CC BY
85
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТИОЛОВОГО ГОМЕОСТАЗА... 47
УДК 616.24-006.6-008.851:612.015.348
Р.Н. Белоногов1, Н.М. Титова2, А.А. Савченко1,3 ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТИОЛОВОГО ГОМЕОСТАЗА В ЭРИТРОЦИТАХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ
1 Красноярский государственный медицинский университет 2Сибирский федеральный университет, Красноярск 3НИИмедицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск
Белоногов Роман Николаевич, к.б.н., старший преподаватель кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии им. В.В. Иванова
адрес: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка 1з; тел. +7(913)533-62-95 e-mail: ro-x@ya.ru
Статья поступила 17.08.2012, принята к печати 30.10.2012.
Резюме
С целью определения особенностей редокс-зависимой модификации белков и состояния глутатионового звена антиоксидантной системы у больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания обследовано 116 пациентов. В эритроцитах проводилось определение уровня карбонильных производных, тиоловых групп белков, восстановленного глутатиона, глутатионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы. Наиболее выраженное возрастание интенсивности процессов редокс-зависимой модификации белков в эритроцитах происходит на II и IV стадиях рака легкого, в то же время характер изменений глутатионового звена антиоксидантной системы совпадает только на первых трех стадиях рака легкого. На IV стадии изменения показателей редокс-зависимой модификации белков и глутатионового звена антиоксидантной системы разнонаправлены.
Ключевые слова: рак легкого, окислительный стресс, окислительная модификация белков, система глу-татиона.
R.N. Belonogov1, N.M. Titova2, A.A. Savchenko1,3 CHANGES IN THIOL HOMEOSTASIS IN ERYTHROCYTES OF LUNG CANCER PATIENTS IN RELATION WITH STAGE OF THE DISEASE
1Krasnoyarsk state medical university,
2Siberian federal university, Krasnoyarsk
3Institute of medical problems of North, Krasnoyarsk
Abstract
The aim of the study was to investigate level of markers of oxidative modification of proteins and glutathione system in erythrocytes at different stages of lung cancer. 116 patients with lung carcinoma were chosen for study. We measured proteins carbonyl derivatives, SH-groups of proteins, glutathione level, glutathione peroxidase and gluthatione-s-transferase activity. The most increase of oxidative modification of proteins is happened on II and IV stage of the desease, however changes in glutathione system are similar at stages I-III, at IV stage glutathione level, glutathione peroxidase and gluthatione-s-transferase activity are decreased.
Key words: lung cancer, oxidative stress, oxidative modification of proteins, glutathione system.
Введение
Рак легкого занимает одно из первых мест по распространенности среди злокачественных новообразований [2; 8; 10]. Как правило, местные проявления опухоли выражены достаточно слабо, особенно на начальных стадиях, что сильно затрудняет раннюю диагностику и борьбу с этим заболеванием. Соответственно, большое значение имеют вопросы о том, какие системные изменения в организме вызывает возникающая опухоль. Одними из первых происходят изменения редокс-статуса организма, что приводит к окислительной модификации макромолекул и отражается на состоянии органов и тканей больного [4; 6; 8]. Окисление белковых молекул может сопровождаться их агрегацией или фрагментацией, изменением гидрофобности и чувствительности к протеолизу[4; 6]. Наиболее чувствительными к действию большинства активных форм кислорода являются тиоловые группы белков. Даже при сравнительно мягких условиях цистеино-
вые остатки образуют дисульфиды. Это единственные формы окислительной модификации белков, которые могут быть репарированы.
В восстановлении тиоловых групп белков, подвергшихся свободно-радикальному окислению участвуют тиоредоксин- и глутатион-зависимые защитные системы [11; 15]. Основываясь на этом, можно предположить, что механизм окисления-восстановления тиоловых групп служит для захвата свободных радикалов, защищая тем самым молекулу от необратимых изменений.
Тем не менее, относительно немного известно о характере изменений со стороны ферментативных систем, напрямую связанных с обменом глутатиона и тиоловых групп белков при злокачественных новообразованиях легких.
Цель исследования - выявить особенности редокс-зависимой модификации белков и состояния глутатионового звена антиоксидантной системы у больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания.
Материалы и методы
На базе Красноярского краевого онкологического диспансера обследовано 116 больных мужского пола, страдавших немелкоклеточным раком легкого, в возрасте 35-70 лет (ср. 53,4±2,4 года). У 8 диагностирована I стадия, у 30 -II стадия, у 44 - III стадия, у 34
- IV стадия заболевания. Окончательный диагноз устанавливался после оперативного вмешательства и гистологического исследования образцов опухоли врачами онкологического диспансера. В качестве контрольной группы были обследованы 35 здоровых доноров аналогичного возраста. Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан».
Кровь забиралась из локтевой вены в гепа-ринизированные пробирки, утром, натощак, на следующий день после поступления больного в стационар. Эритроциты отделялись центрифугированием, после чего в них проводилось определение уровня карбонильных производных, тиоловых групп белков, восстановленного глутатиона, глута-тионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы.
Об уровне КПБ судили по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с
2.4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [12]. Оптическую плотность образовавшихся производных динитрофенил-гидразонов регистрировали спектрофотометрически при различных длинах волн: 356 нм - алифатические кетодинитрофенилгидразоны нейтрального характера; 370 нм - алифатические альдегиддинитрофенил-гидразоны нейтрального характера [3]. Метод определения количества свободных тиоловых групп в белках основан на взаимодействии 8И-групп с ДТНБК. Интенсивность окраски регистрировали спектрофотометрически при V 412 нм. Для определения быстрореагирующих 8И-групп оптическую плотность пробы измеряли через две мин после начала реакции. Для определения медленнореагирующих 8И-групп измерение оптической плотности производили через каждые 5 мин до тех пор, пока ее значение не становилось постоянным. Для выявления замаскированных 8И-групп готовили пробу, в состав которой также входил 8 М р-р мочевины [1].
Определение количества восстановленного в8И основано на взаимодействии депротеинизиро-ванного субстрата в8И с ДТНБК с образованием окрашенного дисульфида. Интенсивность окраски регистрировали при V 412 нм. [7]. Активность глута-тионпероксидазы определяли по скорости окисления глутатиона в присутствии пероксида водорода. Концентрацию глутатиона до и после инкубации определяли спектрофотометрически. Каталазную и псев-допероксидазную активность глутатионпероксидазы подавляли азидом натрия [13].Активность глутати-он-8-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-8-конъюгатов между в8И и 1-хлор-
2.4-динитробензолом. Увеличение концентрации конъюгатов регистрировали при длине волны 340 нм [9]. Содержание гемоглобина в эритроцитах определяли цианметгемоглобиновым методом [5].
Для всех данных определяли медиану (Ме) и интерквартальный разброс в виде подсчета 25-(С25) и 75-процентилей (С75). Достоверность различий между группами оценивалась при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни.
Статистический анализ осуществлялся с помощью пакетов прикладных программ 81аИ811са версия 7,0 (81а18оГАпс., 2004).
Результаты и обсуждение
Динамика изменения уровня карбонильных производных белков в эритроцитах приведена в табл. 1. На II стадии заболевания в эритроцитах происходит увеличение содержания альдегидных форм КПБ на 119 %, на III стадии их уровень выше контрольных значений на 105 %, а на IV стадии падает до уровня контрольной группы.
Уровень кетонных форм КПБ на II стадии значительно возрастает, а затем на III стадии резко падает и на IV снова увеличивается. На II стадии он увеличивается на 380 %, на III - на 37 % и на IV стадии - на 197 %.
Содержание быстрореагирующих 8И-групп в эритроцитах на первой стадии выше на 19 %, на второй - 21 %, на третьей - 18 %, на четвертой - 33 % в сравнении с таковыми лиц контрольной группы. Содержание медленно реагирующих тиоловых групп белков в эритроцитах на I, II и III стадии ниже по сравнению с контролем на 28; 9; 13 % соответственно, на IV стадии содержание 8И-групп выше на 16 %. Содержание замаскированных тио-ловых групп в плазме в сравнении с контролем выше на 4 % на I стадии, на 14; 26; 2 3% на II, III и IV стадиях соответственно (табл. 2).
Уровень суммарных тиоловых групп существенно возрастает на II и IV стадиях рака легкого, на I и III стадиях значимых отличий от контроля не наблюдается (рис. 1).
Содержание восстановленного глутатиона на I стадии рака легкого ниже контроля на 34 %, на II стадии существенно возрастает и становится выше нормальных показателей на 40 %, на III стадии снова снижается, достигая контрольных значений, и на IV стадии становится ниже нормы на 42 % (рис. 2.)
Изменения активности глутатионпероксида-зы и глутатион-8-трансферазы имеют схожую динамику, сначала происходит увеличение активности фермента от I ко II стадии, затем она постепенно снижается.
Но при этом активность глутатионперокси-дазы в эритроцитах больных раком легкого все время выше контроля, в то время как активность глутатион-8-трансферазы снижена (рис. 3 и 4.)
Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что динамика изменения уровня тиоловых групп белков в эритроцитах больных совпадает с таковой у карбонильных производных, что свидетельствует о единых механизмах окислительной модификации белков, в то же время характер изменений глутатионового звена антиоксидантной системы совпадает только на первых трех стадиях рака легкого.
Вероятно, в эти периоды развития заболевания глутатионовая система играет важную роль в поддержании уровня восстановленных тиоловых групп белков. На IV стадии изменения показателей редокс-зависимой модификации белков и глута-тионового звена антиоксидантной системы разно-направлены.
Повышение уровня сульфгидрильных групп белков может происходить в результате увеличения активности тиоредоксиновой системы, что отмечается некоторыми исследователями при раке легкого [8; 10]. Поскольку тиоловые группы белков могут выполнять антиоксидантную функцию, повышение их уровня, вероятно, происходит с целью компенсации недостатка низкомолекулярных антиоксидантов [14].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТИОЛОВОГО ГОМЕОСТАЗА... 49
Рис. 1. Содержание суммарных тиоловых групп белков в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого:
1 - контрольная группа; 2 - больные раком легкого I стадии;
3 - больные раком легкого II стадии; 4 - больные раком легкого III стадии;
5 - больные раком легкого IV стадии.
Рис. 2. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого:
1 - контрольная группа; 2 - больные раком легкого I стадии;
3 - больные раком легкого II стадии; 4 - больные раком легкого III стадии;
5 - больные раком легкого IV стадии.
Рис. 3. Активность глутатионпероксидазы в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого:
1 - контрольная группа; 2 - больные раком легкого I стадии;
3 - больные раком легкого II стадии; 4 - больные раком легкого III стадии;
5 - больные раком легкого IV стадии.
8,00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00 1,00 0,00
Рі<0,05
Р^О.ОБ
Р^<0,05
1 2 3 4 5
Рис. 4. Активность глутатион-8-трансферазы в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого:
1 - контрольная группа; 2 - больные раком легкого I стадии;
3 - больные раком легкого II стадии; 4 - больные раком легкого III стадии;
5 - больные раком легкого IV стадии.
Таблица 1
Содержание карбонильньк производны.\ белков в эpитpоцигax в зависимости от стадии рака легкого, у .е./г Hb (Ме (С25;С75))
Стадия N Карбонильные производные белков
Альдегидные формы Кетонные формы
Контроль 35 2,65 (1,69; 4,39) 1,84 (1,39; 2,95)
II 14 5,78 (2,22; 8,55)* 8,84 (5,б2; 11,23)*
III 2б 5,43 (2,03; 6,31)* 2,53 (1,50; 3,5б)**
IV 20 2,73 (2,01; 9,13) 5,47 (2,93; 7,99)*,***
*p<0,05 по сравнению с контролем; **p<0,05 по сравнению со II стадией; ***p<0,05 по сравнению с III стадией
Таблица 2
Содержание тиоловых ^ групп белков в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого, мкмоль/мг НЬ (Ме (С25; С75))
Стадия N Тиоловые группы
Быстрореагирующие Медленнореагирующие Замаскированные
Контроль 35 1б,79( 11,78; 21,23) 7,08(3,85; 9,91) 12,82(10,14; 19,28)
I 8 19,98(17,50; 22,15) 5,12(3,97; 7,79) 13,35(9,13; 17,43)
II 30 20,31(1б,70; 25,58) б,4б(4,57; 12,73) 14,58(12,02; 23,28)
III 44 19,77(1б,52; 27,4б) б, 19(4,91; 11,79) 1б,17(11,30; 18,95)
IV 34 22,31(12,50; 2б,90) 8,19(5,98; 12,18) 15,83(13,54; 17,54)
Выводы
Таким образом, характер изменений окислительной модификации белков и глутатионового звена антиоксидантной системы совпадает на первых трех стадиях рака легкого, что говорит о влиянии системы глутатиона на интенсивность окислительной модификации белков и восстановление тиоловых групп.
Литература
1. Веревкина И.В., Точилкин А.И., Попова Н.А. Колориметрический метод определения SH-групп и - S-S-связей в белках при помощи 5,5'-дитиобио(2-нитробензойной) кислоты. - Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977.- С. 223-31.
2. Долгих В. Т. Опухолевый рост. - М.: Феникс, 2007. - 160 с.
3. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопр. мед. химии. - 1995. - Т. 41, № 1. - С. 24-6.
4. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Свободнорадикальные процессы при старении, нейродегенеративных заболеваниях и других патологических состояниях // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53, № 4. - С. 351-72.
5. МеньшиковВ.В. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина, 1987. - 460 с.
6. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.3. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
7. BeutlerE. Red cell metabolism. А manual of biochemical methods. - Grune&Stration, Orlando, 1990. - P. 131-4.
8. Esme H., Cemek M., Sezer M. et al. High levels of oxidative stress in patients with advanced lung cancer // Respirology.
- 2008. - 13(1). - P. 112-6.
9. Habig W.H., PabstM.J., Jacoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. - 1974. - 249(22). - P. 7130-9.
10. Hernandes-Hernandes A., Rodrigues M.C., Lopes-Revuelta A. et al. Alteration in erythrocyte membrane protein composition in advanced non-small cell lung cancer // Blood Cells, Molecules, and Diseases. - 2006. - 36. - P. 355-63.
11. Kemp M., Go Y., Jones D.P. Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems: A perspective on redox systems biology // Free Radical Biology & Medicine. - 2008. - 44. - P. 921-37.
12. Levine L.R., Williams J.A., Stadtman E.R. et al. Carbonyl assay for determination of oxidatively modified proteins // Methods in enzymology. - 1994. - 233(37). - P. 346-57.
13. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase // J. Clin. Lab. Med. - 1967. - 70. - P. 158-69.
14. Suma H.R., Prabhu K., Shennoy R.P. et al. Estimation of salivary protein thiols and total antioxidant power of saliva in brain tumor patients // Journal of Cancer Researh and Therapeutics. - 2010. - 6(3). - P. 278-81.
15. Winterbourn C.C., Hampton M.B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling // Free Radical Biology & Medicine. - 2008. - 45. - P. 549-61.
Список сокращений
ДТНБК - 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойная кислота
КПБ - Карбонильные производные белки
GSH - восстановленный Глутатион
На IV стадии изменения разнонаправлены -происходит угнетение глутатион-зависимых механизмов и усиление окислительной модификации белков, что, вероятно, может являться одним из механизмов компенсации антиоксидантых свойств эритроцитов.
