CC BY
20
Изменение ингибирующей множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток активности олигомицинов в комплексах с литием и цинком
М. В. БИБИКОВА', А. Н. ДАНИЛЕНКО2, А. В. КАТЛИНСКИЙ3, А. Ф. КОРЫСТОВА4, Л. Н. КУБЛИК4, М. Х. ЛЕВИТМАН4, В. В. ШАПОШНИКОВА4, Ю. Н. КОРЫСТОВ4
' ВИОРИН, Москва
2 Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля, РАН, Москва
3 Форт, Москва
4 ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Московская обл., Пущино
Change of Tumor Cell Multiple Drug Resistance Inhibitory Activity of Oligomycins in Complexes with Lithium and Zinc
M. V. BIBIKOVA, A. N. DANILENKO, A. V. KATLINSKY, A. F. KORYSTOVA, L. N. KUBLIK, M. KH. LEVITMAN, V. V. SHAPOSHNIKOVA, YU. N. KORYSTOV
Viorin, Moscow
Emmanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Science, Moscow Fort, Moscow
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Science, Pushchino, Moscow Region
Показано, что олигомицины и их комплексы с литием и цинком менее активны, чем циклоспорин А в отношении ингиби-рования транспортных белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР, но некоторые комплексы олигомицинов в десятки и сотни раз активнее циклоспорина А по ингибированию транспортных белков в другом типе опухолевых клеток — рака гортани человека Hep-2, что открывает возможность применения комплексов олигомицинов с литием и цинком для подавления множественной лекарственной устойчивости некоторых типов опухолей.
Ключевые слова: множественная лекарственная устойчивость, олигомицины А, В, С, SC-II, комплексы с литием и цинком.
Oligomycins and their complexes with lithium and zinc were shown to be less active vs. cyclosporin A in inhibition of transport proteins responsible for multiple drug resistance of lymphoid leukosis P388VR cells, while certain oligomycin complexes were tens or hundreds times more active than cyclosporin A by inhibition of transport proteins in another type of tumor cells, i.e. human larynx cancer Hep-2, that makes possible the use of the oligomycins complexes with lithium and zinc for inhibition of multiple drug resistance of certain tumor types.
Key words: multiple drug resistance, oligomycins A, B, C, SC-II, complexes with lithium and zinc.
Введение
Возникновение лекарственной устойчивости бактерий при инфекционных заболеваниях и опухолевых клеток у онкологических больных является серьёзной проблемой, осложняющей, а порой и не позволяющей проведение необходимой терапии пациентам. Одним из основных факторов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) является наличие в плазматической мембране транспортных белков, использующих энергию АТФ для откачки из клеток различных соединений против градиента кон© Коллектив авторов, 2015
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул, д. 3а. Виорин
центраций [1, 2]. Этот процесс существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии заболеваний, и ставит остро вопрос о необходимости поиска эффективных ингибиторов МЛУ. Ранее было показано [3], что олигоми-цины ингибируют откачку из опухолевых клеток субстратов транспортных белков. На клетках рака гортани человека Нер-2 олигомицин 8С-11 оказался намного эффективнее широко используемого ингибитора МЛУ циклоспорина А. Известно, что олигомицины образуют комплексы с литием и цинком, что меняет их гидрофобность [4] и, следовательно, может повлиять на их взаимодействие с мембранами и транспортными белками. В настоящей работе проведено исследование влияния олигомицинов и их комплексов с
литием и цинком на откачку субстратов транспортных белков из двух типов опухолевых клеток.
Материал и методы
Клетки P3SS выращивали в брюшной полости мышей DBA2. Pезиcтентные к винкристину клетки P3SS получали, выращивая их в мышах-самцах ÄBA2 при воздействии 1 мкг/г винкристина («Gedeon Richter», Bенгpия). Подробности получения устойчивого к винкристину штамма P3SSBP описаны в работе [5]. Клетки P3SSBP выделяли из брюшной полости мышей DBA2 через 7 суток после прививки и отмывали в растворе Хэнкса. Из литературы известно, что при селекции клеток P3SS на устойчивость к винкристину, получается штамм устойчивый за счёт сверхэкспрессии P-гликопротеина [б].
Олигомицины A, B, С и SC-II были получены и очищены в ООО «Bиopин», а их комплексы с литием и цинком синтезированы в Институте биохимической физики им. H. M. Эммануэля.
Для изучения действия олигомицинов на MЛУ клеток P3SSBP определяли скорость откачки из клеток двух субстратов транспортных белков: ацетоксиметилового эфира каль-цеина — кальцеина AM (Molecular Probes, США) и родамина 123 — R123 (ICN, СШA). Транспорт из клеток кальцеина AM определяли по методике [7]. Не флуоресцирующий ацетокси-метиловый эфир кальцеина (кальцеин AM) входит в клетки по градиенту концентрации, где под действием внутриклеточных эстераз превращается во флуоресцирующий кальцеин. Эфир кальцеина откачивается из клеток транспортными белками: P-glycoprotein (P-gp) и multidrug resistance associated protein (MRP), ответственными за ЖГУ. Соответственно скорость образования кальцеина тем меньше, чем выше в клетках количество P-gp и MRP. Скорость образования кальцеина в клетках, регистрируемая по увеличению его флуоресценции в кювете, зависит также от концентрации кальцеина AM и концентрации клеток [S], поэтому сама по себе не может характеризовать ни MЛУ, ни эффект ингибиторов. Количественно эффект ингибитора характеризуется коэффициентом увеличения скорости образования кальцеина при действии разных концентраций ингибитора. Pазные ингибиторы сравниваются по максимальному коэффициенту подавления скорости и по концентрации, при которой коэффициент равен половине максимального.
Определение скорости образования кальцеина проводили следующим образом. B кювету помещали 3 мл раствора Хэнкса (З7°С) с добавлением 0,5% эмбриональной сыворотки, затем 500 тыс. клеток и определяли базовый уровень флуоресценции. Кинетику образования кальцеина в клетках регистрировали после добавления к клеткам 100 нм кальцеина AM при постоянном перемешивании на спектрофотометре Perkin-Elmer MF44, длины волн эмиссии и поглощения 493 и 515 нм соответственно. После записи кинетики образования кальцеина в контроле в кювету добавляли олигомицины в разной концентрации и измеряли изменение кинетики образования кальцеина. Коэффициент ингибирования MЛУ (К) определялся отношением скоростей в присутствии ингибитора и без него. B каждом опыте определялся максимальный К по эффекту на скорость образования кальцеина известного ингибитора MЛУ циклоспорина A (Sigma, СШA), при концентрации 1 мкг/мл (0,8 мкM), полностью подавляющей активный транспорт из клеток кальцеина AM.
Транспорт родамина 123 из клеток рака гортани человека — Hep-2 определяли по методике, разработанной экспериментально и обоснованной теоретически в работе [9]. Mетoд применим только для клеток, прикрепляющихся к субстрату. Было показано, что отношение скоростей выхода R123 из клеток в норме и при полном подавлении активного транспорта минус единицу: (R-1)max равно отношению активного и пассивного транспорта и, следовательно, характеризует активность в клетках белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость. Клетки Hep-2 высевали в количестве 1—1.5 млн.
Рис. 1. Подавление олигомицином C и комплексами олигомицина C с литием и цинком (а), олигомицином A и комплексами олигомицина A с литием и цинком (б), олигомицином B и комплексами олигомицина B с литием и цинком (в) транспорта кальцеина АМ из клеток Р388ВР.
Здесь и на рис. 2: по оси ординат - коэффициент ингибирования транпорта кальцеина АМ.
в среде DMEM (Sigma, США) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США) с гентамицином на стеклянные пластинки (50x9x2 мм), помещённые в чашки Петри (ICN, США) диаметром 6 см, объём среды 8 мл. Инкубировали в СО2 инкубаторе. Через сутки инкубации в СО2 инкубаторе при 37°С клетки отмывали в среде RPMI1640 (Sigma, США) и нагружали их R123, при концентрации 0,5 мкг/мл в присутствии ингибитора транспортных белков циклоспорина А, 3 мкг/мл (2,4 мкМ) в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки в течение 60 мин, при 37°C. После инкубации клетки трижды (по
10 мин) отмывали от красителя и циклоспорина А холодным (2°С) физиологическим раствором с 1% эмбриональной сывороткой. После отмывания и до момента измерения пластинки с клетками хранили в растворе Хэнкса с 0,5% сыворотки на льду. Отмытую пластинку с клетками помещали в кювету спектрофотометра MF44 Perkin-Elmer с раствором Хэнкса и 0,5% эмбриональной сывороткой, объём 3 мл при 37° и определяли увеличение количества R123 в среде при постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и эмиссии 488 и 520 нм соответственно. В конце эксперимента для определения максимального количества R123 в клетках, клетки разрушали добавлением в кювету 0,02% дигитонина (Sigma, США). Матричные растворы комплексов олигомицинов с литием и цинком были приготовлены в этаноле с концентрацией 1 мг/мл.
Опыты выполняли в трёх и более повторностях и определяли квадратичную ошибку среднего значения, которая указана на рисунках.
Результаты и обсуждение
1. Влияние олигомицинов и их комплексов с литием и цинком на транспорт из клеток Р388ВР кальцеина AM. Все полученные данные по влиянию олигомицинов и их комплексов на транспорт из использованных в данной работе клеток кальцеина АМ нормированы к эффекту циклоспорина А, 1 мкг/мл, значение коэффициента ин-гибирования транспорта, К=16,4. Это значение было принято за максимальный коэффициент ингибирования и IC50 олигомицинов и их комплексов определялось как концентрации, при которых К равно среднему между максимальным (16,4) и минимальным (1,0).
На рис. 1, 2 приведены концентрационные зависимости ингибирования транспорта кальцеина АМ из клеток олигомицинами и их комплексами с литием и цинком, а в табл. 1 значения IC50 и отношения IC50 олигомицинов к IC50 их комплексов. Из приведённых данных видно, что в эффективность некоторых олигомицинов в комплексах [A(Zn), C(Li), C(Zn), ScII(Li)] незначительно увеличивается, максимум в 1,5 раза. Во всех остальных комплексах эффективность олигомицинов существенно снижается: от 3 до 6 раз. Величина
Рис. 2. Подавление олигомицином F и комплексами олигомицина F с литием и цинком (а), олигомицином ScII и комплексами олигомицина ScII с литием и цинком (б) транспорта кальцеина АМ из клеток Р388ВР.
1С50 циклоспорина А по ингибированию транспорта кальцеина АМ из клеток Р388ВР равна 16 нМ, то есть он эффективнее самого активного олигомицина Б более чем в 4 раза, а других олиго-
Таблица 1. Влияние лития и цинка на эффективность олигомицинов по ингибированию транспорта кальцеина
АМ из клеток Р388ВР
Олигомицин IC50, нМ IC5o/IC5o(Li) или IC5o(Zn)
А 315 1
А(П) 315 1
A(Zn) 220 1.4
B 120 1
B(Li) 400 0.3
B(Zn) 730 0.16
C 1060 1
C(Li) 725 1.5
C(Zn) 870 1.2
ScII 350 1
ScII(Li) 225 1.6
ScII(Zn) 610 0.36
F 70 1
F(Li) 220 0.32
F(Zn) 400 0.18
Рис. 3. Подавление олигомицином А и комплексами олигомицина А с литием и цинком (а), олигомицином В и комплексами олигомицина В с литием и цинком (б), олигомицином С и комплексами олигомици-нов С(Ы), С^п) и БсМ^п) (в) транспорта родамина 123 из клеток Нер-2.
Здесь и на рис. 4: по оси ординат - снижение эффекта ингибирования транспорта родамина 123 из клеток.
мицинов и их комплексов в 10 и более раз. Известно, что транспорт из клеток Р388ВР кальцеина АМ осуществляется Р-гликопротеином [6], и из полученных данных следует, что олигомицины и их комплексы с литием и цинком малоперспективны как ингибиторы Р-гликопротеина.
Рис. 4. Подавление олигомицином F и комплексами олигомицина F с литием и цинком (а), олигомицином БсП и комплексами олигомицина БсП с литием и цинком (б) транспорта родамина 123 из клеток Нер-2.
2. Влияние олигомицинов и их комплексов с литием и цинком на транспорт из клеток Нер-2 родамина 123. На рис. 3, 4 представлены данные по ингибированию транспорта родамина 123 олиго-мицинами и их комплексами с литием и цинком. На рисунках видно, что все олигомицины и их комплексы с литием и цинком ингибируют транспорт родамина 123. Большинство концентрационных зависимостей характеризуется монотонным возрастанием эффекта с увеличением концентраций. Однако для некоторых зависимостей комплексов отмечается снижение эффекта с увеличением концентрации. Так, для комплексов олигомицинов А, В и Б с цинком эффект ингиби-рования возрастает до концентрации 100 нМ, но снижается при больших концентраций (рис. 3, а, б, рис. 4, а). Аналогичная зависимость эффекта от концентрации наблюдается также для комплексов олигомицинов С и 8с11 с литием (рис. 3, в, рис. 4, б): для комплекса олигомицина С с литием при концентрациях больше 300 нМ, а для комплекса олигомицина 8с11 с литием при очень малых концентрациях: больше 0,03 нМ. Снижение
Таблица 2. Влияние лития и цинка на эффективность олигомицинов по ингибированию транспорта родамина
123 из клеток Нер-2
Олигомицин IC50, нМ IC5o/IC5o(Li) или IC5o(Zn)
А 1000 1
A(Li) 40 25
A(Zn) 100 10
B 1,9 1
B(Li) 44 0,043
B(Zn) 100 0,019
C 300 1
C(Li) 300 1
C(Zn) 300 1
ScII 0,7 1
ScII(Li) 0,015 47
ScII(Zn) 105 0,0067
F 80 1
F(Li) 200 0,4
F(Zn) 43 1,9
эффекта ингибирования транспорта родамина 123 из клеток (R) обусловлено, по-видимому, повреждением данными комплексами плазматической мембраны и пассивным выгходом родамина 123 через образовавшиеся поры. Соответственно суммарная скорость выхода родамина 123 из клеток в присутствии ингибитора возрастает за счёт увеличения его пассивного выхода.
Концентрации комплексов олигомицинов, при которых активный транспорт родамина 123 (IC50) снижается вдвое, равны концентрациям, при которых R=1,95. Это среднее значение R между максимальным R=2,9 (олигомицин B(Li), 1 мкМ) и минимальным R=1. Значения IC50 для олигомицинов и их комплексов приведены в табл. 2. Эти данные показывают, что в комплексе олигомицинов с литием и цинком их ингиби-рующая активность транспорта родамина 123 может как увеличиваться, так и уменьшаться в зависимости от типа олигомицина. Так, активность олигомицина A (IC50=1000 нМ) увеличивается в комплексе с цинком (IC50=100 нМ) и ещё в большей степени в комплексе с литием (IC50=40 нМ). Активность олигомицина F (IC50=80 нМ) увеличивается в комплексе с цинком (IC50=43 нМ), но снижается в комплексе с литием (IC50=200 нМ). И, наконец, активность олигомицина В (IC50=1,9 нМ) существенно снижается в комплексе с обоими металлами: до IC50=44 нМ в комплексе с литием и до IC50=100 нМ в комплексе с цинком. Наиболее отличаются по эффекту на ингибирующую активность лития и цинка олигомицины С и ScII. Активность
ЛИТЕРАТУРА
1. Ставровская А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевый клеток. Биохимия 2000; 65: 1: 112— 126. / Stavrovskaja A.A. Kletochnye mehanizmy mnozhestvennoj lekarstvennoj ustojchivosti opuholevyh kletok. Biohimija 2000; 65: 1: 112— 126. [in Russian]
2. Van derBliekA.M., BorstP. Multidrug resistance. Adv Cancer Res 1989; 52: 165—203.
олигомицина С не меняется в комплексе с обоими лигандами, а активность олигомицина ScII в комплексах изменяется в тысячи раз: IC50 самого олигомицина ScII равно 0,7 нМ, в комплексе с литием — 0,015 нМ, а в комплексе с цинком — 105 нМ (табл. 2).
Олигомицины А, С, комплексы олигомицина С и комплекс олигомицина F с литием менее эффективны по сравнению с традиционным ингибитором МЛУ циклоспорином А, IC50 которого равно 150 нМ. Все остальные олигомицины и их комплексы эффективнее циклоспорина А, причём олигомицин B в 80 раз, олигомицин ScII в 200 раз, а наиболее активный комплекс олигомицина ScII с литием — в 10000 раз.
Ранее было показано, что специфичность действия олигомицинов на МЛУ обусловлена особенностями опухолевых клеток, а не субстратов транспортных белков [3], поэтому полученные результаты свидетельствуют о том, что оли-гомицины и их комплексы менее активны, чем циклоспорин А в отношении ингибирования транспортных белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР, но некоторые комплексы олигомицинов в десятки и сотни раз активнее циклоспорина А по ингибированию транспортных белков в другом типе опухолевых клеток — рака гортани человека, Hep-2. Таким образом, открывается возможность применения комплексов олигомицинов с литием и цинком для эффективного подавления множественной лекарственной устойчивости некоторых типов опухолей.
3. Бибикова М. В., Грамматикова Н. Э., Корыстова А. Ф, Кублик Л. Н, Левитман М.Х.,Шапошникова В. В., Долгих Н. В., Корыстов Ю. Н, Катлинский А. В. Олигомицины подавляют множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Биол мембраны 2015; 32: 2. / Bibikova M. V., Grammatikova N. Je., Korystova A. F., Kublik L. N, Levitman M.H,Shaposhnikova V. V., Dolgih N. V., Korystov Ju. N, Katlinskij A. V. Oligomiciny podavljajut mnozhestvennuju lekarstvennuju ustojchivost' opuholevyh kletok. Biol membrany 2015; 32: 2. [in Russian]
4. Gierczyk B, Schroed G, Przybylski P., Brzezinski B, Bartl F., Zundel G. ESI MS, NMR and PM5 semiempirical studies of oligomycin A and its
complexes with Li+ and Na+ cations. J Mol structur 2005; 738: 1—3: 261-270.
5. Бибикова М. В., Грамматикова Н. Э, Катлинский А В., Корыстова А. Ф, Кублик Л. Н, Левитман М. X., Шапошникова В. В., Корыстов Ю. Н. Олигомицины ScII и В подавляют пролиферацию и вызывают гибель клеток лимфолейкоза P388 и штамма, устойчивого к винкристину. Биол мембраны 2015; 32: 2: 135—140. / Bibikova M. V., Grammatikova N. Je, Katlinskij A. V., Korystova A. F, Kublik L. N, Levitman M. H, Shaposhnikova V. V., Korystov Ju. N. Oligomiciny ScII i V podavljajut prolif-eraciju i vyzyvajut gibel' kletok limfolejkoza P388 i shtamma, ustojchivogo k vinkristinu. Biol membrany 2015; 32: 2: 135—140. [in Russian]
6. Nagayama J., lino M, Tada Y, Kusaba H, Kiue A., Ohshima K, Kuwano M, Wada M.Retrovirus insertion and transcriptional activation of the mul-tidrug resistance gene in leukemias treated by a chemotherapeutic agent in vivo. Blood 2001; 97: 3: 759—766.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Бибикова Маргарита Васильевна — д.б.н., генеральный директор ООО «Виорин», Москва Даниленко А.Н. — старший научный сотрудник, Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля, Москва
Катлинский Антон Викентьевич — профессор, Генеральный директор ООО «Форт», Москва Корыстова Антонина Николаевна — старший научный сотрудник, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва Кублик Людмила Николаевна — к.б.н., старший научный сотрудник, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва
7. Homolya H., Hollo Z, Germann U.A., Pastan I., Gottesman M.M., Sarkadi B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J Biol Chem 1993; 268: 29: 21493-21496.
8. Ермакова H.B., Шапошникова В В., Левитман М.Х., Ким ЮА, Корыстов Ю Н. Изменение множественной лекарственной устойчивости клеток лимфолейкоза Р388, устойчивых к винкристину, при росте асцитной опухоли. Биол мембраны 2004; 21: 2: 102—106. / Ermakova N.V., Shaposhnikova V.V., Levitman M.H., Kim Ju.A, Korystov Ju.N. Izmenenie mnozhestvennoj lekarstvennoj ustojchivosti kletok limfolejkoza R388, ustojchivyh k vinkristinu, pri roste ascitnoj opuholi. Biol membrany 2004; 21: 2: 102—106. [in Russian]
9. Wielinga P.R., Heijn N., WesterhoffH.W, Lankelma J. 1998. A method for studying plasma membrane transport with intact cells using computerized fluorometry. Ann Biochem 1998; 263: 221—231.
Левитман Мария Ханоновна — к.б.н., старший научный сотрудник, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва Шапошникова Вера Владимировна — к.б.н., Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва
Корыстов Юрий Николаевич — д.б.н., главный научный сотрудник, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва
