CC BY
42
УДК 615.739.6:616.61-08
ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И ВЫРАЖЕННОСТИ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В УСЛОВИЯХ ДОКСОРУБИЦИНОВОГО ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК У КРЫС НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ ГЛИЦИНА
О.С. Селиванова, С.М. Напалкова
Ульяновский государственный университет
В работе рассмотрено влияние глицина на функциональные показатели почек крыс в условиях доксорубицинового повреждения, а также на выраженность оксидативного стресса (уровень маркеров и активность антиоксидантных ферментов в почеченом гомогенате). Дана оценка изменений указанных показателей при применении глицина по сравнению с мелатонином.
Ключевые слова: доксорубициновая нефропатия, оксидативный стресс, глицин, мелатонин.
Доксорубицин (адриамицин) является одним из самых востребованных цитостати-ков и используется в химиотерапии гемобла-стозов и солидных злокачественных опухолей [3; 27; 29]. Он оказывает противобла-стомный эффект как в монотерапии, так и в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами. Ценным свойством антибиотика является отсутствие перекрестной резистентности с цитостатическими средствами других групп [3].
Трудно назвать злокачественные новообразования, не входящие в список показаний к применению этого антибиотика [4]. Однако возможности химиотерапии злокачественных опухолей с использованием доксорубицина ограничиваются системными токсическими эффектами препарата в отношении как сердца [4; 9; 17; 23; 27], так и почек [6; 13; 17]. Этот факт обусловливает жесткие ограничения суммарной дозы препарата (до 500 мг/м2) и требует поиска эффективных протекторных средств [7].
Следует отметить, что большинство исследований токсичности доксорубицина было посвящено изучению кардио-, а не нефро-токсичности данного препарата. Хотя еще неизвестно, кардиотоксичность ли предшествует нефротоксичности, или, наоборот, она является следствием поражения почек [17].
Несмотря на широкое применение в клинике, механизм токсического действия ан-трациклиновых антибиотиков в отношении нормальных тканей остается до настоящего времени спорным. Выдвинуто несколько гипотез объяснения антрациклиновой цитотоксичности: 1) свободно-радикальная; 2) нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция и железа; 3) ингибирование ферментов репликации ДНК, 4) образование высокотоксичных метаболитов антрациклинов и др.
Из перечисленных механизмов наименьшее значение для цитостатического действия на опухоль и, наоборот, наибольшее для токсического в отношении нормальных тканей имеет образование свободных радикалов кислорода [27]. Различия в механизмах противоопухолевого и токсического действия антрациклинов создают принципиальные предпосылки для применения патогенетически действующих протекторов без ущерба для противоопухолевого эффекта [4; 28].
Исследования последних лет показали, что перспективным подходом к снижению действия повреждающих факторов, в основе которых лежат процессы образования активных форм кислорода, является поиск веществ-метаболитов, способных индуцировать внутриклеточную защиту путем индукции синтеза или активации антиоксидантных фер-
ментов, к которым относится аминокислота глицин [5; 8; 23].
Благодаря своим антиоксидантным свойствам глицин может рассматриваться как потенциальный протектор при доксорубицино-вых нефропатиях, в основе развития которых лежит активация процессов перекисного окисления липидов.
Цель исследования. Изучение нефропро-текторных свойств глицина на доксорубици-новой модели повреждения почек у крыс.
Материалы и методы. Исследуемым веществом явилась аминокислота глицин (01устиш). В работе глицин использовался в форме таблеток по 100 мг (ФГУП «Мосхим-фармперпараты» им. Н.А. Семашко, г. Москва). При выборе дозы препарата (50 мг/кг внутрибрюшинно) мы опирались на исследования В.П. Такунова [10], который применял глицин из расчета 55 мг/кг у крыс для определения его влияния на вестибулярные рефлексы. М. ^иш8ку с соавторами изучали на крысах протекторные свойства глицина в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно на модели этанолового поражения слизистой оболочки желудка [18]. В этой же дозе (50 мг/кг внутрибрюшинно) препарат применялся у крыс для исследования возможности коррекции кар-
Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводились под общим наркозом (этаминал-натрий из расчета 50 мг/кг внутри-брюшинно). Животные умерщвлялись путем декапитации. При этом производился забор
диотоксических эффектов противоопухолевых антибиотиков в работе Г.Т. Брынских [2]. Доза глицина 50 мг/кг составляет 1/60 от LD50.
Для воспроизведения антрациклинового поражения почек применялся доксорубицина гидрохлорид (Doxorubicini hydrochloridum). В работе использовался Доксорубицин-ЛЭНС® в виде лиофизированного порошка во флаконах по 10 мг (ООО «ЛЭНС-ФАРМ», дочерняя компания ЗАО «Верофарм», г. Москва).
В качестве сравнения в исследовании применялся мелатонин (препарат Мелаксен (Melaxen®) в таблетках, покрытых оболочкой, по 3 мг (Unipharm, Inc. New York, USA)). Доза препарата (10 мг/кг) выбиралась с опорой на работу P. Dziegiel и соавт. [15], где исследовалась протекторная активность мелатонина в эксперименте на крысах в дозе 10 мг/кг, вводимого за 30 минут до инъекций доксору-бицина.
Работа выполнена на 42 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах весом 240-290 г, содержащихся в стандартных условиях вивария (12 часовой цикл дня/ночи; t=20-25 °С; влажность - 40-45 %) и имеющих свободный доступ к воде и пище. Животные были разделены на шесть равных групп (табл. 1).
крови путем пункции сердца для исследования концентрации креатинина, мочевины и глутатионпероксидазы. Моча забиралась из мочевого пузыря для определения концентрации общего белка.
Таблица 1
Схема проведения эксперимента
п/п Условия эксперимента Количество животных
1 Интактные животные n=7
2 Контрольные животные (0,5 мл 0,9 % №С1 однократно внутрибрюшинно) n=7
3 Доксорубицин (7,5 мг/кг внутрибрюшинно однократно) n=7
4 Мелатонин (10 мг/кг внутрибрюшинно) за 30 минут до инъекции доксорубицина n=7
5 Глицин (50 мг/кг внутрибрюшинно) за 30 минут до инъекции доксорубицина n=7
6 Глицин (50 мг/кг внутрибрюшинно однократно) n=7
Немедленно после забора биологических жидкостей левая почка удалялась и взвешивалась. В дальнейшем гомогенат почки использовался для изучения показателей пере-кисного окисления липидов и состояния ан-тиоксидантной системы.
Применяемая нами схема введения ан-трациклинового антибиотика для индукции доксорубициновой нефропатии часто применяется и является превосходной моделью нефротического синдрома на животных, подобного нефропатии с минимальными изменениями, с фокальным и сегментарным гло-мерулосклерозом у людей [11; 23; 31]. Док-сорубицин вводился крысам внутрибрюшин-но однократно в дозе 7,5 мг/кг веса животного, вызванные им изменения в почках оценивались на седьмые сутки.
Концентрацию креатинина в сыворотке крови определяли по методу H. Popper [24]. Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли с помощью коммерческого набора фирмы «Ольвекс» (Москва) методом, основанном на реакции с диацетилмоноокси-мом. Активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови определялась по методу R. Beutler [12]. Активность реакции измерялась спектрофотометрически при А=340 нм (спектрометр СФ-46, Россия).
Для приготовления общей цитоплазматической фракции почку растирали в гомогенизаторе Поттера с буфером, содержащим 0,1 М раствор КС1, 1 мМ раствор этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 20 мМ раствор Трис-НС1 (рН=7,0), 1 мМ фенилметил-сульфанил фторида. Далее экстракт центрифугировали при 10000 g, супернатант разливали по пластиковым пробиркам V=0,2 мл и хранили до использования при t= -20 °С. Концентрация малонового диальдегида определялась по методу Л.Б. Андреевой в реакции с тиобарбитуровой кислотой [1]. Содержание белковых карбонильных групп определяли по методике R.L. Levin и соавт. [22]. Концентрацию глутатиона восстановленного определяли в реакции с 5,5’-дитио-бис-нитробен-зойной кислотой (ДНТБ) [16]. Активность глутатионредуктазы определялась спектрофотометрически по методу, предложенному I. Carlberg и соавт. [14]. Активность суперок-
сиддисмутазы определялась в реакции с ксантиноксидазой [20].
Все полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Unistat Statistical Package 5.001. Оценку достоверности различий проводили по «X2» и t-критерию Стьюдента. Статистически достоверными различия между группами признавались при 95 % уровне значимости.
Результаты и обсуждение. Введение изотонического раствора контрольным животным по схеме, аналогичной введению ан-трациклинового антибиотика, а также применение только глицина не привели к достоверным изменениям изучаемых показателей по сравнению с животными интактной группы.
Изучение функциональных показателей почек крыс: однократное введение доксору-бицина привело к повышению концентрации мочевины на 40 % по сравнению с контрольными животными (р<0,001), концентрация составила 26,58±0,37 мг/100 мл сыво-
ротки крови животных, что было предупреждено превентивным применением как мелатонина, так и глицина (19,02±0,48 и 19,25±0,53 мг/100 мл сыворотки крови соответственно; р<0,001 для обеих групп по сравнению с группой животных, получавших только доксорубицин; рис. 1).
У животных, получавших только доксорубицин, концентрация общего белка в моче была в 17 раз выше, чем у контрольных животных (92,82±11,77 и 5,11±1,48 мг/мл мочи соответственно; р<0,001) (рис. 2).
И мелатонин, и глицин уменьшили выраженность протеинурии (20,00±5,15 и 12,41 ±3,16 мг/мл мочи соответственно, р<0,001 для обеих групп по сравнению с животными, получавшими только доксоруби-цин; рис. 2). Под действием глицина она уменьшилась в 8 раз, а мелатонина - лишь в 5 раз. При этом концентрация белка в моче животных мелатониновой группы достоверно различалась по сравнению с контрольными животными (р<0,05).
х о s о m 5“ о с
5 £
п:
s
го
CL
н
X
о
X
о
ш
о
о
I—
о
о
ш
-й
о
ш
30
25
20
15
10
5
0
ЕЕ— ¡¡¡¡и р 1..1..
□ 1
2
3
4
5 Е36
Рис. 1. Влияние исследуемых препаратов на концентрацию мочевины в сыворотке крови животных (доксорубициновая модель): 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - доксорубицин;
4 - мелатонин + доксорубицин; 5 - глицин + доксорубицин; 6 - глицин
Рис. 2. Влияние исследуемых препаратов на концентрацию общего белка в моче у крыс (доксорубициновая модель): 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - доксорубицин; 4 - мелатонин + доксорубицин; 5 - глицин + доксорубицин; 6 - глицин
Известно, что при доксорубициновом поражении почек повреждается преимущественно клубочковая структура, чем и обусловлена выраженная протеинурия [8; 13]. Данные, полученные в ходе гистологического исследования, подтвердили этот факт.
Исследование содержания показателей оксидативного стресса и активности антиок-сидантных ферментов в гомогенате почек крыс: доксорубицин вызвал увеличение со-
держания белковых карбонильных групп в почечном гомогенате крыс на 28 % по сравнению с контрольными животными (р<0,05; табл. 2). Концентрация белковых карбонильных групп в почечной ткани животных, получавших за 30 минут до инъекции антибиотика как мелатонин, так и глицин, достоверно не отличалась от контрольных животных и животных, получавших только доксо-рубицин.
Таблица 2
Влияние исследуемых препаратов на содержание показателей оксидативного стресса в почках животных
Г руппа Карбонильные группы, ммоль/мг белка Малоновый диальдегид, нмоль/мг белка Восстановленный глутатион, мкг/мг белка
1 2,02±0,12 1,92±0,07 2,73±0,05
2 2,06±0,18 1,90±0,05 2,75±0,08
3 2,64±0,16 д ° 2,17±0,06 дд °° 2,34±0,08 дд °°
4 2,16±0,10 1,98±0,05 * 2,60±0,08
5 2,19±0,08 1,93±0,06 * 2,71±0,06 **
6 2,04±0,12 1,88±0,10 2,76±0,09
Примечания: 1. 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - доксорубицин; 4 - мелатонин + доксорубицин; 5 - глицин + доксорубицин; 6 - глицин.
2. Статистически достоверно по сравнению с интактной группой А при р<0,05 и ЛЛ - при р<0,01; с контрольной группой ° - при р<0,05 и °° - при р<0,01; с группой животных, получавших только доксорубицин, * - при р<0,05 и ** - при р<0,01.
На седьмые сутки после введения адри-амицина наблюдалось увеличение концентрации малонового диальдегида в почках крыс на 14 % по сравнению с контрольными животными (р<0,01). Превентивное применение и мелатонина, и глицина до инъекции доксорубицина позволило предупредить повышение концентрации малонового диальдегида в почечном гомогенате (р<0,05 для обеих групп по сравнению с группой животных, получавших только доксорубицин; табл. 2).
Содержание восстановленного глутатио-на в гомогенате почек животных, получавших только доксорубицин, было на 14 % ниже, чем у животных контрольной группы (р<0,01). Глицин, но не мелатонин, предупредил снижение концентрации восстановленного глутатиона, вызванное доксоруби-цином (р<0,01 по сравнению с группой жи-
вотных, получавших только доксорубицин; табл. 2).
Известно, что помимо развития оксида-тивного стресса доксорубицин вызывает снижение активности ферментов антиокси-дантной защиты в ткани почек животных [19; 26; 30]. Мы получили данные, что однократное введение антрациклина привело к снижению активности глутатионпероксидазы в ткани почек животных на 25 % по сравнению с контрольными животными (с 1,93±0,13 до 1,44±0,06 мкмоль/мин/мг белка; р<0,05), под влиянием мелатонина активность даного фермента сохранилась на уровне 1,91±0,05 мкмоль/мин/мг белка (р<0,001 по сравнению с животными, получавшими только доксорубицин), а глицина - на уровне 1,86±0,08 мкмоль/мин/мг белка (р<0,01 по сравнению с животными, получавшими только доксорубицин; рис. 3).
Рис. 3. Влияние исследуемых препаратов на активность глутатионпероксидазы в ткани почек крыс: 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - доксорубицин; 4 - мелатонин + доксорубицин;
6 - глицин + доксорубицин; 7 - глицин
Введение доксорубицина вызвало сни- нию с контрольными животными (с 5,39±0,18
жение активности глутатионредуктазы в по- до 4,29±0,11 нмоль/мин/мг белка; р<0,01).
чечном гомогенате крыс на 20 % по сравне- Предварительное введение как мелатонина,
так и глицина позволило предупредить снижение активности фермента в почечной ткани (5,14±0,08 и 5,32±0,10 нмоль/мин/мг белка
соответственно; р<0,001 для обеих групп по сравнению с группой животных, получавших только доксорубицин; рис. 4).
.о
го
го
Ё _
¡Ї 2 0) с
CL ф
о ,
М
с -? ■- -Ü £ ^ Ь Ü
§1
ш
ГО
6
5
4
3
2
1
0
□ 1
12
13 Е4 ES 5 П6
Рис. 4. Влияние исследуемых препаратов на активность глутатионредуктазы в гомогенате почек животных: 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - доксорубицин; 4 - мелатонин + доксорубицин;
5 - глицин + доксорубицин; 6 - глицин
Наличие у глицина более выраженных нефропротекторных свойств по сравнению с мелатонином было подтверждено тем, что аминокислота предотвратила протеинурию и понижение концентрации восстановленного глутатиона в почках животных, а также благоприятно повлияла на структурные изменения в почках животных, индуцированные доксорубицином.
Выводы. Глицин обладает свойствами нефропротектора в условиях доксорубицино-вого повреждения почек у крыс. Он препятствует развитию доксорубицин-индуцирован-ного оксидативного стресса и ослаблению антиоксидантной защиты в почках, что позволяет устранить вызванную антибиотиком азотемию и уменьшить выраженность проте-инурии у крыс. Протекторная активность глицина не уступает, а по некоторым параметрам даже превосходит эффективность мелатонина в условиях доксорубицинового повреждения почек животных.
1. Андреева, А.И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобар-
битуровой кислотой / А.И. Андреева, Л.А. Кожемякин, А.А. Кишкун // Лабораторное дело. - 1988. - №41. - С. 41-46.
2. Биохимические показатели в диагностике нефротоксичности противоопухолевой химиотерапии у детей / Н.В. Любимова и др. // Вопросы онкологии. - 1997. - Т. 43. - №4. - С. 448-453.
3. Брынских, Г.Т. Экспериментальное исследование возможности коррекции глицином кар-диотоксических эффектов противоопухолевых антибиотиков : дис. ... канд. биол. наук / Г.Т. Брынских. - Купавна, 2005. - 145 с.
4. Булкина, З.П. Противоопухолевые антибиотики : справ. / З.П. Булкина ; под ред. В.Г. Пин-чук ; АН УССР. Институт проблем онкологии им. Р.Е. Кавецкого. - К. : Наукова думка. - 1991. -С. 11-17.
5. Гершанович, М.Л. Кардиоксан: профилактика кардиотоксичности антрациклинов / М.Л. Г ер-шанович // Вопросы онкологии. - 2004. - Т. 50. -№4. - С. 482-491.
6. Непомнящих, Л.М. Регенераторно-пластическая недостаточность сердца: морфологические основы и молекулярные механизмы / Л.М. Непомнящих, Е.Л. Лушникова, Д.Е. Семенов. - М. : Изд-во РАМН, 2003. - 255 с.
7. Ограничение гипероксидации липидов и предупреждение стрессорных повреждений сердца производными глицина / В.В. Малышев и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1996. - Т. 56. - №5. - С. 23-25.
8. Парфенов, В.А. Метаболическая терапия ишемического инсульта / В.А. Парфенов // Русский медицинский журн. - 2002. - Т. 10. - №25. -С. 27-34.
9. Семиглазов, В.Ф. Предупреждение кар-диотоксического действия антрациклинов с помощью кардиоксана / В.Ф. Семиглазов // Вопросы онкологии. - 1997. - Т. 43. - №6. - С. 569-574.
10. Такунов, В.П. Влияние глицина и ГАМК на вестибулярные рефлексы в эксперименте / В.П. Такунов // Фармакология и клиническое применение нейроактивных аминокислот и их аналогов ; под ред. Г.В. Ковалева. - Волгоград, 1985. - С. 80-93.
11. Adriamycin causes hyperlipidemia as a consequence of nephrotoxicity / А. Bizzi et al. // Toxicol. Lett.: 18-29 (1983).
12. Adriamicin-induced nephrotic syndrome in rats: sequence of pathologic events / Т. Bertani et al. // Lab. Invest., 46: 16-23 (1982).
13. Amelioration of doxorubicin-induced cardiac and renal toxicity by pirfenidone in rats / S.N. Giri et al. // Cancer. Chemother. Pharmacol., 53(2): 141-150 (2004).
14. Antioxidants inhibit ethanol-induced gastric injury in the rat. Role of manganese, glycine and carotene / М. Ligumsky et al. // Scand. J. Gastroenterol., 30 (9): 854-860 (1995).
15. Antracyclines: molecular advances and
pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotixicity / G. Minotti et al. // Pharmacol. Rev., 56: 185-229 (2004).
16. Beutler, E. Red cell metabolism / Е. Beutler // Annu. Biochem. Methods: 66-68 (1971).
17. Carlberg, I. Purification and characterization of flavoenzyme glytathione reductase from rat liver / I. Carlberg, В. Mannervik // J. Biol. Chem., 250: 5475-5480 (1975).
18. Determination carbonyl content in oxidatively modified proteins / R.L. Levin et al. // Methods Enzym., 186: 464-478 (1990).
19. Doxorubicin induced apoptosis in normal and tumor cells via distinctly different mechanisms / S. Wang et al. // J. Biol. Chem., 279: 25535-25543
AMELIORATION OF DOXORUBICIN-INDUCED RENAL FUNCTIONAL CHANGES AND OXIDATIVE STRESS BY GLYCINE IN RATS
O.S. Selivanova, S.M. Napalkova
Ulyanovsk State University
(2004).
20. Ellman, G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys., 82: 70-71 (1972).
21. Glycine ameliorates lung reperfusion injury after cold preservation in an ex vivo rat lung model / M. Omasa et al. // Transplantation, 75(5): 591-598 (2003).
22. ICRF-187 (dexrazoxan) protects from adria-micin-induced nephrotic syndrome in rats / T. Zima et al. // Nephrol. Dial. Transplant., 13: 1975-1979 (1998).
23. Low-protein diet prevents glomerular damage in adriamycin-treated rats / G. Remuzzi et al. // Kidney Int., 28: 21-27 (1985).
24. Malarkodi, K.P. Protective effect of lipoic acid on adriamycin induced lipid peroxidation in rat kidney / K.P. Malarkodi, A.N. Balachandar, P. Vara-lakshmi // Mol. Cell Biochem., 247 (1-2): 9-13 (2003).
25. M^ord, J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) / J.M. McCord, I. Fridovich // J. Biol. Chem., 244: 6049-6063 (1969).
26. Popper, H. The estimation of creatinine in serum / H. Popper, F. Mandel, H. Mayer // Biochem. J., 291: 354 (1937).
27. Role of exogenous melatonin in reducing the nephrotoxic effect of daunorubicin and doxorubicin in the rat / P. Dziegiel et al. // J. of Pineal Res., 33 (2): 95-100 (2002).
28. Simic, T. Glutathione and enzymes associated with glutathione metabolism in adriamycin nephropathy / T. Simic, J. Mimic-Oka, M. Sindjic // Srp. Arh. Celok. Lek., 124 (1): 45-47 (1996).
29. Singal, P.K. Doxorubicin-induced cardiopathy / P.K. Singal, N. Illiskovic // N. Engl. J. Med. 339: 900-905 (1998).
30. The influence of cyclosporin on lipid peroxidation and superoxide dismutase in adriamycin nephropathy in rats / T. Zima et al. // Nephron, 75: 464 (1997).
31. Weiss, R.B. The antracyclines: will we find a better doxorubicin? / R.B. Weiss // Semin. Oncol. 19: 670-686 (1992).
and oxydative stress (level of markers and activity of antioxidative enzymes) in rats has been studied in this research. Also amelioration of glycine have compared to melatonin.
Keywords: doxorubicin-induced
nephropathy, oxidative stress, glycine, melatonin.
Glycine influence on doxorubicin-induced renal functional changes
