CC BY
79
оригинальные статьи Журнал фундаментальной медицины и биологии
УДК 616.72
Н.П. Милютина1, И.В. Кролевец2, С.Б. Панина1, М.А. Забродин2, Д.Ю. Гвалдин1, Е.А.Шевякова1, А.А. Плотников1, В.В. Внуков1
ГЛУТАТИОН-ЗАВИСИМАЯ АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА В РЕГУЛЯЦИИ РЕДОКС-ГОМЕОСТАЗА КРОВИ И СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ГОНАРТРОЗЕ
Южный федеральный университет, факультет биологических наук, кафедра биохимии и микробиологии 2Ростовский государственный медицинский университет, кафедра травматологии и ортопедии, ЛФК и спортивной медицины ФПК и ППС
Цель: исследование роли глутатион-зависимой антиоксидантной системы в механизмах патогенеза гонар-троза и возможности использования исследуемых показателей в качестве биохимических маркеров данного заболевания.
Материалы и методы: в крови и синовиальной жидкости больных гонартрозом, которым применяли различные способы лечения, исследована активность компонентов глутатион-зависимой антиоксидантной системы.
Результаты: Установлено, что в синовиальной жидкости больных гонартрозом (ГА), которым применяли эндоартрохирургических технологий, наблюдается выраженная депрессия исследованных компонентов глутатион-зависимой антиоксидантной системы по сравнению с больными, получавшими консервативное лечение. При консервативном лечении ГА в лимфоцитах и эритроцитах наблюдается напряженность и дисфункция компонентов глутатионовой системы, которые характеризуются в лимфоцитах существенной активацией ГПО и ^Т, в эритроцитах - резкой активацией ^Т на фоне ингибирования ГПО и снижения уровня GSH.
Заключение: Исследование компонентов глутатион-зависимой антиоксидантной системы в крови и синовиальной жидкости больных гонартрозом может использоваться в качестве маркеров тяжести патологического процесса и эффективности лечения.
Ключевые слова: гонартроз, кровь, синовиальная жидкость, глутатион-зависимая антиоксидантная система.
N.P. Milutina1, I.V. Krolevets2, S.B. Panina1, M.A. Zabrodin2, D.Yu. Gvaldin1, E.A. Shevyakova1, A.A. Plotnikov1, V.V. Vnukov1
GLUTATHIONE-DEPENDENT ENZYMES IN REGULATION BLOOD AND SYNOVIAL FLUID REDOX-HOMEOSTASIS IN PATIENTS WITH OSTEOARTHRITIS OF THE KNEE JOINT
1Southern Federal University, Faculty of Biological Science, Department of Biochemistry and Microbiology, 2Rostov State Medical University, Department of Traumatology and Orthopedy
Purpose: The aim of the present study to investigate the role of glutathione-dependent enzymes in the regulation of blood and synovial fluid redox-balance in patients with osteoarthritis of the knee joint.
Materials and methods: In the blood and synovial fluid of the three groups of patients with osteoarthritis of the knee joint, undergoing various treatment, the glutathione-dependent enzymes activity was determined.
Results: A significant changes in glutathione-dependent enzymes activity in osteoarthritis, characterized by decreased level of glutathione and a significant inhibition of glutathione peroxidase and glutathione-S-transferase in synovial fluid and disturbance of glutathione-dependent system function in blood has been shown.
Summary: Increased oxidative stress in osteoarthritis have led to compensatory changes in the glutathione level and antioxidant enzymes activity in blood. These findings confirm that glutathione-dependent system components can serve as markers for disease activityand effectiveness of treatment
Key words: osteoarthritis of the knee joint, blood, synovial fluid, glutathione-dependent antioxidant system.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение нологическом
В настоящее время остеоартроз (ОА) рассматривается как одна из наиболее распространенных патологий современного общества. Известно, что 10-12% населения России страдают ОА, манифестация которого приходится на возраст 60 лет и старше, а к 80 годам заболевание становится обязательным атрибутом комплекса возраст-ассоции-рованных патологий [1]. Среди субъектов Южного Федерального округа отмечается большая распространенность ОА и, в том числе, гонартроза (ГА) в Ростовской и Волгоградской областях [2].
В патогенезе ОА ведущее место занимают нарушения процессов деградации и синтеза хондро-цитов, внеклеточного матрикса и субхондральной кости. Появились убедительные доказательства генетической предрасположенности к заболеванию, участия биомеханических и метаболических изменений, локальной воспалительной реакции, ожирения [1,3]. Особое место в механизмах патогенеза ОА отводится нарушению свободнорадикального гомеостаза, повышенной продукции активированных кислородных метаболитов (АКМ) и развитию окислительного стресса, усиливающего развитие дегенеративно-дистрофического процесса в суставах [3].
Клетки способны нейтрализовать АКМ и поддерживать редокс-гомеостаз с помощью ферментативных и неферментативных антиоксидантов. Наиболее важной системой, участвующей в редокс-регуляции функций клеток, является глутатион-за-висимая антиоксидантная система. В нее входят глутатион (GSH), глутатионпероксидаза (ГПО), глутион-S-трансфераза(GST),глутатион-редуктаза (GR), глутаредоксины^гх) и пероксиредокси-ны (Ргх). Данная антиоксидантная система играет ключевую роль в поддержании редокс-статуса тканей сустава, однако особенности нарушения ее компонентов при ГА исследованы недостаточно.
Цель настоящей работы - исследование роли глутатион-зависимой антиоксидантной системы в механизмах патогенеза гонартроза и возможности использования исследуемых показателей в качестве биохимических маркеров данного заболевания.
Материалы и методы
Проведено клинико-биохимическое обследование 98 больных гонартрозом, которые в соответствии с полученным медикаментозным лечением и применением эндоартрохирургических технологий, были разделены на 3 группы: 1 группа — больные, получавшие консервативное лечение (41 человек), 2 группа — больные, которым проводили эндоар-трохирургические вмешательства без повреждения костной основы (32 человека); 3 группа — пациенты, которые подвергались эндоартрохирурги-ческим вмешательствам с повреждением костной основы (23 человека). Средний возраст больных составил 56,4+2,4 года. В качестве контроля использовали кровь 20 условно здоровых людей (доноров) соответствующего возраста. Всем больным проводились рентгенография и ультразвуковое обследование пораженных суставов. При рентге-
исследовании суставов по критериям Kellgren J.H. и Lawrence J.S. у обследованных больных ГА установлены II -III стадии поражения суставов.
Забор крови у пациентов проводили утром натощак из локтевой вены.Кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом К3-ЭДТА, плазму и эритро-цитарную массу разделяли центрифугированием при 3000g в течение 10 мин. Лимфоциты выделяли из цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина. К полученной суспензии лимфоцитов добавляли неионный детергент Тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1% для получения лизата, который затем анализировали. Образцы синовиальной жидкости (СЖ) получали путем пункции коленного сустава, после чего пробы центрифугировали при 3000g в течение 10 мин и получали супернатант СЖ. Материалом для биохимического исследования явились плазма крови, эритроциты, лимфоциты и синовиальная жидкость.
Активность глутатионпероксидазы (ГПО) определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила [4], активность глутатион^-трансферазы (rST) измеряли по скорости реакции ферментативного образования GS^^-динитробензола в реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) [4]. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) оценивали по цветной реакция с 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБК, реагент Эллмана) с образованием соединения, которое обладает максимумом поглощения при 412нм. Количество общего белка определяли с помощью коммерческого набора производства «Эко-сервис» (Россия). Определение гемоглобина осуществляли с помощью стандартного набора фирмы «Эколаб» (Россия).
Статистическую обработку данных проводили с помощью MSExcel 2007 и Statistica 6.0. Для каждой серии рассчитывали средние арифметические значения показателей и их стандартные ошибки (М+m). Анализ выпадающих значений проводили с использованием критерия Шовене. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали t-критерий Стью-дента. При p<0,05 различия считали статистически значимыми, при 0,1<p<0,05 предполагали тенденцию к статистической значимости различий.
Результаты и обсуждение
Проведенное клинико-биохимическое исследование показывает, что в синовиальной жидкости и эритроцитах больных ГА наблюдается снижение уровня GSH, более выраженное в синовиальной жидкости (таблица 1). В синовиальной жидкости падение уровня GSH во 2-й и 3-й группах пациентов, которым применяли эндоартрохирургические технологии, составляет 35% и 77% относительно 1-й группы больных, получавших консервативное лечение. Снижение содержания GSH в эритроцитах больных 1-й и 2-й группы составляет 2128% относительно уровня доноров, тогда как в 3-й группе не выявлено достоверных изменений содержания GSH (таблица 1).
оригинальные статьи Журнал фундаментальной медицины и биологии
Таблица 1.
Содержание глутатиона (08И) в эритроцитах и синовиальной жидкости больных гонартрозом различных клинических групп. М+п, п=10-27
Объект Группы обследованных
исследования доноры 1 группа 2 группа 3 группа
Эритроциты, мкмоль/г Hb 11,42+0,46 8,19+0,61 9,04+0,78 12,10+0,58
р, < 0,01 < 0,05 > 0,1
V/o -28 -21 -
Р2 >0,1 <0,01
Д2% - 48
Синовиальная жидкость, мкмоль/г белка P2 ¿2% 3,90+0,43 2,55+0,34 <0,05 -35 0,91+0,31 <0,001 -77
Примечание: здесь и далее р1 - достоверность различий относительно доноров, р2 - относительно 1 группы больных; А1% - изменения (%) относительно доноров, А2% - относительно 1 группы.
Следует отметить, что синовиоциты и синовиальная жидкость обладают хорошо сбалансированной антиоксидантной системой, представленной как высокомолекулярными антиоксидантами (СОД1, СОД2, каталазой, ГПО, TST, глутати-онредуктазой, тиоредоксином, глутаредоксином, тиоредоксинредуктазой, пероксиредоксином 2, 5, металлотионеином 2А), так и низкомолекулярными антиоксидантными соединениями (глутатионом, аскорбатом, мочевой кислотой и др.) [5,6].Причем, некоторые антиоксиданты в синовии содержатся в больших количествах, чем в плазме крови. Например, экстрацеллюлярная супероксиддисмутаза - СОД3, уровень которой в синовиальной жидкости втрое выше, чем в плазме крови [6]. Антиокси-дантная система тканей сустава предназначена для эффективной элиминации АКМ и продуктов пере-кисного окисления (ПОЛ), которые значительно усиливают процессы деструкции хрящевой ткани.
В исследовании [6] установлено, что в синовиальной жидкости больных ОА наблюдается существенное снижение уровня восстановленного глу-татиона и аскорбата по сравнению с группой, у которой не выявлено повреждения хряща. В работе [7] показано снижение уровня глутатиона в эритроцитах больных ГА, в плазме крови существенно снижалось содержание аскорбата.
Глутатион — трипептид ^-у-глутамил-L-цистеинилглицин), обладающий антиоксидантными свойствами. Благодаря наличию остатка цистеина, GSH неферментативно легко окисляется электро-фильными соединениями (АКМ) в глутатион-дис-ульфид (GSSG) [8].Как антиоксидант, глутатион занимает центральное место в антирадикальной и антиперекисной защите клетки. GSH эффективно нейтрализует свободные радикалы (например, гидроксильные, липидные радикалы, пероксини-трит и H2O2) непосредственно и опосредованно,
путем ферментативных реакций. Так, различают три линии защиты от активированных кислородных метаболитов, в которых принимают участие следующие ферменты: 1) супероксиддисмутаза, 2) каталаза, глутатионпероксидаза,тиоредоксины, пероксиредоксины, глутаредоксины 3) глутатион-пероксидаза и глутатион^-трансферазы; они последовательно восстанавливают супероксид, H2O2 и органические гидроперекиси. Нужно добавить еще и четвертую линию защиты (обезвреживание вторичных продуктов пероксидации и других окисленных соединений), в которой участвуют глутатион^-трансферазы, глиоксилаза и фор-мальдегиддегидрогеназа. Очевидно, что глутатион принимает участие в трех линиях защиты из четырех и, следовательно, вносит важнейший вклад в функционирование антиоксидантной системы [9]. Одна из функций глутатиона в редокс-регуляции связана с образованием смешанных дисульфидов, или глутатионилированием. Глутатионилирование функциональных редокс-чувствительных SH-групп цистеина в белках защищает их от окислительной деградации активными формами кислорода. Кроме того, глутатион, участвуя в редокс-регуляции, влияет на экспрессию сигнальных белков на уровне транскрипции.
Снижение уровняGSH приводит к дисбалансу глутатион-зависимой антиоксидантной системы в крови и синовиальной жидкости у больных ГА различных клинических групп.Проведенное исследование свидетельствует, что в СЖ больных ГА 2-й и 3-й групп, которым применяли эндоартрохирур-гические технологии, установлено снижение активности ГПО на 31-32% по сравнению с 1-й группой, которой проводили консервативное лечение (таблица 2). В эритроцитах больных ГА трех обследованных групп установлено снижение активности
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
ГПО на 25-27%, тогда как в плазме крови наблю- вышение активности ГПО на 63%, в группах с хи-
дается повышение активности фермента на 25-36% рургическим вмешательством активность фермента
также во всех обследованных группах пациентов. не изменяется. В лимфоцитах больных 1-й группы отмечается по-
Таблица 2.
Активность глутатионпероксидазы (ГПО) в крови и синовиальной жидкости больных гонартрозом
различных клинических групп. М+п, п=10-33
Объект исследования Группы обследованных
доноры 1 группа 2 группа 3 группа
Эритроциты, МЕ/г НЬ Р А1% Р2 А2% 274,43+29,21 200,74+11,16 < 0,01 -27 204,19+12,51 < 0,05 -26 > 0,1 206,46+17,13 < 0,05 -25 > 0,1
Лимфоциты, МЕ/г белка Р1 А1% Р2 А2% 962,51+102,26 1568,81+216,52 < 0,05 63 801,19+103,32 > 0,1 < 0,05 -50 899,23+51,87 > 0,1 >0,1
Плазма, МЕ/г белка Р1 А1% Р2 А2% 33,32+2,67 45,32+2,67 <0,01 36 42,11+1,57 <0,05 26 >0,1 42,94+2,59 <0,05 29 >0,1
Синовиальная жидкость, МЕ/г белка Р2 А2% 44,08+3,61 30,63+3,01 <0,01 -31 29,85+3,28 <0,05 -32
Следует отметить, что глутатионпероксидазы (К.Ф, 1.11.1.9) — семейство ферментов, которые катализируют восстановление перекиси водоро-дадо воды, органических гидроперекисей до соответствующих спиртов с использованием глута-тиона в качестве косубстрата, а также проявляют пероксинитритредуктазную активность [8]. ГПО представлена различными изоформами, из которых ГПО1 (цитозольная), ГПО3 (внеклеточная) и ГПО4 ^-форма локализована в митохондриях, S-форма — в ядре, эндоплазматическом ретику-луме и цитоплазме) экспрессируются в тканях сустава. Можно полагать, что снижение активности Se-содержащего энзима ГПО в синовиальной жидкости и эритроцитах больных ГА является важным звеном патогенеза дегенеративно-дистрофического процесса в суставе. Известно, что недостаточность и дефицит селена ассоциируется с различными формами остеоартропатий [10]. Кроме того, продемонстрировано участие специфических селенопро-теинов трех суперсемейств — глутатионпероксидаз, тиоредоксинредуктаз, дейодиназ в механизмах ОА.
С другой стороны, активация ГПО в лимфоцитах больных 1-й группы и в плазме крови всех трех обследованных групп больных следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на торможение свободнорадикального окисления в крови. В исследовании [7] также показана компенсаторная активация компонентов антиоксидантной системы крови при ГА, что создает дополнительную защиту против окислительного стресса.
Исследование активности ^Т показывает, что в синовиальной жидкости больных ГА, которым проводили эндоартрохирургическое лечение (2-я и 3-я группы), наблюдается существенное ингибиро-вание ^Т, активность которой снижается на 81% и 89% относительно 1-й группы пациентов (таблица 3). В эритроцитах и лимфоцитах 1-й группы больных, получавших консервативное лечение, наблюдается напряженность функционирования фермента, что характеризуется резкой активацией ^Т, составляющей 123% и 88%, соответственно. В эритроцитах пациентов, которым применяли эндоартрохирургические технологии (2-я и
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
3-я группы), активность фермента снижается на 34% и 43%, в лимфоцитах подавление активности ^Т на 26% отмечено только во 2-й группе па-
циентов. В целом, при различных вариантах ар-троскопии активность ^Т заметно ниже, чем при консервативном лечении.
Таблица 3.
Активность глутатион-8-редуктазы (Г8Т) в крови и синовиальной жидкости больных гонартрозом различных клинических групп. М+п, п=8-30
Объект исследования Группы обследованных
доноры 1 группа 2 группа 3 группа
Эритроциты, МЕ/г НЬ Р1 А1% Р 2 А2% 1,37+0,23 3,04+0,26 < 0,01 123 2,95+0,19 < 0,001 116 < 0,05 -34 2,77+0,50 < 0,05 103 < 0,05 -41
Лимфоциты, МЕ/г белка Р1 А1% Р 2 А2% 9,82+0,72 18,45+1,91 < 0,01 88 7,28+0,75 < 0,05 -26 < 0,01 -51 7,79+1,90 > 0,1 < 0,05 -39
Синовиальная жидкость, МЕ/г белка Р2 А2% 0,70+0,02 0,13+0,02 < 0,05 -81 0,07+0,02 < 0,05 -89
Глутатион^-трансферазы (К.Ф. 2.5.1.18) — мультифункциональные белки, использующие восстановленный глутатион для конъюгации с гидрофобными соединениями, их восстановления или изомеризации [8]. TST проявляет антиоксидантное действие путем восстановления гидроперекисей ли-пидов или конъюгации с глутатионом и элиминации промежуточных продуктов ПОЛ типа алкеналей. Очевидно, что ингибирование TST в синовиальной жидкости приводит к негативным последствиям, связанным с накоплением в среде сустава высокотоксичных реактивных карбонильных соединений (4-гидроксиноненаля и др.) и конечных продуктов липопероксидации (ALEs, advanced lipoxidation end-products), которые вызывают окислительную модификацию макромолекул экстраклеточного ма-трикса, что способствует развитию мощного ката-болического ответа и деградации тканей сустава.
Глутатион-зависимая антиоксидантная система, ответственная за элиминацию высоко токсичных АКМ и молекулярных продуктов ПОЛ, имеет исключительно важное значение для поддержания свободнорадикального гомеостаза в хрящевой и других тканях сустава. Полученные результаты свидетельствуют, что как в крови, так и синовиальной жидкости обследованных групп больных ГА наблюдается дисфункция глутатион-зависимой антиоксидантной системы, но выраженная в раз-
личной степени. Следует подчеркнуть, что недостаточность глутатионовой системы в наибольшей степени проявляется в синовиальной жидкости обследованных групп пациентов, что характеризуется ингибированием ГПО и ^Т на фоне снижения уровня восстановленного глутатиона. Причем, степень недостаточности компонентов глутатионо-вой системы в синовиальной жидкости находится в прямой зависимости от выраженности патологического процесса и тяжести хирургического вмешательства. Синовиальная жидкость является одним из основных органоспецифических компонентов сустава и в значительной степени определяет его морфо-функциональное состояние [1]. Очевидно, что клинико-лабораторное исследование С^К, в том числе оценка ее антиоксидантного статуса, является важнейшим тестом в диагностике заболевания суставов.
В синовиальной жидкости больных ГА, которым применяли эндоартрохирургические технологии, наблюдается выраженная депрессия исследованных компонентов глутатион-зависимой антиоксидантной системы по сравнению с больными, получавшими консервативное лечение. При консервативном лечении ГА в лимфоцитах и эритроцитах наблюдается напряженность и дисфункция компонентов глутатионовой системы, которые характеризуются в лимфоцитах существенной ак-
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
тивацией ГПО и TST, в эритроцитах - резкой активацией TST на фоне ингибирования ГПО и снижения уровня GSH.
Дисфункция глутатионовой системы в синовиальной среде сустава и гиперпродукция АКМ вызывают активацию редокс-чувствительных факторов транскрипции — регуляторов воспаления (NF-kB, AP-1) и последующее увеличение экспрес-
сии цитокинов, хемокинов, эикозаноидов, оксида азота, способствующих апоптозу хондроцитов и прогрессии ОА [8]. Можно полагать, что изучение динамики отдельных компонентов глутатион-зави-симои системы в синовиальнои жидкости и крови может использоваться для адекватноИ оценки тяжести патологического процесса при ГА и эффективности проводимого лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Насонова В.А., Мендель О.И., Денисов Л.Н. и др. Остеоартроз и ожирение. 2011; (1): 1-29.
2. Зборовский А.Б., Фофанова Н.А., Мозговая Е.Э. Ревматические болезни и ревматологическая служба в Южном Федеральном округе: состояние и перспективы. Научно-практическая ревматология. 2007; (3): 4-6.
3. Lee A.S.. Ellman M.B., Dongyao Y. et al. A current review of molecular mechanisms regarding osteoarthritis and pain. Gene. 2013;527: 440-447.
4. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина И.М. Методы оценки свободнорадикальных процессов в организме. СПб.: Фолиант, 2000: 103 с.
5. Kabauyama Y., Kitamura T., Yamaki J. et al. Involment of thioredoxinreductase 1 in the regulation of redox balance and viability of rheumatoid synovial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008; 367 (2): 491-496.
6. Regan E.A., Bowler R.P., Crapo J.D. Joint fluid antioxidants are decreased in osteoarthritic joints compared to joints with macroscopically intact cartilage and subacute injury. Osteoarthr. & Cartilage. 2008; 16: 515-521.
7. Pinto S., Rao A,V, Rao A. Lipid peroxidation erythrocyte antioxidants and plasma antioxidants in osteoarthritis before and after homeopathic treatment. Homeopathy. 2008; 97: 185-189.
8. Deponte M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes Bochim et Biophys. Acta. 2013; 1830: 3217-3266.
9. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К.и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: «Слово», 2006: 556с.
10. Rayman M.P. Selenoproteins and human health: insights from epidemiological data. Bochim et Biophys. Acta. 2009; 1790: 15331540.
