CC BY
49
УДК 616.155.3+615.38-082
ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДОНОРОВ ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ С НАНОЧАСТИЦАМИ ДИОКСИДА КРЕМНИЯ
И.А. Колбин, О.Л. Колесников ЧелГМА, г. Челябинск
Проведено изучение функциональной активности нейтрофилов периферической крови доноров при инкубации с наночастицами диоксида кремния в концентрациях 1,08*1013, 0,54*1013 и 0,27*1013 частиц/мл. Средний диаметр частиц составил 9 нм. Время инкубации - 3 часа. Во всех опытных пробах отмечено достоверное уменьшение количества жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. Было показано, что наночастицы диоксида кремния способны активировать нейтрофилы. Наибольший эффект активации наблюдался при воздействии наночастиц диоксида кремния в концентрации 1,08-Ю13 частиц/мл.
Ключевые слова: наночастицы диоксида кремния, нейтрофилы периферической крови, жизнеспособность, функциональная активность.
Наночастицы - инженерно спроектированные микроскопические образования, имеющие размеры не более 100 нм. По заданию Роспотребнадзора в ГУ НИИ питания РАМН совместно с рядом на-учно-исследовательских учреждений РАН, РАМН и РАСХН, а также МГУ им. М.В. Ломоносова был разработан проект «Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, токсичности, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», который был утвержден постановлением Главного Государственного санитарного врача РФ №79 от 31.10.07 [7]. В литературе различают естественные и искусственные наночастицы. Естественные биологические и небиологические наночастицы не являются новыми факторами для человека. Примером естественных биологических наночастиц являются вирусы, небиологических - компоненты дымов от сгорания моторных топлив, сварочного аэрозоля, входят в состав воздуха, воды, почв, донных отложений, образуются в значительных количествах при лесных пожарах и вулканических извержениях, а также в результате функционирования теплоэлектростанций и в других высокотемпературных технологических процессах. Искусственные наночастицы были созданы сравнительно недавно и представляют новый фактор воздействия на окружающую среду и организм человека [5]. Области применения современных наноматериалов разнообразны и включают биомедицину, химическую промышленность, оптику, энергетику, строительство, электронику, косметологию, производство пищевых продуктов и товаров народного потребления [8]. Но в то же время возникают сложные научные проблемы, связанные с воздействием наночастиц на организм человека, и опасность вмешательства нанофактора в процессы физиологиче-
ской жизнедеятельности, протекающие в клетке, а отсюда вопросы - как поведут себя искусственно собранные наночастицы, каковы будут особенности их метаболизма в клетке, воздействуя на систему рецептор-медиатор, как будет протекать транспорт токсиканта в клетке, а также возможность влияния на механизмы регуляции синтеза белка и на генные структуры в клетке [6].
Согласно современным данным самым распространенным в биосфере нашей планеты после кислорода является кремний. Он входит в состав атмосферного воздуха, песка, кварца, горного хрусталя, стекла. Мышечная ткань человека содержит (1—2)-10~2 % кремния, костная ткань - 17-10-4 %, кровь - 3,9 мг/л. С пищей в организм человека ежедневно поступает до 1 г кремния. Анализ данных литературы показал, что наночастицы обладают более высокой токсичностью по сравнению с обычными микрочастицами [2]. Есть данные, что в форме наночастиц различные материалы приобретают новые, ранее неприсущие им свойства и биологические свойства [4]. Установлено, что наночастицы обладают высокой проникающей способностью: легко проникают через мембраны клеток, обнаруживаются в клеточном ядре, преодолевают гематоэнцефалический барьер, циркулируют и накапливаются в органах и тканях, вызывая выраженные патоморфологические поражения внутренних органов, а также обладают длительным периодом полувыведения. Эффекты, вызванные попаданием наночастиц в мозг, сердечно-сосудис-тую систему, печень и другие жизненно важные органы могут быть опасны для здоровья и жизни человека и животных. Наночастицы обладают большой удельной поверхностью, что увеличивает их адсорбционную ёмкость и каталитические свойства. Это может приводить к увеличению продукции
свободных радикалов и активных форм кислорода и далее - к повреждению биоструктур (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) [7]. Токсичность наночастиц зависит от формы, размера, и других физико-химических особенностей строения, а также дозы, способа введения, концентрации и продолжительности влияния на организм [2].
Токсичность наночастиц диоксида кремния для животных и человека изучена слабо, однако широта спектра их применений ставит их на одно из первых мест в списке наночастиц, требующих детального изучения их биологических свойств.
Одними из главных представителей клеток иммунной системы, а также клетками «первой линии» противоинфекционной защиты - являются нейтрофильные гранулоциты. Содержимое их первичных, вторичных и третичных гранул богато огромным спектром биологически активных продуктов. При активации нейтрофильные гранулоциты решают свои эффекторные задачи одним из двух способов: либо с помощью фагоцитоза, либо путем активации биологически активных веществ [3].
Приведенные факты свидетельствуют о необходимости проведения научно-исследовательских работ, касающихся токсичности, положительных или отрицательных биологических эффектов наночастиц и их биобезопасности. На данном этапе решения этой задачи возможность влияния наночастиц диоксида кремния на клетки иммунной системы человека остается открытым. Данных о токсическом влиянии наночастиц диоксида кремния на нейтрофильные гранулоциты нами не встретилось.
Цель работы: проанализировать функциональную активность нейтрофилов периферической крови после 3-часовой инкубации с наночастицами БЮг в концентрациях 1,08Т013, 0,541013 и 0,27-1013 частиц/мл.
Материалы и методы. Объектом исследования были нейтрофилы, выделенные из периферической венозной крови доноров в возрасте 18-35 лет. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя составила 1,075-1,077, нижнего 1,093-1,095. После центрифугирования в течение 40 мин при 1500 об/мин нейтрофилы аккуратно собирали пипеткой, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Клеточную взвесь стандартизировали до концентрации 5 106 клеток/мл путем подсчета в камере Горяева. Клетки инкубировали в присутствии различных концентраций (1,08-Ю13, 0,54-1013 и 0,27-1013 частиц/мл) наночастиц в течение 3 часов. Диаметр наночастиц составлял 9 нм. Наночастицы БЮг были любезно предоставлены НОЦ ЮУрГУ «Материаловедения и нанотехнологий» (руководитель - профессор Сапожников С.Б.), за что авторы выражают глубокую благодарность. Жизнеспособность клеток в культуре оценивали стандартным суправитальным окрашиванием
1 %-ным раствором трипанового синего. Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Для этого 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе смешивали с 0,02 мл 1 %-ного раствора трипанового синего, ресуспензировали. Клетки помещали в камеру Г оряева и исследовали в световом микроскопе. Живые клетки были прозрачными (трипанонегативные клетки), мертвыми считались клетки, которые были окрашены в фиолетовый цвет (трипанопозитивные клетки). Подсчет производили на 100 клеток, результат выражали в процентах. Общее количество клеток подсчитывали также в камере Горяева, стандартным методом подсчета лейкоцитов. Функциональный ответ нейтрофилов крови оценивали по фагоцитарной активности нейтрофилов на модели поглощения частиц полистирольного латекса. Для этого смешивали 0,2 мл суспензии нейтрофилов в физиологическом растворе с 0,04 мл взвеси частиц полистирольного латекса, диаметром 1,7 мкм, и концентрацией 108 частиц/мл. После 30-минутной инкубации при температуре 37 °С из клеток готовили препараты, которые высушивали на воздухе, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии рассчитывали активность фагоцитоза - процент нейтрофилов, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза - число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах. С помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста проводилось определение способности к выработке активных форм кислорода. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму -диформазан. При этом темные гранулы диформа-зана выпадают внутри нейтрофилов и на их цитоплазматической мембране. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном (базальном) и индуцированном (стимулированном). Для постановки реакции вносили по 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе. В одну из них добавляли 0,04 мл физиологического раствора, во вторую добавляли 0,04 мл суспензии латекса (диаметр частиц 1,7 мкм, концентрация 108 частиц/мл). После этого во все пробирки вносили по 0,1 мл 0,2 %-ного раствора НСТ. Инкубировали в течение 30 мин при 37 °С, после инкубации материал центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, из осадка готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали 0,005 %-ным водным раствором сафранина в течение 5 минут. Учет проводили с помощью световой микроскопии по количеству гранул диформазана в нейтрофилах, используя полуколичественный метод оценки в «крестах». Определяли процент клеток, восстанавливающих НСТ (активность НСТ-теста), и интенсивность реакции восстановления НСТ. Для этого НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы: 1 - клетки с единичными гранулами диформазана в цитоплазме (+), 2 - клетки с цито-
Серия ««Образование, здравоохранение, физическая культура», выпуск 27
117
Проблемы здравоохранения
плазмой, наполовину заполненной гранулами ди-формазана (++), 3 - клетки с цитоплазмой, полностью заполненной диформазаном (+++). Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток, оцененных в один крест, умножали на 1, в два креста - на 2, в три креста - на 3. Результаты ссумировали и делили на 100. Прижизненное исследование интенсивности люминесценции лизосом в цитоплазме фагоцитов, окрашенных акридиновым оранжевым, является одним из методов оценки состояния лизосомального аппарата клеток. Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Для этого 0,2 мл взвеси
нейтрофилов в физиологическом растворе соединяли с 0,02 мл раствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Клетки инкубировали 30 мин при 37 °С. Клеточную взвесь помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и микроскопировали под масляной иммерсией в потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа. Определяли лизосомальную активность - число нейтрофилов, имеющих лизосомаль-ные гранулы (%) [3]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных статистических программ 81аЬ5Йса 6.0, с вычислением средней арифметической и ее стан-
Показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при активации разными концентрациями наночастиц в10г (п = 10)
Показатели функциональной активности Концентрации наночастиц диоксида кремния (х1013 частиц/мл)
Контроль Группа 1 0,27 Группа 2 0,54 Группа 3 1,08 Группа 4
Содержание жизнеспособных нейтрофилов, % 97,22 ± 1,15 94,77 + 1,16 93,0 ± 1,4 Рі_з = 0,02 83,77 ± 2,39 Рі_4 = 0,004 Р2-4 = 0,02 Рз-4 = 0,04
Общее количество нейтрофилов, х106 кл/мл 4,77 + 0,11 4,05 ±0,17 Рі_2= 0,003 3,49 ± 0,22 Рі-з= 0,001 Рг-з = 0,04 2,56 ± 0,2 Рі-4 = 0,0003 р2-4 = 0,0003 Рз-4 =0,01
Абсолютное количество жизнеспособных клеток, х106 кл/мл 4,64 ±0,11 3,85 ± 0,19 Рі_2= 0,01 3,23 ± 0,19 Рі_з = 0,0005 2,12 ±0,15 Рі_4 = 0,0003 Р2-4 = 0,0003 Рз—4 = 0,001
Активность фагоцитоза, % 84,5 ± 1,79 91,9 ± 1,55 Рі-2 = 0,006 86,2 ± 1,67 Рг-з — 0,02 92,9 ± 1,32 Рі_4 = 0,001 Рз-4 = 0,009
Интенсивность фагоцитоза, уел. ед. 5,74 ± 0,5 7,93 ± 0,32 Рі_2= 0,004 6,83 ± 0,4 8,75 ± 0,42 Рі^= 0,001 Рз-4 = 0,006
Активность спонтанного НСТ-теста, % 21,1 ± 1,5 27,6 ± 1,9 Рі_2 = 0,03 33,5 ± 2,3 Рі_з = 0,0007 63,2 ± 4,4 Рі_4= 0,0001 Р2-4 = 0,0001 Рз_4 = 0,0002
Интенсивность спонтанного НСТ-теста, уел. ед. 0,36 ± 0,02 0,52 ± 0,04 Рі—2 — 0,002 0,87 ± 0,02 Рі-з = 0,0001 Р2-3 ~ 0,0006 1,81+0,04 Рі_4= 0,0001 Р2-4= 0,0001 Рз^і = 0,0001
Активность индуцированного НСТ-теста, % 37,9 ±1,4 54,0 ± 2,9 Рі-2= 0,001 52,7 ± 3,0 Рі_з = 0,002 64,2 ± 2,3 Рі_4= 0,0001 Р2-4 = 0,02 Рз-4 = 0,01
Интенсивность индуцированного НСТ-теста, уел. ед. 0,66 ± 0,05 0,76 ± 0,04 1,12 ±0,05 Рі_з = 0,0004 Р2-з= 0,0002 1,89 ±0,03 Р!_4 =0,0001 Р2-4 =0,0001 Рз-4 =0,0001
Лизосомальная активность, % 66,7 ± 1,7 67,6 ± 3,0 89,1 ± 1,7 Рі_з= 0,001 р>-5 ~ 0,0001 99,0 ±0,3 Р!_4= 0,0001 р2_4= 0,001 Рз_4 “ 0,0002
дартной ошибки (М ± т). Достоверность различий между изучаемыми группами оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни [1].
Результаты. В течение 3-часовой инкубации нейтрофилов с различными концентрациями (0,27-1013, 0,54-10!3 и 1,08-Ю13 частиц/мл) наночастиц диоксида кремния жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов с увеличением концентрации снижается по сравнению с контролем (см. таблицу).
В концентрации 0,54-1013 частиц/мл - в 1,04 раза и 1,08-Ю13 частиц/мл - в 1,16 раза. При оценке общего количества клеток показатели достоверно уменьшались: в концентрации 0,27-1013 частиц/мл в 1,17 раза, в концентрации 0,54-Ю13 частиц/мл -в 1,36 раза и 1,08-Ю1 частиц/мл - 1,86 раза по сравнению с контролем (см. таблицу). Соответственно, количество жизнеспособных клеток также достоверно снижалось при использовании всех концентраций наночастиц диоксида кремния.
При исследовании состояния функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов была отмечена активация клеток. Активность фагоцитоза в концентрации 0,27-1013 частиц/мл возросла
1.08 раза, в концентрации 1,08-1013 частиц/мл в
1.09 раза по сравнению с контрольной группой. Аналогичная тенденция прослеживалась и в показателях интенсивности фагоцитоза. В наименьшей концентрации интенсивность возросла в 1,38 раза, в максимальной концентрации в 1,52 раза. В концентрации 0,54-1013 частиц /мл достоверных отличий не отмечено (см. таблицу).
Спонтанная НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов была достоверна увеличена в концентрации 0,27-1013 частиц/мл в 1,3 раза, 0,54-101 частиц/мл в 1,58 раза и в концентрации 1,08-1013 частиц/мл в 2,99 раза по сравнению с контрольной группой. Индуцированная НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов была также достоверно увеличена: в 1,4, 1,39 и 1,69 раза по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что в концентрации 1,08-Ю13 частиц/мл между показателями активности спонтанного и индуцированного НСТ-тестов происходит снижение резерва бактерицидной функции нейтрофилов. Лизосомаль-ная активность была увеличена в концентрации
0,54Т013 частиц/мл в 1,33, а в 1,08-1013 частиц/мл 1,48 раза (см. таблицу). В доступной литературе аналогичных данных по исследуемой проблеме нами не встретилось.
Заключение. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что наночастицы диоксида кремния активируют нейт-рофильные гранулоциты. Наибольший эффект наблюдается в концентрации 1,08-10!3 частиц/мл, а наименьший - 0,27-1013 частиц/мл. При этом предположительно нейтрофильные гранулоциты при действии наночастиц диоксида кремния акти-
вируются, усиливаются метаболические процессы, протекающие в клетке, с последующей активацией функциональной активности с истощением бактерицидных потенциалов. После чего клетки разрушаются по типу некроза. Не исключена и активация механизмов апоптоза. По литературным данным жизнеспособность макрофагов после инкубации с частицами кремния в концентрации 50 мкг/мл уменьшилась в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой [10]. Также была отмечена активация моноцитов, перитонеальных макрофагов при воздействии частиц кремния. В результате клетки высвобождали большое количество ИЛ-1 и впоследствии подвергались апоптозу [9,10].
Литература
1. Боровиков, В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов / В.П. Боровиков. — СПб.: Питер, 2001. — 656 с.
2. Глушкова, А.В. Нанотехнологии и нанотоксикология - взгляд на проблему / А.В. Глушкова, А. С. Радилов, В.Р. Рембовский // Токсикологический вестник. — 2007. —№6. — С. 4-8.
3. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин. - Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001. -288 с.
4. Дурнев, А.Д. Токсикология наночастиц / АД. Дурнев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2008. - Т. 145, № 1. —С. 78-80.
5. Измеров, Н.Ф. Нанотехнологии и наночастицы - состояние проблемы и задачи медицины труда / Н.Ф. Измеров, А.В. Ткач, Л.А. Иванова // Медицина труда и промышленная экология. — 2007.-№8.- С. 1-4.
6. Курляндский, Б.А. О нанотехнологии и связанных с нею токсикологических проблемах / Б.А. Курляндский // Токсикологический вестник. -2007.-Nq 6. - С. 2-3.
7. Онищенко, Г.Г. О концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов / Г.Г. Онищенко, В.А. Ту-тельян // Вопросы питания. - 2007. — Т. 76, N° 6. -С. 4-8.
8. Хотимченко, С.А. Проблема обеспечения безопасности наноразмерных объектов для здоровья человека / С.А. Хотимченко, И.В. Гмошин-ский // Гигиена и санитария. — 2009. - N° 5. — С. 7-11.
9. Kostura, М. Y. Identification of a monocyte specific 1L — 1 convertase activity / M.Y. Kostura // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000. -P. 5227-5231.
10. M'hammed Sarih, Spancer C. Brown. Silica induces apoptosis in macrophages and release of interleukin -la and interleukin - lp // Institut de Bio-chimie, Universite Paris — Sud, France. — 2001. — P. 407-414.
Поступила в редакцию 26 января 2011 г.
Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура», выпуск 27
119
