CC BY
107
УДК 615.739.6:616.61-08
О. С. Селиванова, С. М. Напалкова
ГЛИЦИН КАК ЦИТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЕНТАМИЦИНОВОЙ
НЕФРОПАТИИ
Изучены нефропротекторные свойства глицина в условиях экспериментального гентамицин-индуцированного повреждения почек. Установлено, что применение глицина позволило предупредить вызванную гентамицином почечную недостаточность, оказало положительное влияние на структурные изменения в почках крыс, предупредило развитие окислительного стресса и снизило активность антиоксидантных ферментов.
Введение
Нефротоксичность антибактериальных препаратов часто протекает скрыто, поэтому редко привлекает внимание врача в достаточной степени [1, 2]. Широко применяемые для лечения тяжелых форм инфекционно-воспалительных заболеваний аминогликозидные антибиотики [3] считаются одной из основных причин развития лекарственного поражения почек [1, 4, 5]. Экспериментальная гентамициновая нефропатия является одной из распространенных в фармакологии моделью для нефротоксичности и изучения нефропротектор-ного действия лекарственных средств [5].
Механизм стимуляции гентамицином повреждения почек до конца еще не выяснен [6]. Большинство исследователей связывают его с образованием активных форм кислорода и ослаблением антиоксидантной защиты [7-9]. Кроме того, наибольшее снижение аминогликозидной токсичности наблюдалось при использовании веществ, предупреждающих или уменьшающих вызванное гентамицином развитие оксидативного стресса в почках животных [10-12].
Процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты биологических мембран тесно связаны с другими метаболическими процессами [13], поэтому поиск веществ-метаболитов, способных индуцировать внутриклеточную антиоксидантную защиту, является перспективным подходом к снижению оксидативных повреждающих факторов [14]. Одним из таких веществ является аминокислота глицин [15-17].
В анализируемой нами литературе не было найдено данных о возможности применения глицина для коррекции нефротоксических эффектов ами-ногликозидных антибиотиков, что и послужило мотивацией для проведения настоящего исследования.
Цель работы - экспериментальное изучение нефропротекторных свойств глицина на гентамициновой модели поражения почек.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 35 белых нелинейных половозрелых кры-сах-самцах весом 240-290 г. Животные были разделены на пять равных групп (таблица 1).
Таблица 1
Схема проведения эксперимента
№ п/п Условия эксперимента Количество животных
1 Интактные животные п = 7
2 Контрольные животные (0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида однократно внутрибрюшинно в течение 7 дней) п = 7
3 Гентамицин (100 мг/кг/сут. однократно внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида в течение 7 дней) п = 7
4 Глицин (50 мг/кг/сут. однократно внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида) за 30 мин до каждой инъекции гентамицина п = 7
5 Глицин (50 мг/кг/сут. однократно внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида в течение 7 дней) п = 7
Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводились под общим наркозом (этаминал-натрий из расчета 50 мг/кг внутрибрюшинно). Животные умерщвлялись путем декапитации. При этом производился забор крови путем пункции сердца для исследования концентрации креатинина, мочевины и глутатионпероксидазы. Моча забиралась из мочевого пузыря для определения концентрации общего белка.
Немедленно после забора биологических жидкостей левая и правая почки удалялись и взвешивались. Левая почка использовалась для изучения показателей перекисного окисления липидов (концентрации малонового диальдегида, белковых карбонильных групп и восстановленного глутатиона) и состояния антиоксидантной системы (активности глутатионредуктазы, глута-тионпероксидазы и супероксиддисмутазы), правая почка - для гистологического исследования с помощью световой микроскопии.
Известно, что гентамицин вызывает поражение преимущественно проксимальных канальцев, при этом структура клубочков практически не повреждается [18], именно по этой причине особое внимание при изучении почечных срезов уделялось тубулярной структуре. В каждом срезе под микроскопом с помощью окулярной сетки в 25 полях зрения (при увеличении 15x10x1,6) оценивались и подсчитывались все нормальные канальцы и канальцы с гистопатологическими альтерациями (набухание, эндоплазматиче-ская вакуолизация, десквамация и некроз). Затем рассчитывалось процентное отношение канальцев с гистопатологическими альтерациями к их общему количеству.
Почечные срезы животных дифференцировались по степеням выраженности канальцевых изменений с использованием следующих критериев:
- степень 0 - нормальная гистологическая картина (отсутствие альтераций);
- степень I - небольшие ограниченные участки канальцев с альтерациями (1-25% от общего числа);
- степень II - четко визуализируемые канальцы с гистопатологическими альтерациями, но занимающие менее половины от общего числа (26-50%);
- степень III - более половины канальцев с различными альтерациями, но еще можно идентифицировать интактные участки (51-75%);
- степень IV - все или почти все канальцы с альтерациями (76-100%).
Все полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Unistat Statistical Package 5.001. Оценку достоверности различий проводили по %2 и г-критерию Стьюдента. Статистически достоверными признавались различия между группами при 95% уровне значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
В группе контрольных животных, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия, не наблюдалось достоверных изменений изучаемых показателей по сравнению с животными интактной группы.
Гентамицин вызвал повышение в сыворотке крови концентрации креа-тинина на 38% (с 0,80 ± 0,05 до 1,10 ± 0,07 мг/100 мл, р < 0,01), мочевины на 72% (с 18,98 ± 0,56 до 32,56 ± 0,79 мг/100 мл, р < 0,001) по сравнению с данными контрольной группы животных, что свидетельствовало о развитии острой почечной недостаточности у крыс. Профилактическое введение глицина за 30 мин до каждой инъекции аминогликозидного антибиотика предупредило эти изменения. Глицин (50 мг/кг), применяемый без гентамицина, не вызвал достоверных изменений изучаемых показателей по сравнению с группами интактных и контрольных животных (рис. 1). На рисунке 1: статистически достоверно по сравнению с интактной группой АА - при р < 0,01 и ААА - при p < 0,001; с контрольной группой 00 - при p < 0,01 и 000 - при р < 0,001; с группой животных, получавших только гентамицин, ** - при р < 0,05 и *** - при p < 0,001.
Ш
О
& 1ц
CD ^ Н °
о о °
ш ^ _0 о ш
о
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
□ 1 02
13 04 Q5
□ 1 02
13 04 Ш5
Рис. 1 Влияние исследуемых препаратов на некоторые функциональные показатели почек у крыс: 1 - интактные животные; 2 - контроль; 3 - гентамицин;
4 - глицин + гентамицин; 5 - глицин
У животных, получавших гентамицин, наблюдалась потеря в весе по сравнению с контрольной группой (р < 0,01) (таблица 2). Это объясняется тем, что при острой почечной недостаточности наблюдается увеличение ка-
0
таболизма, приводящего к ацидозу, сопровождаемому анорексией [5], из-за которого уменьшается количество принимаемой животными пищи. Глицин предупредил потери животными в весе, что было связано, возможно, с предотвращением им развития острой почечной недостаточности.
Таблица 2
Изменение общего веса и веса почек животных под влиянием исследуемых препаратов
Группа Изменение общего веса (г) Вес почек/100 г общего веса (мг)
Интактные животные 28,63 ± 4,08 0,87 ± 0,03
Контроль 30,02 ± 5,24 0,89 ± 0,06
Гентамицин -8,93 ± 6,51 м °° 1,08 ± 0,05 А °
Глицин + гентамицин 24,31 ± 5,62 ** 1,04 ± 0,06
Глицин 27,38 ± 7,15 0,92 ± 0,06
Примечание: статистически достоверно по сравнению с интактной группой А -при р < 0,05 и АА - при р < 0,01; с контрольной группой ° - при р < 0,05 и °° - при р < 0,01; ** - с группой животных, получавших только гентамицин (р < 0,01).
Введение гентамицина привело к повреждению 63% проксимальных трубочек. 14% животных данной группы имели II степень, а 86% - III степень выраженности тубулопатии. Известно, что проксимальные канальцы являются первичным очагом кумуляции значительной концентрации антибиотика в почках [19], это и обусловливает повреждение при гентамициновой нефропатии в основном тубулярной структуры [18]. Результаты гистологического анализа почечных срезов, полученные в ходе нашего эксперимента, согласовывались с этими данными.
Эпителий проксимальных канальцев является основной локализацией синтеза фермента глутатионпероксидазы [20]. У животных гентамициновой группы наблюдалось снижение на 47% активности данного фермента в сыворотке крови по сравнению с контрольными животными (с 4,38 ± 0,48 до 2,32 ± 0,27 мкмоль/мин/мл, р < 0,01), что подтвердило наличие повреждения канальцевой структуры почек.
Тубулопатия обусловливает развитие отека интерстициальной ткани, поэтому у животных, получавших только гентамицин, наблюдалось увеличение соотношения веса почек к общему весу ((вес правой + вес левой поч-ки)/вес крысы • 100), (р < 0,05) (см. таблицу 2).
Глицин уменьшил выраженность канальцевого повреждения, которое у животных данной группы составило 14% от общего числа проксимальных трубочек. У 14% крыс данной группы была I степень, у 57% - II и у 29% -III степень повреждения (рис. 2). При этом сохранилась активность фермента глутатионпероксидазы в сыворотке крови животных, получавших профилактически глицин (4,02 ± 0,53 мкмоль/мин/мл), а соотношение веса почек к общему весу животных при введении глицина достоверно не отличалось от контрольных данных (см. таблицу 2).
О степени свободно-радикального окисления в почках при гентамици-новом повреждении мы судили по концентрации продуктов переокисления и активности антиоксидантных ферментов. Гентамицин вызвал повышение содержания белковых карбонильных групп на 42% (р < 0,01), малонового ди-
альдегида на 24% (р < 0,01), снижение концентрации восстановленного глу-татиона на 12,5% (р < 0,05) по сравнению с аналогичными данными контрольных животных. Введение глицина позволило предупредить гентамицин-индуцированное увеличение содержания малонового диальдегида и белковых карбонильных групп, а также понижение концентрации восстановленного глу-татиона в гомогенате почек экспериментальных животных (таблица 3).
Рис. 2 Срезы коркового вещества почек животных следующих групп: А) контроль; Б) гентамицин; В) глицин + гентамицин (микрофото); * отмечены проксимальные канальцы с альтерациями
Таблица 3
Влияние исследуемых препаратов на содержание показателей оксидативного стресса и активность антиоксидантных ферментов в почках у крыс
Группа Интактные Контроль Гентамицин Глицин + гентамицин Глицин
Белковые карбонильные группы (моль/мг белка) 2,G2 і G,12 1,92 і G,12 2,l3 і G,14 AA oo 2,31 і G,G9 * l,9l і G,15
Малоновый диальдегид (нмоль/мг белка) 1,92 і G,Gl 1,9G і G,G9 2,3б і G,G9 AA oo 2,G6 і G,G4 * 1,93 і G,12
В остановленный глутатион (мкг/мг белка) 2,l3 і G,G5 2,l3 і G,Gl 2,39 і G,Gl o 2,б8 і G,G9 * 2,l2 і G,G9
Супероксид-дисмутаза (мкмоль/мин/ мг белка) 1,85 і G,G9 1,8б і G,G8 1,54 і G,G6 o 1,8G і G,G6 * 1,84 і G,G6
Глутатионпе-роксидаза (мкмоль/ мин/мг белка) 1,9б і G,G8 l,9l і G,Gl G,8G і G,Gl ллл ooo 1,88 і G,ll*** 1,91 і G,G9
Глутатионредукта-за (нмоль/мин/мг белка) 5,39 і G,13 5,3l і G,13 2,9б і G,24 AAA ooo 5,G8 і G,16 *** 5,41 і G,12
Примечания: статистически достоверно по сравнению с интактной группой AA - при p < G,G1 и ЛЛА - при p < G,GG1; с контрольной группой o - при p < G,G5, oo - при p < G,G1 и ooo - при p < G,GG1; с группой животных, получавших только гентамицин * - при p < G,G5 и *** - при p < G,GG1.
8G
Развитию оксидативного стресса в почках крыс гентамициновой группы также способствовал тот факт, что активные формы кислорода, образование которых повысилось под действием аминогликозидного антибиотика, могут стимулировать инактивацию антиоксидантных ферментов - суперок-сиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - в корковом веществе почек, что и наблюдалось в данном исследовании. Активность су-пероксиддисмутазы понизилась на 17% (р < 0,05), глутатионпероксидазы - на 11% (р < 0,001), а глутатионредуктазы - на 45% (р < 0,001) по сравнению с контрольными животными. Глицин сохранил активность всех трех изучаемых антиоксидантных ферментов, что значительно улучшило антиоксидант-ный статус животных (см. таблицу 3).
Полученные результаты указывают, что развитие оксидативного стресса и уменьшение активности антиоксидантных ферментов можно считать одним из патогенетических звеньев гентамициновой нефротоксичности у крыс, одним из возможных механизмов нефропротекторного действия глицина является антиоксидантная активность аминокислоты, проявляющаяся в способности сохранять активность антиоксидантных ферментов и предупреждать развитие оксидативного стресса в почках крыс.
Заключение
Таким образом, нами было установлено, что глицин обладает свойствами цитопротектора в условиях гентамицинового повреждения почек у крыс. Его применение предупреждает вызванную аминогликозидным антибиотиком почечную недостаточность, оказывает положительное влияние на структурные изменения в почках крыс, предотвращает развитие окислительного стресса и снижение активности антиоксидантных ферментов.
Список литературы
1. Яковлева, О. А. Механизмы нефротоксичности антибиотиков / О. А. Яковлева, В. В. Царук // Украинский химиотерапевтический журнал. - 2000. - Т. 8. -№ 4. - С. 66-71.
2. Guo, X. How to prevent, recognize, and treat drug-induced nephrotoxicity / X. Guo, C. Nzerue // Cleve Clin. J. Med. - 2002. - № 69 (4). - P. 289-297.
3. Навашин, С. М. Антибиотики группы аминогликозидов / С. М. Навашин, И. П. Фомина, Ю. О. Сазыкин. - М. : Медицина, 1977. - 103 с.
4. Тареева, И. Е. Лекарственные поражения почек / И. Е. Тареева, А. Ю. Николаев, С. О. Андросова // Нефрология / под ред. И. Е. Тареевой. - М., 1995. - С. 299312.
5. Ali, B. H. Gentamicin nephrotoxicity in humans and animals: some recent reseach / B. H. Ali // Gen. Pharmacol. - 1995. - № 26. - P. 1477-1487.
6. Price, K. E. Aminoglycoside research: prospects for development of improved agents // K. E. Price // Antimicrob. Agents Chemother. - 1986. - № 29. - P. 543-548.
7. Baliga, R. Oxidant mechanisms in toxic acute renal failure / R. Baliga [et al.] // Drug Metab. Rev. - 1999. - № 31 (4). - P. 971-977.
8. Sha, S. H. Formation of reactive oxygen species following bioactivation of gentamicin / S. H. Sha, J. Schacht // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - № 26. - P. 341-347.
9. Yang, C. L. Renal cortical mitochondria are the source of oxygen free radicals enhanced by gentamicin / C. L. Yang, X. H. Du, Y. X. Han // Ren. Fail. - 1995. - № 17. -P. 21-26.
10. Abdel-Naim, A. B. Protective effects of vitamin E and probucol against gen-tamicin-induced nephrotoxicity in rats / A. B. Abdel-Naim, M. H. Abdel-Wahab, F. F. Attia // Pharmacol. Res. - 1999. - № 2. - P. 183-187.
11. Ozbek, E. Melatonin administration prevents the nephrotoxicity induced by gentamicin / E. Ozbek [et al.] // BJU Int. - 2000. - № 85. - P. 742-746.
12. Erdem, A. The protective effect of taurine against gentamicin-induced acute tubular necrosis in rats / A. Erdem [et al.] // Nephrol. Dial. Transplant. - 2000. - № 15. -P. 1175-1182.
13. Шмелева, Л. Т. Антиоксидантные системы организма при экспериментальной и клинической патологии / Л. Т. Шмелева // Сборник научных трудов. - Свердловск, 1987. - 163 с.
14. Парфенов, В. А. Метаболическая терапия ишемического инсульта / В. А. Парфенов // Русский медицинский журнал. - 2002. - Т. 10. - № 25. - С. 27-34.
15. Малышев, В. В. Ограничение гипероксидации липидов и предупреждение стрес-сорных повреждений сердца производными глицина / В. В. Малышев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1996. - Т. 56. - № 5. - C. 23-25.
16. Baines, A. D. Mechanisms of perfused kidney cytoprotection by alanine and glycine / A. D. Baines, N. Shaikh, P. Ho // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 1990. - № 259 (1). -P. 80-87.
17. Senthilkumar, R. Protective effect of glycone supplementation on the levels of lipid peroxidation and antioxidant enzymes in the erythrocyte of rats with alcohol-induced liver injury / R. Senthilkumar, M. Sengottuvelan, N. Nalini // Cell Biochem. Funct. - 2004. - № 22 (2). - P. 123-128.
18. Pedraza-Chaverri, J. Garlic ameliorates gentamicin nephrotoxicity: relation to antioxidant enzymes / J. Pedraza-Chaverri [et al.] // Free Radic. Biol. Med. - 2000. -№ 29. - P. 602-611.
19. Silverblatt, F. J. Autography of gentamicin uptake by the rat proximal tubule cell / F. J. Silverblatt, C. Kuehn // Kidney Int. - 1979. - № 15. - P. 335-345.
20. Avissar, N. Human kidney proximal tubules are the main source of plasma glutathione peroxidase / N. Avissar [et al.] // Am. J. Physiol. - 1994. - № 266. - P. 367-375.
