
Рис. 2. Отношение числа НЛ к АМ в БАЛЖ после интратрахеального введения суспензий магнетита с разным размером частиц (х ± 8х)
* — статистически значимое различие с группой «контроль»; • — с группой «50 нм»; ■ — с группой «мкм» (р < 0,05 по ^критерию Стьюдента)
5.10+0,65-.
032+0,02« _
■
контроль Свода) "ПО 2 ЗЮ2 Ре/ О4 10 нм
Рис. 3. Отношение числа НЛ к АМ в БАЛЖ после интратрахеального введения полидисперсных суспензий диоксида титана и кварца или суспензии магнетита с размером 10 нм (х ± 8х)
*— статистически значимое различие с группой «контроль»; • — с группой «ТЮ2»; ■ — с группой «8Ю2» ( р < 0,05 по ^критерию Стьюдента)
к микрочастицам, могли бы эволюционно закрепиться и по отношению к биологически более неблагоприятному фактору. Это не исключает возможности количественных различий реагирования этих механизмов на частицы разного размера, и такие различия могут быть выявлены с накоплением конкретных экспериментальных данных. При этом целесообразно сопоставлять экспериментальные результаты, которые получены при действии нано- и микро-частиц одной и той же химической природы и при строгой параллельности тестирования их действия.
Материалы и методы. Были синтезированы 3 образца химически идентичных и равно намагниченных частиц Fe3O4 (магнетита) с первичным размером 10 нм, 50 нм и 1 мкм. Суспензии этих частиц в стерильной деиони-зированной воде, приготовленные с помощью ультразвуковой обработки, вводились крысам интратрахеально (и/т) в дозе 2 мг (в 1 мл) однократно или внутрибрюшинно (в/б) в дозе 500 мг/кг (в 4 мл) по 3 раза в неделю в течение 5 недель. Жидкость бронхоальвеолярного ла-важа (БАЛЖ), проведенного через 24 ч после и/т введения, центрифугировалась; подсчи-тывались альвеолярные макрофаги (АМ) и нейтрофильные лейкоциты (НЛ); их фагоцитарная активность оценивалась при оптической, трансмиссионной электронной (ТЭМ) и полуконтактной атомно-силовой (пк-АСМ) микроскопии. После в/б введений суспензий магнетита развитие интоксикации оценивалось по ряду функциональных и биохимических показателей и по гистопатологическим изменениям в печени и селезёнке. Содержание железа в крови измерялось фотометрически, а в печени и селезёнке — методами атомной адсорбции и электронно-парамагнитного резонанса.
Результаты и обсуждение. Фагоцитарная активность АМ и НЛ демонстрируется высоким числом видимых частиц внутри этих клеток и микровдавлений на их поверхности, визуализированных при пк-АСМ, которые рассматриваются как следы инвагинации плазматической мембраны в процессе фагоцитоза (табл. 1, рис. 1).
Обоими методами показано, что значительно более нагружены частицами клетки из лёгких, после введения наночастиц (НЧ) 10 нм, по сравнению с таковыми после введения НЧ 50 нм, причём НЧ обоих размеров поглощаются более жадно, чем микрочастицы. Судя по отношению НЛ/АМ, НЧ (в особен-
МАЙ №5 (218)
35
(а)
(b)
10 нм
50 нм 1000 нм контроль
контроль
Рис. 4. Средние значения (± s.d.) концентрации железа в форме магнетита в тканях (а) печени и (b) селезёнки по группам крыс, подвергавшихся воздействию магнетитовых частиц разного размера (p < 0,05) по таблице стандартных значений критерия Стьюдента). Метод атомно-абсорбционной спектроскопии
Таблица 2. Некоторые морфометрические характеристики печени крыс
Показатели на 100 клеток печени Группы крыс
контрольная получавшие магнетит с номинальным размером частиц
10 нм 50 нм 1 мкм
Число безъядерных гепатоцитов 13,1 ± 0,9 37,0 ± 1,6*«. 44,4 ± 1,3*. 19,6 ±1 ,7*
Число двуядерных гепатоцитов 5,1 ± 0,5 2,3 ± 0,3*. 2,0 ± 0,3*. 6,1 ± 0,6
* - Статистически значимое различие с группой «контроль»; •- с группой «50 нм»; ■ - с группой «1 мкм» (р < 0,05 по критерию Стьюдента)
ности НЧ 10 нм) гораздо более цитотоксичны, чем частицы магнетита 1 мкм и даже, как было показано в отдельном эксперименте, по сравнению с частицами полидисперсной кварцевой пыли (рис. 2; 3). Однако железо в форме НЧ 10 нм выводится из лёгких быстрее всего по причине как более активного фагоцитоза, так и более быстрого растворения.
Активный процесс фагоцитоза НЧ демонстрируется также с помощью ТЭМ. Мельчайшие фагосомы затем сливаются в более крупные фагосомы-эндосомы. Разрушение фагосомальной мембраны приводит к образованию «свободных» агрегатов НЧ, часто находящихся в контакте с мембранами и кристами митохондрий, а также с ядерной мембраной. В этих случаях можно видеть изменения нормальной структуры указанных мембран.
Субхроническая резорбтивная токсичность оксида железа Fe3O4, судя по комплексу функциональных, биохимических и морфологиче-ских/морфометрических показателей, оказалась низкой при действии частиц микрометрового диапазона, но существенной при действии НЧ обоих испытанных размеров. Труднее дать ответ на вопрос о том, возрастает ли она с уменьшением размера частиц внутри нанометрового диапазона. Наши результаты указывают, что
при заданной дозе по массе эта зависимость от размера НЧ может быть неодинаковой для существенно различных эффектов и не является однозначной в связи со сложными и часто противоположно направленными соотношениями между собственно биоагрессивностью частиц, с одной стороны, и механизмами, контролирующими их биокинетику, с другой.
Так, в результате взаимодействия этих механизмов, био-аккумуляция железа в форме Fe3O4, обнаруживаемого с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии, в печени и в селезёнке при действии НЧ 50 нм выше, чем от НЧ 10 нм, и является низкой для НЧ 1 мкм (рис. 4).
Соответственно этому, патологические изменения в названных органах были наиболее выражены при действии НЧ 50 нм и фактически отсутствовали у крыс, которым вводили микрочастицы (табл. 2).
С другой стороны, большинство других системных изменений имеет тенденцию к большей выраженности при действии НЧ 10 нм.
Заключение. Распространённые представления о неэффективности защитных механизмов против действия НЧ должны быть пересмотрены, хотя НЧ могут быть существенно
36
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
опасными даже при такой химическои природе вещества, которое является малотоксичным в обычных формах.
Поскольку НЧ магнетита токсичнее кварцевой пыли, имеющей ПДК 1 мг/м3, для магнети-товых НЧ ПДК должна быть значительно ниже.
Источники поддержки работы
Исследования выполнялись в рамках задания «Разработка нормативно-методического обеспечения и средств контроля содержания наночастиц на объектах производственной сферы» Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008—2010 годы»
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Katsnelson B.A. and Privalova L.I. Recruitment of phagocytizing cells into the respiratory tract as a response to the cytotoxic action of deposited particles. Environm. Health Perspect. 1984. V .55. P. 313—325.
2. Li, N., Xia T. and Nel A.E. The role of oxidative stress in ambient particulate matter-induced lung diseases and its implications in the toxicity of engineered nanoparticles. Free Rad. Biol. Med. 2008. V. 44. P. 1689—1699.
3. Oberdorster G, Oberdorster E and Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studied of ultrafine particles. Environm. Health Persp. 2005; 113 : 823—839.
4. Kilburn K.H. Alveolar clearance of particles. A bullfrog lung model. Arch. Environm. Health. 1969. V. 18. P. 556—563.
Контактная информация:
Привалова Лариса Ивановна, тел.: 8 (343)-371-87-40(56), e-mail: [email protected]
Contact information:
Privalova Larisa Ivanovna, tel.: 8 (343)-371-87-40(56), e-mail: [email protected]
