CC BY
66
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского унивырситета им. Н.И. /\обачевского, 2010, N° 2 (2). с. 503
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПАРАМЕТРОВ ПЕРЕКИСНОГО ГОМЕОСТАЗА ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ
© 2010 г. Е.А. Васильева, Ю.В. Синицына, Е.О. Половинкина,
М.И. Цыганкова, А.П. Веселов
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
Поступила в редакцию 02.10.2009
Ионизирующее излучение в малых дозах и низкоинтенсивное переменное магнитное поле вызывают быстрое снижение уровня продуктов перекисного окисления липидов при активации антиокси-дантной системы. Увеличение интенсивности физических факторов приводит к исчерпанию ресурсов защитных систем и нарастанию процессов окисления. Наблюдаемые изменения носят схожий характер, что говорит в пользу их неспецифичности.
Ключевые слова: ионизирующее излучение, переменное магнитное поле, малые дозы, растения, пе-рекисный гомеостаз.
Введение
Человек и биосфера миллионы лет существовали в сравнительно узком диапазоне изменения таких параметров, как естественный радиационный фон Земли, напряженности постоянных электрических и магнитных полей. Однако с развитием цивилизации, открытием и активным использованием энергии атомного распада, искусственных источников постоянных и переменных электрических и магнитных полей интенсивность этих физических факторов среды в биосфере возросла [1]. Причем, если действием больших доз этих факторов интересуются давно, то изучение механизмов воздействия малых доз ионизирующей радиации (ИИ) и низкоинтенсивного магнитного поля началось лишь в середине XX века.
Возникновение эффектов малых доз ИИ связывают с его воздействием на мембраны клетки, в отличие от облучения большими дозами, когда главной мишенью является ДНК [2]. При облучении имеет место образование активных форм кислорода (АФК), приводящее к смещению прооксидантно - антиоксидантного равновесия в сторону перекисного окисления липидов, что является пусковым механизмом окислительного стресса [3], причем в фототрофных тканях его развитие связано, в первую очередь, с хлоропластами [4].
Возможные механизмы влияния слабых переменных и постоянных магнитных полей на биологические процессы широко обсуж-
даются. Показано воздействие комбинированных полей на скорости гравитропической реакции через Са-зависимые ферменты и процесса гидролиза ряда белков и пептидов; переменных магнитных полей частотой 50 Гц на набухание семян через усиление активности эстераз [5, б]. При этом в качестве первичных рецепторов предлагаются липиды, в том числе липиды бислоя мембран. Более тонкие механизмы воздействия магнитных полей мало изучены.
Материалы и методы
Объектом исследования служили двухнедельные растения гороха Pisum sativum L., сорта «Альбумен», выращенные в лабораторных условиях.
В качестве источника ионизирующего излучения использовали у-б0Со-источник, дозы облучения 0.І и і Гр, входящие в интервал малых для растительного организма. Измерения проводили через З0 мин после облучения, контролем служили необлученные растения. Для генерации магнитного поля использовалась магнитотерапевтическая установка УМТИ-ЗФ «Колибри», создававшая вихревое импульсное низкоинтенсивное магнитное поле со значением магнитной индукции З.5 мТл, частотой магнитного поля в соленоиде і00 Гц, максимальной амплитудой силы тока в соленоиде 25 ± З мА. Длительность экспозиции І5, З0, 60 и І20 мин. Контролем служили растения, выдержанные в
а
^ о
к Р
£ о ^ и ср ч §
^ а 5
Ч о 53
о ЄЗ
о й
5Р ^
ё ^
0 (Контроль) 0.1 Доза, Гр 1
Рис. 1. Содержание супероксидного анион-радикала в хлоропластах гороха после облучения
и о
й
ЕД
о Л
к <и к к
03 * . <и о ^ 2 о С и
0 (Контроль) 0.1 Доза, Гр 1
Рис. 2. Содержание продуктов ПОЛ в хлоропластах гороха после облучения
течение экспозиции в условиях нормального геомагнитного поля.
Выделение суспензии хлоропластов проводили методом дифференциального центрифугирования [7]. Для оценки перекисного гомеостаза исследовали содержание супероксидного анион-радикала методом ЭПР с использованием спиновой ловушки тирон [8], определяли содержание диеновых конъюгатов (ДК) [9], малонового диальдегида (МДА) [10], активность ан-тиоксидантных ферментов - супероксиддисму-тазы (СОД) [11], аскорбатпероксидазы (АП) [12], глутатионредуктазы (ГР) [13].
Статистическую обработку результатов (подсчет среднего и ошибки среднего) проводили методом параметрической статистики по Гланцу [14]. Достоверность данных определяли с помощью коэффициента Стьюдента с поправкой Бонферрони.
Результаты и их обсуждение
Влияние малых доз ионизирующего облучения на перекисный гомеостаз хлоропластов гороха. При облучении имеет место образование АФК. Наибольший выход имеют гидроксил-радикал и гидратированный электрон (ОН и егидр). Обла-
дая высокой реакционной способностью, они взаимодействуют с молекулярным кислородом и макромолекулами, при этом образуются более долгоживущие АФК: О2 и Н2О2, способные к миграции через мембраны и инициирующие цепные процессы перекисного окисления [3].
Согласно полученным данным, после воздействия ИИ продукция супероксидного анион-радикала возросла в 1.5 раза (доза 0.1 Гр) и в 2.3 раза (доза 1 Гр) (рис. 1).
Накопление АФК вызывает в липидах пере-кисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, образование свободного радикала приводит к делокализации двойной связи, в результате которой в гидроперекисях жирных кислот появляется система сопряженных двойных связей (диеновая конъюгация), одним из конечных продуктов подобного окисления является малоновый диальдегид [3].
После облучения в дозе 0.1 Гр содержание диеновых конъюгатов снижалось, а при дозе 1 Гр достоверно увеличивалось на 24%. Содержание МДА после облучения в дозе 0.1 Гр достоверно не отличалось от контроля, в дозе 1 Гр увеличилось примерно на 20% (рис. 2).
Частью «первой линии» защиты клетки от АФК, включающейся на самых ранних этапах
0 (Контроль) 0.1 Доза, Гр 1
Рис. 3. Активность СОД в хлоропластах гороха после облучения
К Р
и п ^ § о
ь
т
О
о н
са к
Й ю < & И о
а
Рис. 4. Активность ферментов аскорбат-глутатионового цикла в хлоропластах гороха после облучения
окислительного стресса, является СОД, обезвреживающая супероксидный анион-радикал.
При дозе облучения 0.1 Гр активность СОД возрастала в 2 раза, а при 1 Гр несколько снижалась, но оставалась высокой, составляя 155% от контроля (рис. 3).
Результатом работы СОД является генерация пероксида водорода, который в клетке восстанавливается каталазой. Однако каталаза отсутствует в хлоропластах и ее функцию выполняет аскорбат-глутатионовый цикл, с участием низкомолекулярных антиоксидантов - глутатиона и аскорбиновой кислоты, а также ферментов, среди которых ключевыми являются аскорбат-пероксидаза и глутатионредуктаза [15].
После облучения активность аскорбатперок-сидазы в обеих облученных пробах составляла около 70% от контроля. Активность глутатион-редуктазы уменьшалась на 18% в пробе, соответствующей дозе облучения 0.1 Гр и увеличивалась на 35% от контроля после облучения дозой 1 Гр (рис. 4).
Увеличение генерации супероксида при активной работе СОД и снижение активности ферментов аскорбат-глутатионового цикла -главных утилизаторов Н2О2 в хлоропластах -
должны были приводить к образованию пероксида водорода и его накоплению в строме хло-ропластов. Снижение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) после облучения растений в дозе 0.1 Гр говорит о том, что главную защитную роль берут на себя другие компоненты антиоксидантной системы, например низкомолекулярные антиоксиданты - аскорбат и глутатион, что было показано ранее нашей группой [16].
Низкомолекулярные антиоксиданты - исчерпывающийся при отсутствии работы регенерирующих систем компонент антиоксидантной защиты. Резкое увеличение генерации супероксида в дозе 1 Гр при снижении активности ас-корбатпероксидазы и переходе аскорбата и глу-татиона в окисленную форму должно было вызвать увеличение концентрации пероксида водорода. Следствием этого могло стать ингибирование чувствительных к Н2О2 изоформ СОД хлоропластов, а также изменение активности этого фермента на пероксидазную, усиливающую генерацию супероксида [17]. Все эти процессы, по-видимому, и привели к росту процессов перекисного окисления липидов в условиях наших экспериментов.
о
к
о
«
о
л
о
с
и
40
35
30
25
20
15
10
2,5
1,5
0,5
х
^ I Я «
и со
_о сЗ Н & О И
о о Я ю « и 5 2§ н
* 5 ї? 5
15 30 60
Время, мин
-супероксид - - СОД
120
Рис. 5. Активность СОД в хлоропластах гороха после воздействия магнитным полем
Механизм ингибирования аскорбатперокси-дазы и глутатионредуктазы может быть двояким, так как эти ферменты являются NADРH-зависимыми, а для работы цикла необходимы восстановленные формы глутатиона и аскорбиновой кислоты. С одной стороны, увеличение генерации супероксида говорит о действии ИИ на АФК-продуцирующие компоненты элек-трон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов, что может вызывать сбои в ее работе и, как следствие, недостаток восстановительных эквивалентов в строме хлоропластов. С другой стороны, увеличение продукции пероксида водорода в строме хлоропластов вызывает переход аскорбата и глутатиона в окисленную форму.
Л.Х. Эйдус [18] высказывает мнение, что эффекты малых доз обусловливаются нарушением функций мембран, а следовательно, и изменением содержания низкомолекулярных соединений в клетке, однако при слабых воздействиях репарация мембран предупреждает возникновение эффектов малых доз, которые проявляются с ростом дозы или ее мощности, когда нарастание повреждений мембран превышает скорость их репарации. С этой точки зрения активация глутатионредуктазы после действия дозы 1 Гр могла быть проявлением стимулирующего эффекта малых доз в условиях увеличения липопероксидации, что может говорить о включении механизмов регенерации «первой линии» антиоксидантной защиты и начале развития адаптивного ответа.
Влияние низкочастотного магнитного поля на перекисный гомеостаз хлоропластов гороха. Ряд органических реакций, при которых происходит перенос электрона через образование про-
межуточного соединения, содержащего радикальную пару, весьма чувствительны к воздействию магнитных полей. Результатом воздействия магнитного поля на растения могло стать усиление генерации АФК (в первую очередь синглет-ного кислорода и супероксидного анион-радикала) в мембранах хлоропластов. Учитывая, что при радиационном облучении также имеет место образование активных форм кислорода, можно предположить схожесть механизмов реализации ответа живых систем на воздействие ионизирующего излучения и магнитного поля.
Под действием магнитного поля уже после 15-минутной экспозиции наблюдалось резкое увеличение содержания супероксидного анион-радикала относительно контрольного уровня, после 30-минутной экспозиции содержание супероксида было ниже контрольного, более длительная обработка приводила к нормализации данного показателя (рис. 5).
Активность СОД на 15-й минуте возрастала почти в 2 раза относительно контроля; на 40% была ниже контроля после 30 минут экспозиции, почти равной контрольной после 60 и 120 мин воздействия (рис. 5).
Активность ферментов аскорбат-глутатио-нового цикла - аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы - оставалась практически на уровне контроля.
Слабое переменное магнитное поле модифицировало перекисное окисление липидов, а именно содержание продуктов ПОЛ (МДА и ДК) было минимальным после 60-минутной экспозиции и составило 63.7 и 38.2% соответственно. К 120-минутной экспозиции эти показатели возрастали, но так и не достигли контрольного уровня (рис. 6).
3
2
1
5
0
0
0
Время, мин
Рис. 6. Содержание продуктов ПОЛ в хлоропластах гороха после обработки магнитным полем
СОД - субстрат-индуцибельный фермент, поэтому его быстрая активация после 15-минутного воздействия может быть связана с увеличением генерации супероксида, что при дальнейшем снижении содержания супероксид-ного анион-радикала и неизменной работе ферментов аскорбат-глутатионового цикла могло приводить к накоплению пероксида водорода и ингибированию СОД после 30-минутной экспозиции. Функцию защиты клетки от окислительных повреждений, видимо, принимали на себя низкомолекулярные антиоксиданты - аскорбат и глутатион, для которых ранее [19] был показан переход в окисленную форму в ответ на действие магнитного поля. Активная работа первой линии антиоксидантной защиты - СОД и низкомолекулярных антиоксидантов - подтверждается уменьшением содержания продуктов ПОЛ ниже контрольного уровня с увеличением времени экспозиции.
Выводы
Обнаруженные нами изменения в системе перекисного гомеостаза в ответ на действие ионизирующей радиации в малых дозах и низкочастотного переменного магнитного поля носили схожий характер, а именно: наблюдалось быстрое подавление процесса ПОЛ, выражавшееся в снижении уровня его продуктов - ДК и МДА - при включении компонентов раннего ответа антиоксидантной системы хлоропластов - СОД и низкомолекулярных антиоксидантов, предупреждавших дальнейшие развитие процессов окисления. Однако нарастание интенсивности воздействия обоих
физических факторов вызывало угнетение работы антиоксидантной системы, что приводило к нарастанию процесса ПОЛ и увеличению содержания ДК и МДА. Результаты могут свидетельствовать в пользу неспецифического характера подобных изменений, являющихся одним из пусковых звеньев развития защитных реакций растений в ответ на действие неблагоприятных факторов.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке „ранта РГНФ № 09-06-95679 и/Мл.
Список литературы
1. Петин В.Г. Биофизика неионизирующих физических факторов окружающей среды. Обнинск: МРНЦ РАМН, 2006. 265 с.
2. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижи-на Г.П., Конрадов А.А. Новые аспекты закономерностей действия низкоинтенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 1. С. 26-33.
3. Мерзляк М.Н. Итоги науки и техники. Физиология растений. Т. 6: Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. М.: ВИНИТИ, 1989. 168 с.
4. Барабой В.А., Олейник С.А. Стресс в развитии радиационного поражения. Роль регуляторных механизмов // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 4. С. 438-443.
5. Аксенов С.Н., Грунина Т.Ю., Горячев С.Н. Особенности влияния низкочастотного магнитного поля на набухание семян пшеницы на разных стадиях // Биофизика. 2001. Т. 46. Вып. 6. С. 1127-1132.
6. Белова Н.Л., Леднев В.В. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропизм растений // Биофизика. 2001. Т. 46. Вып. 1. С. 122-125.
7. Amon D.L., Allen M.V., Whatly Z.B. Photo-syntesis by isolated chloroplasts. Genetic concept and companison of free photochemical reaction // Bio-chimica et Biophysica Acta. 1956. V. 20. P. 449-461.
8. Минибаева Ф.Б., Гордон Л.Х. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 3. С. 459-464.
9. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической диагностике. Минск: Беларусь, 2000. 896 с.
10. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тио-барбитуровой кислоты // В сб.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 66-68.
11. Чевари С., Чаба И., Секей И. Роль суперок-сиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лабораторное дело. 1985. Вып. 11. С. 578-681.
12. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chlo-roplasts // Plant Cell Physiol. 1981. V. 22. Р. 867-880.
13. Iavata J., Tanaka U. Glutathionreductases «positive» spectro-photometre assayes // Colled. Cresh. Chem. Commun. 1977. V. 42. № 3. P. 1086-1089.
14. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
15. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons // Annual Reviews Plant Physiology Plant Molecular Biology. 1999. V. 50. P. 601-639.
16. Polovinkina E., Kurganova L., Sinitsina J., Veselov A., Chernisheva M., Sinelschikov A. Effects of low dose irradiation on prooxidant-antioxidant balance in Pisum sativum chloroplasts // Abstracts of the 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology «European Radiation Research- 2006» Kyiv. 2006. P. 220.
17. Casano L.H., Martin M., Sabater B. Sensitivity of superoxide dismutase transcript levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves // Plant Physiol. 1994. V. 106. № 3. P. 1063-1069.
18. Эйдус Л.Х. Мембранный механизм биологического действия малых доз. Новый взгляд на проблему. М.: ИТЭБ РАН, 2001. 82 с.
19. Половинкина Е.О., Васильева Е.А. Модуляция перекисного гомеостаза мембран хлоропластов гороха переменным магнитным полем // Матер. Междун. конф. по фундаментальным наукам среди аспирантов и студентов «Ломоносов-2007». Москва, МГУ, 2007. С. 271.
CHANGES IN SOME PEROXIDE HOMEOSTASIS PARAMETERS OF PEA CHLOROPLASTS IN RESPONSE TO THE ACTION OF LOW-INTENSITY PHYSICAL FACTORS
E.A. Vasil eva, Yu. V. Sinitsyna, E.O. Polovinkina, M.I. Tsiplakova, A.P. Veselov
Low-dose ionizing radiation and low-intensity alternating magnetic field caused a dramatic decrease in lipid peroxidation product levels during antioxidant system activation. An increase in the intensity of physical factors led to the depletion of protective systems’ resources and to a rise in oxidation processes. Similarity in the changes observed favours their nonspecific character.
Keywords: ionizing radiation, alternating magnetic field, low doses, plants, peroxide homeostasis.
