CC BY
80
Яушева Е.В.1, Мирошников С.А.1, Кван О.В.2
1 Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства
Россельхозакадемии 2Оренбургский государственный университет Е-mail: [email protected]
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВОТНЫХ
В эксперименте изучено влияние наночастиц ЭД, Fe и Fe-Co на морфологические показатели периферической крови при однократном внутримышечном введении. Установлено, что введение лиозолей наночастиц приводит к повышению уровня лейкоцитов, а также способствует увеличению количества эритроцитов.
Ключевые слова: наночастицы, эритроциты, лейкоциты.
По мере развития учения о пищевых источниках микронутриентов стала очевидной необходимость замены минеральных форм микроэлементов на более биологически доступные и менее токсичные органические соединения [1]. Последние получают все большее распространение в практике [2], [3]. Между тем помимо органических форм определенный интерес представляют другие источники микроэлементов, в частности наночастицы металлов [4], которые в силу целого ряда характеристик: меньшей токсичности [5]; биодоступности [4] и др., способны эффективно заменять органические формы.
Материалы и методы
Исследования проводились на крысах-сам-цах линии Vistar массой 150-180 г, находящихся на общевиварийном рационе кормления. Лабораторным животным в рамках отдельных групп аналогов внутримышечно вводили водные лиозоли наночастиц меди, железа и Fe-Co в дозе 2.0 мг/кг массы животного: 1 группе -медь; 2 -железо; 3 -Fe-Co, 4 (контроль) - дистиллированную воду.
Кровь получали путем декапитации у предварительно наркотизированных животных через 1 и 7 суток (n=3).
Экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с инструкциями, рекомендуемыми Российским Регламентом, 1987 г. и «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)».
В эксперименте использовались наночастицы меди (103±2 нм), железа (80±5 нм) и наночастицы Fe-Co (Fe - 70%; Со - 30%; 90±2 нм) сфери-
ческой формы, полученные методом высокотемпературной конденсации на установке «МиГен» [5], [6] и предоставленные д.б.н. Н.Н. Глущенко (Институтом энергетических проблем химической физики РАН, Москва). Размеры наночастиц меди и железа были определены с помощью сканирующего электронного микроскопа^М 7401F, размеры наночастиц Fe-Co с помощью атомносилового микроскопа SMM-2000. Приготовление водных лиозолей наночастиц проводили путем диспергирования (f- 35 кГц, N - 300 (450) Вт, А -10 мкм) точной навески порошка в течение 30 мин.
Гематологические показатели определяли с помощью автоматического гематологического анализатора Medonic М16. В стабилизированной гепарином или трилоном Б крови определяли содержание лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, процентное отношение и количественное содержание отдельных видов лейкоцитов; концентрацию гемоглобина и среднее содержание гемоглобина в одном эритроците.
Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием пакета программ Statistica 6.0 и программного пакета MS Excel 2007.
Результаты исследований
Как показали исследования, внутримышечное введение лабораторным животным водных лиозолей наночастиц сопровождается неоднозначными изменениями энтеральных характеристик подопытных животных.
Так, введение лиозолей приводит к достоверному увеличение количества лейкоцитов относительно контрольных значений на 39,2 и 74,6% (р<0,05) в 1 и 3 группах спустя сутки,
и на 7,9 (р<0,05); 16,4 и 14,9 (р<0,05)% в 1, 2 и 3 группах соответственно на 7 сутки (табл. 1).
Количественное содержание отдельных видов лейкоцитов изменялось следующим образом:
- содержание лимфоцитов было достоверно выше контрольных значений во всех опытных группах, а именно на 32,5 (р<0,001)% в первой группе; на 1,25 (р<0,001)% - во второй группе; на 67,5 (р<0,001)% - в третьей группе через сутки, и на 7,6; 17,6 и 17,2 (р<0,001)% в тех же группах соответственно через 7 суток;
- содержание гранулоцитов также достоверно увеличивалось относительно контроля на 53,8 (р<0,001); 15,3 и 98,7 (р<0,001)% в 1, 2 и 3 группах соответственно спустя сутки, и на 3,5 (р<0,001); 10,5 и 3,5 (р<0,001)% в 1, 2 и 3 группах соответственно через 7 суток;
- содержание моноцитов в 1 и 3 группах достоверно (р<0,001) превышало контрольные значения более чем в 2 раза, а во второй группе на 19,1 (р<0,001)% через сутки; и на 7,6 (р<0,001) -в первой группе, 13,9 и 11,4 (р<0,001)% во второй и третьей группах соответственно на 7 сутки.
В процентном отношении отдельных видов лейкоцитов наблюдался незначительный сдвиг в сторону увеличения процента моноцитов и гранулоцитов, и несущественного снижения
процента лимфоцитов относительно контрольных значений спустя сутки во всех опытных группах, тогда как на 7 сутки во всех опытных группах наблюдалась обратная ситуация (рис. 1).
В отношении количества эритроцитов также наблюдались изменения: было выявлено увеличение содержания эритроцитов относительно контроля на 34,2% в первой группе, на 15,04% и 26,6% - во второй и третьей группах соответственно через сутки, и на 5,3, 9,5 и 4,5% в 1, 2 и 3 группах соответственно через 7 суток (табл. 2).
Анализ среднего содержания гемоглобина в эритроците и концентрации гемоглобина показали следующие изменения: опытные значения среднего содержания гемоглобина в эритроците были выше контрольных во всех опытных группах на 12-13% спустя сутки, и на 1-3% через 7 суток; концентрация гемоглобина также превышала опытные значения на 67,3% в первой группе и на 45,7% - во второй и третьей группах через сутки, и на 3,2, 10 и 7,8% в 1, 2 и 3 группах соответственно на 7 сутки.
Изменения в количестве тромбоцитов наблюдались в снижении их содержания на 8,4; 10,7 и 11,4% в 1,2 и 3 группах относительно контроля
Таблица 1. Количественные показатели лейкоцитов и их отдельных видов в крови крыс-самцов линии Vistar при однократно введении в организм наночастиц меди, железа, Fe-Co
Показатель Группа Время после инъекции, сут.
1 7
Лейкоциты, 1012/л 1 13,6±1,4* 8,2±4,45*
2 9,9±1,5* 8,85±0,55*
3 17,1±1,18* 8,73±0,55*
4 9,767±0,409 7,600±3,371
Лимфоциты, 1012/л 1 10,6±0,01*** 6,46±0,03***
2 8,1±0,04*** 7,05±0,02***
3 13,4±0,06*** 6,963±0,09***
4 8±0,01 5,95±0,04
Гранулоциты, 1012/л 1 1,2±0,7*** 0,89±0,01***
2 0,9±0,001*** 0,95±0,01***
3 1,55±0,02*** 0,89±0,04***
4 0,78±0,05 0,86±0,02
Моноциты, 1012/л 1 1,8±0,03*** 0,85±0,002***
2 1,±0,01*** 0,9±0,01***
3 2,1±0,03*** 0,88±0,01***
4 0,84±0,02 0,79±0,01
*- при р<0,05; *** - при р<0,001
через сутки, и на 14,2; 9,9 и 18,9% в 1, 2 и 3 группах соответственно через 7 суток.
Сравнивая описанные эффекты исследуемых наночастиц между собой можно отметить следующее:
1) Уровень лейкоцитов через сутки выше при введении наночастиц Fe-Co, на 35% выше чем при введении наночастиц меди и на 73,2% выше чем при введении наночастиц железа. Через 7 суток количество лейкоцитов выше при введении наночастиц железа, на 8,6 и 1,5% чем при ведении наночастиц меди и Fe-Co соответственно.
2) Содержание эритроцитов выше через сутки при введении наночастиц меди, на 19,1 и 7,6% чем при введении наночастиц железа и Fe-Co, и через 7 сут. на 4-5% при введении наночастиц железа по сравнению с остальными наночастицами.
3) Концентрация гемоглобина через сутки также выше после введения наночастиц меди, на 21-22% выше по сравнению с наночастицами железа и Fe-Co, тогда как через 7 сут. величина данного показателя выше при введении наночастиц железа, на 6,8 и 2,2% выше, чем при введении наночастиц меди и Fe-Co. В отношении среднего содержания гемоглобина в 1 эритроците наблюдаются примерно одинаковые
превышения для всех наночастиц по сравнению с контролем.
В результате, наблюдаемые нами изменения, свидетельствовали о наличии ответной реакции организма на введение инородного тела, которая имела различные проявления.
Как показали исследования, введение тестируемых наночастиц ведет к достоверному увеличению уровня лейкоцитов и их отдельных видов относительно контрольных значений как через сутки (1,2 и 3 опытные группы), так и через 7 суток (4,5 и 6 опытные группы) после инъекции. При этом процентное отношение отдельных видов сдвинуто в сторону моноцитов и гра-нулоцитов через сутки и несущественно в сторону лимфоцитов через 7 суток. Подобные изменения, согласно литературным данным, связаны с тем, что наночастицы способны активизировать некоторые группы лейкоцитов. Так, из исследований Колбина И.А. с соавтор. [7] следует, что наночастицы диоксида кремния в концентрации 1,08*1013 частиц/л способны активировать функциональную активность грану-лоцитов, при этом активность и интенсивность фагоцитоза возрастают в 1,09 и 1,52 раза, хотя жизнеспособность самих клеток в результате снижается в 1,86 раза. При этом предположительно гранулоциты при действии наночстиц
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0 10,0
0,0
I опыт 12 контроль
& &
и и сч т
1 сут.
лимфоциты
гранулоциты
.р г .р г <м 3 гр. .р г .рг СІ и 3 .рг .рг 3 .р1г .рг .рг 3
7 сут. 1 ут. с 7 сут. 1 сут.
гр гр р
г
т
7 сут. моноциты
Рисунок 1. Процентное отношение отдельных видов лейкоцитов крови крыс-самцов линии У1з1аг при однократно введении в организм наночастиц меди, железа, Fe-Co
Таблица 2. Показатели количества эритроцитов, концентрации гемоглобина, среднего содержания гемоглобина в 1 эритроците и количества тромбоцитов крови крыс-самцов линии Vistar при однократно введении
в организм наночастиц меди, железа, Fe-Co
Показатель Группа Время после инъекции, сут.
1 7
Эритроциты, 1012/л 1 7,41±0,12 5,98±1,26
2 6,35±0,3 6,22±0,58
3 6,99±0,37 5,93±0,54
4 5,52±1,67 5,68± 0,61
МНС1, пг 1 23,4± 0,17 22,57±3,88
2 23,5±0,29 22,1±1,7
3 23,75±0,202 22,2±4,05
4 20,77±3,39 21,7±0,74
Концентрация гемоглобина, г/л 1 201,3±10,4 127,3±10,3
2 175,3±14,1 135,7±11,7
3 175±12,02 133±16,9
4 120,3±25,9 123,3±21,8
Тромбоциты, 1012/л 1 518,5±38,4 507,7±86,51
2 504,5±145,2 533±4,04
3 501,5±89,2 479,7±49,8
4 566±152,7 591,7±226,9
1 МСН - среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, пг
диоксида кремния активируются, усиливаются метаболические процессы, протекающие в клетке, с последующей активацией функциональной активности с истощением бактерицидных потенциалов. Также была отмечена активация моноцитов, перитониальных макрофагов при воздействии частиц кремния. В результате клетки высвобождали большое количество ИЛ-1 и подвергались апоптозу.
В отношении исследуемых наночастиц известны лишь единичные работы о влиянии наночастиц железа и меди на белые клетки крови
[8], [9]. Так, согласно литературным данным, внутривенное введение наночастиц железа в концентрации 20 мг/кг не вызывает гибели лейкоцитов, но приводят к изменению функциональных свойств цитоплазмы с увеличением ее проницаемости, а энтеральное введение наночастиц меди в концентрации 1,7 мг/кг корма приводит к увеличению числа лейкоцитов на 39,63% (р<0,001). Необходимо отметить, что хотя подобные изменения в активности клеток, как для наночастиц оксида кремния, и не описаны для исследуемых наночастиц в литературных данных, исследования по апоптозу для некоторых из них встречаются. Так, в работе Сизовой Е.А. с соавтор. [10] описано увеличение
показателя готовности клеток к апоптозу для наночастиц меди.
Помимо изменений в содержании лейкоцитов также наблюдались следующие изменения в крови животных: увеличение содержания эритроцитов, концентрации гемоглобина, среднего содержания гемоглобина в 1 эритроците и снижение уровня тромбоцитов.
В отношении содержания эритроцитов, концентрации гемоглобина и среднего содержания гемоглобина в 1 эритроците можно отметить, что полученные данные хорошо согласуются с другими литературными источниками о влиянии наночастиц на данные показатели
[9], [11]. Так, в работе Скоркиной М.Ю. с соавтор. отмечаются достоверные увеличения концентрации гемоглобина на 58, 4% и его среднего содержания в эритроците при введение железооксидных наночастиц.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что внутримышечное введение наночастиц меди, железа и Fe-Co приводи к неоднозначной реакции живого организма и позволяет выделить ряд особенностей наночастиц в отношении него: увеличение числа лейкоцитов, эритроцитов, концентрации гемоглобина и его среднее содержание в эритроците.
12.10.2013
Список литературы:
1. Беденко А. Органические микроэлементы в современном животноводстве // Комбикорма - 2008. - №6. - С. 87-91.
2. Андрианова Е., Гуменюк А, Воронин Д., Голубов И. Минеральный премикс на основе L-аспаргинотов микроэлементов // Птицеводство. - 2011. -№3. - С. 16-19.
3. Шацких Е.В. Продуктивность цыплят-бройлеров при использовании в предстартовом рационе органических форм микроэлементов // Аграрный вестник Урала. - 2008. -№11(53). - С. 83-84.
4. Никонов И.Н., Фолманис Ю.Г., Фолманис Г.Э., Коваленко Л.В., Лаптев Г.Ю., Егоров И.А., Фисинин В.И., Тананаев И.Г. Наноразмерное железо - кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы // Доклады академии наук. - 2011. -Т. 440. - №4. - С. 565-569.
5. Ген М.Я., Миллер А.В. Авторское свидетельство СССР №814432 // Бюллетень изобретений. - 1981. - №11. - С. 25.
6. Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Кусков М.Л., Стоенко Н.И., Сторожев В.Б. Установка для получения и исследования физико-химических свойств наночастиц металлов // Приборы и техника эксперимента. - 2000. - №6. - С.122-129.
7. Колбин И.А., Колесников О.Л. Изменение показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови доноров после инкубации с наночастицами диоксида кремния // Вестник ЮУрГУ. -2001. - №20. -С. 116-119.
8. Павлов Н.А., Надеждин С.В Реакции лейкоцитов крови крыс на растворимые и нерастворимые формы в опытах in vivo и in vitro // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Естественные науки. -2010. -Т. 21. -№13. -С. 103-106.
9. Вишняков А.И., Ушаков А.С., Лебедев С.В. Особенности костномозгового кроветворения при введении наночастиц меди per os и intramuscularly // Вестник мясного скотоводства - 2011. - Т.2. - №54. - С. 96-102.
10. Сизова Е.А. Минеральный состав и морфофункциональные аспекты реорганизации печени при энтеральном способе введения наночастиц меди типа CU10X // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2010. - №6 (112). -С. 92-94.
11. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А, Деркачев Р.В., Забиняков Н.А. Влияние наночастиц железа на дыхательную функцию крови // Ярославский педагогический университет- 2010. - №2. - С. 101-106.
Сведения об авторах:
Яушева Елена Владимировна, аспирант Всероссийского научно-исследовательский института мясного скотоводства Россельхозакадемии, e-mail: [email protected] Мирошников Сергей Александрович, директор Всероссийского научно-исследовательского института мясного скотоводства Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор,
e-mail: [email protected] Кван Ольга Вилориевна, научный сотрудник института биоэлементологии Оренбургского государственного университета, кандидат биологических наук,
e-mail: [email protected]
UDC 577.11
Yausheva E.V.1, Miroshnikov S.A.1, Kwan O.V.2
1SSI all-Russian research Institute of meat cattle breeding of Russian agricultural Academy; 2Orenburg state university, e-mail: [email protected]
ESTIMATION OF INFLUENCE METAL NANOPARTICLES ON MORPHOLOGICAL PARAMETERS OF PERIPHERAL BLOOD OF ANIMALS
The experiment studied the effect of nanoparticles of Cu, Fe and Fe-Co on morphological parameters of the peripheral blood after a single intramuscular injection. The incorporation liozoley nanoparticles leads to increased levels of leukocytes and increases the number of red blood cells.
Key words: nanoparticles, erythrocytes, leukocytes.
Bibliography:
1. Bedenko A. Some organic microelements used in the modern animal husbandry // Mixed Feed - 2008. - №6. - P. 87-91.
2. Andrianova E., Gumenuk A., Voronin D., Golubov I. Mineral Premix with L-Asparaginates of Microelements // Poultry industry. - 2011. - №3. - P. 16-19.
3. Shatskykh E.V. The productivity of broiler chickens using a prelaunch diet of organic forms of trace elements // Journal of Agricultural Urals. - 2008. - №11 (53). - P. 83-84.
4. Nikonov, I.N., Folmanis J.G., Folmanis G.E., Kovalenko L.V., Laptev, G.U., Egorov I.A., Fisinin V.I., Tananaev I.G. Nano-sized iron - a feed additive for poultry // Reports of the Academy of Sciences. - 2011. - V. 440. - №4. - P. 565-569.
5. Gen M.Ya., Miller A.V. USSR Certificate number 814432 // Bulletin of inventions. - 1981. - №11. - P. 25.
6. Zhigach A.N. Leipunsky I.O., Kuskov M.L., Stoenko N.I. Storozhev V.B. Plant for production and study of physical and chemical properties of metal nanoparticles // Instruments and Experimental Techniques. - 2000. - №6. - P.122-129.
7. Kolbin I.A., Kolesnikov O.L. Changing the parameters of the functional activity of neutrophilic granulocytes of peripheral blood donors after incubation with nanoparticles of silica // Bulletin of YuUrGU. -2001. - №20. - P. 116-119.
8. Pavlov N.A., Nadezhdin S.V. reactions of white blood cells in the rat soluble and nerasvorimye form in experiments in vivo and in vitro // Scientific Statement of the Belgorod State University. Series: Natural Sciences. -2010. - V. 21. - №13. -P. 103-106.
9. Vishnjakov A.I., Ushakov A.S., Lebedev S.V. Features of bone marrow blood when administered per os copper nanoparticles and intramuscularly // Bulletin of beef cattle - 2011. - V. 2. - №54. - P. 96-102.
10. Sizov E.A. The mineral composition and morphological and functional aspects of the reorganization of the liver in enteral route of administration of copper nanoparticles type CU10X // Bulletin of the Orenburg State University. - 2010. - №6 (112). - P. 92-94.
11. Skorkina M.Ju., Fedorova M.Z., Sladkova E.A., Derkachev R.V., Zabinyakov N.A. The effect of the iron nanoparticles on the blood oxygen capacity // Yaroslavl Pedagogical University. - 2010. - №2. - P. 101-106.
