CC BY
41
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.438.014.2.083
С. В. Латышев, В. В. Комогорова, М. М. Литвина, Н. И. Шарова,
В. Т. Селиваненко, М. А. Мартаков, А. А. ярилин
изменение субпопуляционного состава тимоцитов человека под влиянием сокультивирования с клетками акантамебы, тропной к тимусу, и при действии ее гуморальных продуктов
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, Москва, Каширское ш., 24, к. 2); МОНИКИ им. В. Ф. Владимирского (129110, Москва, ул. Щепкина, д. 61/2)
При совместном культивировании тимоцитов человека с клетками акантамебы, тропной к тимусу (штамм CDHT), в течение 1 сут существенно изменяется численное соотношение тимоцитов, относящихся к различным субпопуляциям. Основной сдвиг состоит в снижении относительного содержания незрелых кортикальных тимоцитов с мембранным фенотипом CD4+CD8+. Одновременно происходит увеличение процента наименее зрелых (CD4-CD8-) и наиболее зрелых (CD4+CD8-, в значительно меньшей степени CD4-CD8+) клеток. Соотношение тимоцитов, экспрессирующих слабо и сильно CD3 - соответственно незрелых и зрелых тимоцитов - изменяется аналогичным образом: снижается содержание CD3lo-клеток, и возрастает уровень CD3hi-клеток. Процентное содержание CD4+CD25hi-тимоцитов, т. е. естественных регуляторных Т-клеток, повышается под влиянием сокультивирования с клетками амебы, тогда как процент CD4+CD25lo-тимоцитов, т. е. активированных CD4+-тимоцитов, при этом не изменяется. При разделении сокультивируемых тимоцитов и клеток CDHT, разделенных полупроницаемой мембраной, а также введении в культуру тимоцитов гуморальных продуктов амебы наблюдаются субпопуляционные сдвиги той же направленности, но выраженные значительно слабее (незначимо). Эффекты сокультивирования с амебоцитами аналогичны действию любых цитотоксических агентов, включая глюкокортикоиды и ионизирующую радиацию. Постулируется, что во всех этих случаях основой наблюдаемых изменений является индукция апоптоза, к которому наиболее чувствительны СD4+СD8+-тимоциты.
Ключевые слова: тимоциты, субпопуляции, акантамеба, регуляторные Т-клетки, апоптоз
Latyshev S.V., Komogorova V.V., Litvina M.M., Sharova N.I., Selivanenko V.T., Martakov M.A.,
Yarilin A.A.
ALTERATION OF THE SUBPOLULATION COMPOSITION OF HUMAN THYMOCYTES UNDER EFFECT OF THEIR CO-CULTIVATION WITH THYMOTROPIC ACANTHAMOEBA CELLS AND BY THE ACTION OF THEIR HUMORAL PRODUCTS
Co-cultivation of human thymocytes and thymotropic Acanthamoeba cells (the CDHT strain) for 24 hours resulted in a significant change of the relative number of thymocytes representing different subpopulations. The most pronounced was the change in the proportion of immature cortical thymocytes with the CD4+ CD8+ membrane phenotype. Simultaneously, the percentage of the least and most mature cells (CD4+ CD8- and CD4- CD8- respectively) increased. The increase in the relative number of mature CD4-CD8+ cells was much less apparent. The proportion of thymocytes with low- and high-intensity expression of CD3 (mature and immature ones respectively) tended to change in a similar manner, that is the number of CD3Aio decreased while that of CDAhi increased. The percentage of CD4+ CDAhi thymocytes (i.e. natural regulatory T-cells) increased under the influence of co-cultivation with the Acanthamoeba cells. At the same time, the relative number of CD4+ CD25Aio cells (i.e. activated CD4+ thymocytes) remained unaltered. In the case of separation of the co-cultured thymocytes and CDNT cells by a semipermeable membrane or after the addition of humoral products of the Acanthamoeba cells into the culture of thymocytes, the changes in the subpolulation composition were on the whole similar to those described above but much less pronounced (the difference insignificant). Effects of co-cultivation of thymocytes with thymotropic Acanthamoeba cells were analogous to the effects of any cytotoxic agents including glucocorticoids and ionizing radiation, It is hypothesized that all the observed changes are associated with the induction of apoptosis to which CD4+ CD8+ thymocytes show the maximum sensitivity.
Key words: thymocytes, subpopulations, Acanthamoeba, regulatory T-cells, apoptosis
Клетки акантамебы штамма CDHT, выделенного из культуры стромы тимуса в начале 1990-х годов [2], при введении мышам избирательно мигрируют в тимус [3]. Показана их способность индуцировать апоптоз тимоцитов, активированных и трансформированных, но не покоящихся лимфоцитов [1, 4].
Ярилин Александр Александрович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)617-79-19
Индукция апоптоза обусловлена как прямыми контактными взаимодействиями, так и действием гуморальных факторов молекулярной массой 12 и 15 кД [5]. При инфицировании мышей акантамебой развиваются временная атрофия тимуса и гипертрофия селезенки [3].
В данной работе оценивали влияние акантамебы штамма CDHT и ее гуморальных продуктов in vitro на субпопуляционный состав тимоцитов человека.
- 16 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Изменение процентного содержания клеток, относящихся к основным субпопуляциям тимоцитов человека, под влиянием сокультивирования с клетками амебы CDHT и действия их гуморальных продуктов
Субпопуляция Тимоциты (контроль) Тимоциты + амеба Тимоциты + амеба (трансвелл) Тимоциты + супернатант амебы
CD4+CD8+ 70,9 (70,2-76,9) 48,7 (42,3-58,4)* 62,2 (58,6-69,0) 61,0 (54,3-70,2)
CD4+CD8- 13,6 (11,6-15,6) 27,5 (24,6-38,7)* 23,6 (16,2-31,9) 19,9 (12,3-29,5)
CD4-CD8+ 13,9 (11,8-15,8) 16,1 (15,4-21,6) 14,6 (12,7-18,7) 17,4 (15,6-21,0)
CD4CD8+ 1,7 (1,4-1,7) 4,5 (3,4-5,7)* 2,5 (2,0-3,1) 2,5 (1,4-3,8)
CD4+25hi 0,8 (0,6-0,9) 1,6 (1,2-2,7)* 0,5 (0,5-1,3) 0,7 (0,6-1,2)
CD4+CD25l° 3,2 (3,1-3,6) 3,9 (3,5-5,1) 2,9 (1,9-4,3) 3,2 (1,7-4,0)
Примечание. Представлены медианы и интервалы от нижнего до верхнего квартиля; * - р < 0,05.
Рис. 1. Пример изменения субпопуляционного состава тимоцитов под влиянием сокультивирования с клетками CDHT.
Здесь и на рис. 2: по осям координат - интенсивность (в усл. ед.) флюоресценции клеток, окрашенных моноклональными антителами: по оси абсцисс - анти-СБ4-Р1ТС; по оси ординат - aHTH-CD8-PE. Цифры в квадрантах - процент клеток соответствующего фенотипа.
Здесь и на рис. 3-5: а - монокультура тимоцитов; б - совместная культура тимоцитов и клеток CDHT.
а б
Рис. 2. Отсутствие дифференцировочного эффекта клеток амебы
при их сокультивировании с тимоцитами фенотипов CD4-CD8- (а,
б) и CD4+CD8+ (в, г).
а - монокультура CD4-CD8'-тимоцитов; в - монокультура CD4+CD8+-тимоцитов; б и г - кокультура названных тимоцитов с клетками амебы CDHT.
Материалы и методы. Источником тимоцитов служили фрагменты детского тимуса, иссеченные во время операции по поводу врожденных пороков сердца, в соответствии с принятой хирургической практикой для облегчения доступа к сердцу; возраст детей во всех случаях был меньше 1 года. Суспензию тимоцитов, полученную из фрагментов тимуса с помощью гомогенизатора, дважды отмывали и ресуспен-зировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность тимоцитов составляла не менее 95%.
Тимоциты и клетки амебы штамма CDHT (Acanthamoeba. sp.), полученного Н. И. Шаровой в Институте иммунологии, культивировали в полной питательной среде на основе RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США) и 2 мМ L-глютамина («ПанЭко», Россия) в 24-луночных планшетах («Nunclon», Дания) в СО2-инкубаторе («Jouan», Франция). Тимоциты культивировали отдельно (монокультуры 50 • 107/мл) и совместно с амебоцитами (кокультуры). Соотношение тимоци-тов и клеток амебы при сокультивировании составляло 100:1 (5 • 107/мл тимоцитов : 50 • 10* 5 б)/мл амебы). Для предотвращения контактных взаимодействий тимоцитов и клеток амебы клетки в некоторых культурах разделяли полупроницаемой мембраной (трансвелл-система). Супернатант клеток амебы получали из культуры клеток CDHT, предварительно активированных тимоцитами: после элиминации тимоцитов амебоциты отмывали и культивировали еще 2 сут; после их осаждения получали супернатант, использованный в работе [5]. Супернатант клеток CDHT добавляли в культуру тимоцитов до конечной концентрации 50% (в контрольные лунки добавляли такой же объем среды).
Мембранный фенотип тимоцитов оценивали методом проточной цитометрии на проточном цитометре FACSCanto II («Becton Dickinson») c помощью моноклональных антител к молекулам CD3 и CD4 человека, меченных изотиоцианатом флюоресцеина (FITC), и к молекулам CD8 и CD25, меченных фикоэритрином (РЕ) («Bioscience», СЩА). Обработку цитометрических файлов проводили, используя программу FCS Express V3.
Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Влияние сокультивирования тимоцитов детей с клетками штамма CDHT, а также действие гуморальных факторов на клеточный состав лимфоидных клеток тимуса отражен в таблице. Наиболее выраженные изменения затрагивают содержание незрелых кортикальных тимоцитов с фенотипом CD4+CD8+: их относительное содержание снижается примерно в 1,5 раза. Процентное содержание клеток-предшественников с фенотипом CD4- CD8- увеличивается в 3 раза, а зрелых CD4+CD8+-клеток - в 2 раза. Значимые изменения относительного содержания CD4"CD8+-клеток отсутствуют. Картина изменений субпопуляцион-
- 17 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
а б
Рис. 3. Пример изменения соотношения тимоцитов, экспрессирующих сильно (CD3hl) и слабо (CD310) молекулу CD3, под влинияем сокультивирования с клетками CDHT. По оси абсцисс - интенсивность (в усл. ед.) флюоресценции; по оси ординат - количество клеток.
ного состава тимоцитов под влиянием сокультивирования с клетками амебы наглядно проиллюстрированы на рис. 1. Без специального анализа трудно оценить вклад в формирование описанных сдвигов процессов пролиферации, клеточной гибели и диф-ференцировки. Отсутствие значимых дифферен-цировочных эффектов клеток амебы на тимоциты показано в опытах, в которых с амебоцитами культивировали тимоциты субпопуляций CD4"CD8" и CD4+CD8+: в обоих случаях не наблюдали сколько-нибудь заметного перехода клеток в другие субпопуляции по признакам мембранного фенотипа CD4/CD8 (рис. 2). Представляется наиболее вероятным, что причиной субпопуляционных сдвигов при сокультивировании с амебоцитами суммарной популяции тимоцитов является избирательная гибель CD4+CD8+-тимоцитов по механизму апоптоза, поскольку избирательная чувствительность этих клеток к апоптозу показана при действии самых разнообразных факторов - от кортизола до ионизирующей радиации и разнообразных цитотоксических субстанций [6].
В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что часть эффектов клеток CDHT, но не весь их спектр, воспроизводится с помощью гуморальных
продуктов, выделяющихся в культуральную среду при культивировании амебоцитов, предварительно стимулированных тимоцитами, а также активных компонентов этих надосадков - белков молекулярной массой 12 и 18 кД [5]. Из таблицы следует, что введение в культуру тимоци-тов супернатантов клеток CDHT вызывает изменения относительной численности клеток, относящихся к разным субпопуляциям; эти изменения по направленности сходны с теми изменениями, которые вызывают сами клетки CDHT, однако ни в одном случае эти изменения не были достоверны. Примерно те же результаты наблюдали при разделении тимоцитов и клеток CDHT полупроницаемой мембраной. Данные свидетельствуют о том, что изменение соотношения субпопуляций тимоцитов in vitro возникают в основном вследствие прямых контактных взаимодействий, хотя гуморальные факторы вносят определенный вклад в реализацию этих эффектов.
При оценке соотношения тимоцитов, экспрессирующих сильно и слабо рецепторный комплекс (CD3hl и CD310), выявили ту же тенденцию: процентное содержание тимоцитов, слабоэкспрессирующих CD3, снижалось, а процент клеток, сильно экспрессирующих CD3, увеличивался. Если учесть, что клетки фенотипа CD310 составляют основную массу CD4+CD8+-тимоцитов (клетки, не прошедшие положительную селекцию), a CD3hl-клетки - это зрелые «одинарно положительные» тимоциты и «двойные положительные» клетки после положительной селекции, то можно констатировать, что под влиянием сокультивирования с амебой происходят убыль неселекционированных кортикальных тимоцитов и обогащение более зрелыми клетками. При введении в культуру тимоци-тов культуральных супернатантов клеток CDHT, а также разделении тимоцитов и клеток CDHT полупроницаемой мембраной (трансвелл-система)
а б
Рис. 5. Изменение процентного содержания регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hl) и тимоцитов с фенотипом CD4+CD2510 (юные и активированные клетки) под влиянием сокультивирования с клетками CDHT.
Рис. 4. Изменение процентного содержания тимоцитов, экспрессирующих сильно (CD3hl) и слабо (CD310) CD3, под влиянием прямого сокультивирования с клетками амебы (Ам), сокультивирования в условиях разделения мембраной (ТВ) и в присутствии культурального надосадка амебы (НО).
По оси ординат - процент CD3+-тимоцитов. * -р < 0,05.
По осям координат - интенсивность (в усл. ед.) флюоресценции клеток, окрашенных моноклональными антителами: по оси абсцисс - анти-CD4-FITC; по оси ординат - анти-CD25-РЕ.
В правом верхнем квадранте в верхнем углу указано общее процентное содержание клеток с фенотипом CD4+CD25+, в выделенном квадрате -клетки с фенотипом CD4+CD251” и цифровое выражение их содержания в процентах.
- 18 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
наблюдали аналогичные по направленности, но значительно менее выраженные эффекты (отличия от контроля не значимы). Данные отражены на рис. 3 (на примере одной культуры) и рис. 4 (суммированные данные).
Особого внимания заслуживает оценка влияния различных факторов на уровень естественных регуляторных клеток в популяции тимоцитов. Мы изучали эти клетки как CD4+-тимоциты, сильно экспрессирующие молекулу CD25 [7]. Данные по оценке влияния клеток амебы и ее гуморальных продуктов на процентное содержание CD4+CD25+-клеток, отличающихся по уровню экспрессии CD25, представлены в двух нижних строках таблицы. Ни клетки амебы, ни их супернатант не влияют на процент CD4+CD25lo-клеток (по преимуществу активированные тимоциты). В то же время сокультивирование с клетками CDHT приводила к двукратному (значимому) повышению содержания клеток с фенотипом CD4+CD25hl, т. е. регуляторных Т-клеток (рис. 5). Ни в кокультуре, в которой клетки разделены полупроницаемой мембраной, ни в культуре с добавлением супернатанта клеток амебы изменений процента этих клеток не наблюдали. Подобная избирательность допускает возможность индукции под влиянием амебоцитов дифференцировки регуляторных Т-клеток, однако для доказательства этого утверждения требуются дополнительные экспериментальные данные.
В заключение отметим, что изменения субпопуляционной структуры, возникающие в культуре ти-моцитов под влиянием сокультивирования с клетками амебы, сходны с теми, что наблюдаются in vivo в тимусе мышей, которым вводили клетки CDHT [1]. Вероятно, в обоих случаях решающая роль в осуществлении субпопуляционных сдвигов принадле-
жит усилению апоптоза кортикальных (CD4+CD8+) тимоцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Комогорова В. В., Шарова Н. И., Ярилин А. А. Некоторые механизмы апоптоза тимоцитов человека и мыши, вызываемого лимфотропным штаммом Acantamoeba. выделенным из тимуса ребенка // Иммунология. - 2003. - Т. 24, № 2. - С. 74-82.
2. Комогорова В. В., Шарова Н. И., Гордеева Л. М., Ярилин А. А Некоторые особенности поведения in vitro клеток амебы рода Acantamoeba, выделенные из тимуса ребенка: зависимость размножения от присутствия в культуре ядросодержащих клеток человека и мыши и цитопатогенное действие на эти клетки // Мед. паразитол. - 2003. - № 2. - С. 24-28.
3. Комогорова В. В., Латышев С. В., ЛитвинаМ. М. и др. Троп-ность акантамебы штамма CDHT к тимусу мыши и ее иммуномодулирующее действие in vivo // Иммунология. - 2008.
- Т 29, № 6. - С. 324-329.
4. Корочкина С. Д., Никонова М. Ф., Комогорова В. В. и др. Апоптоз лейкозных лимфоцитов человека под влиянием гуморального фактора клеток амебы штамма CDHT // Иммунология. - 2004. - T. 25, № 3. - С. 142-145.
5. Корочкина С. Л., Никонова М. Ф., Шарова Н. И. и др. Апоп-тотическая активность гуморальных факторов, продуцируемых клетками тимусного эпителия и акантамебой, выделенной из тимуса // Иммунология. - 2005. - Т. 26, № 3. - С. 184-193.
6. Ярилин А. А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Пат. физиол. - 1998. - № 2. - С. 38-48.
7. Baecher-Allan С., Brown J.A., Freeman G. J. et al CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood // J. Immunol. - 2001.
- Vol. 167. - P. 1245-1253.
Поступила 30.09.11
- 19 -
