CC BY
29
© Ю.В.Саенко, А.М.Шутов, С.М.Напалкова, О.С.Селиванова, 2005 УДК 616-092.19:611.61]615.779.9.001.5
Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, С.М. Напалкова, О.С. Селиванова
ЭРИТРОПОЭТИН СНИЖАЕТ ПРОЯВЛЕНИЯ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА, ИНДУЦИРОВАННОГО ДОКСОРУБИЦИНОМ, В ПОЧКАХ КРЫС
Yu.V.Saenko, A.M.Shutov, S.M.Napalkova, O.S.Selivanova
ERYTHROPOIETIN ATTENUATES MANIFESTATIONS OF OXIDATIVE DOXORUBICIN-INDUCED STRESS IN RAT KIDNEYS
Кафедра фармакологии, Кафедра терапии и профессиональных болезней медицинского факультета Ульяновского государственного университета, г Ульяновск, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью исследования явилось определение возможности коррекции эритропоэтином оксидатив-ного стресса, индуцированного доксорубицином, в почках крыс. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Исследование выполнено на беспородных белых крысах. Одной группе животных (группа ДОК, n=7) внутрибрюшинно вводили доксорубицин, другой внутрибрюшинно доксорубицин с одновременным внутривенным введением эритропоэтина (группа ЭПО, n=7). Забой животных, включая контрольную группу (группа Контроль, n=7), проводили через 24 часа. В гомогенате тканей почек исследовали содержание восстановленного глутатиона (TSH), активность глутатион^-трансферазы (Г^-Т), активность цитоплазматической НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 (НХО 1), активность глутатион редуктазы (ГР), содержание белковых карбонильных групп. РЕЗУЛЬТАТЫ. Введение доксорубицина привело к снижению уровня TSH (0,061±0,017 против 0,089±0,011 мкмоль/мг ткани в контрольной группе, p<0,05) и активности ГР (62,10±8,04 против 85,80±7,18 нмоль/мин/мг белка в контрольной группе, p<0,05) в гомогенате почек. Введение эритропоэтина предотвращало снижение TSH и активности ГР и приводило к увеличению активности НХО 1 в гомогенате почек. Разницы в содержании белковых карбонильных групп в гомогенате почек в исследуемых группах животных не отмечено. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Эритропоэтин ослабляет проявления оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в почках крыс.
Ключевые слова: глутатион, доксорубицин, оксидативный стресс, эритропоэтин. ABSTRACT
THE AIM of the investigation was to determine possibilities of erythropoietin correction of oxidative doxorubicin -induced stress in rat kidneys. MATREIAL AND METHODS. The investigation was fulfilled in white rats. One group of animals (n=7) was given intraperitoneal injections of doxorubicin, in the other group doxorubicin was injected intraperitoneally simultaneously with intravenous injection of erythropoietin (n=7). The animals including a control group (n=7) were killed in 24 hours. The content of the reduced glutathione (GSH), activity of glutathione-S-transferase (G-S-T), activity of cytoplasm NADPH:quinone oxidoreductase 1 (HXO 1), activity of glutathione reductase (GR), the content of protein carbonyl groups were investigated in homogenate of the kidney tissue. RESULTS. The introduction of doxorubicin resulted in lower level of GSH (0,061±0.017 versus 0.089±0.011 mkmol/mg of tissue in the control group, p<0.05) and activity of GR (62.10±8.04 versus 85.80±7.18 nmol/min/mg of protein in the control group, p<0.05) in the kidney homogenate. The introduction of erythropoietin prevented attenuation of GSH and activity of GR and led to increased activity of HXO 1 in the kidney homogenate. CONCLUSION. No difference was noted between the content of protein carbonyl groups in the kidney homogenate in the investigated groups of animals.
Key words: erythropoietin, glutathione, doxorubicin, oxidative stress, kidney.
ВВЕДЕНИЕ
Доксорубицин (ДОК) - эффективный противоопухолевый антрациклиновый антибиотик. Клиническое использование ДОК сопряжено с определенными трудностями, связанными к высокой кардио- [1] и, в меньшей степени, нефротоксичностью препарата [2]. В клетках опухоли токсичность доксорубицина реализуется преимущественно через ингибирование ферментов репликации ДНК. В результате интер-каляции доксорубицина в спираль ДНК блокируется активность ДНК-топоизомеразы, в результате
чего нарушается клеточный цикл и запускается механизм программируемой клеточной смерти [1].
В нормальных тканях токсичность препарата обусловлена активными формами кислорода, которые образуются в результате редокс-циклических реакций, а также влияния доксорубицина на обмен железа. Вызванное доксорубицином увеличение продукции активных форм кислорода приводит к снижению содержания в клетках восстановленного глутатиона (TSH), уменьшению внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала и
через ряд внутриклеточных сигнальных механизмов запускает программу апоптоза [3,4].
Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что снизить токсичность ДОК можно путем введения веществ, способных поддержать внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал и (или) активировать ферменты, участвующие в детоксикации препарата.
В последние годы установлена способность эритропоэтина препятствовать развитию оксидатив-ного стресса при инфаркте миокарда [5], геморрагическом шоке [6], повреждении спинного мозга [7].
Целью работы явилось исследование влияния эритропоэтина на индуцированный доксорубицином оксидативный стресс в почках крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на 21 самце беспородных белых крыс весом 300 - 340 г в возрасте 21-23 недели. Животные были разделены на 3 группы: контрольная группа (Контроль, n=7); группа, в которой животным для индукции оксидативного стресса внутрибрюшино вводился доксорубицин («Фармсинтез», Москва) из расчета 7,5 мг/кг массы животного (ДОК, n=7); группа, в которой животным перед инъекцией ДОК внутривенно вводили эритропоэтин (Эпокрин, Санкт-Петербург) в дозе 1200 МЕ/кг (ЭПО, n = 7).
Забой животных проводили через 24 часа путем декапитации. Перед декапитацией животным вводился тиопентал натрия.
Для приготовления общей цитоплазматической фракции, левую почку растирали при 4° С в гомогенизаторе Поттера с буфером, содержащим 0,1 моль KCl, 0,25 моль сахарозы, 1 ммоль ЭДТА, 20 ммоль Трис-HCl (рН=7,0), 1 ммоль фенилметил-сульфонил фторида, далее экстракт центрифугировали при 10000 g, супернатант отбирали и хранили до использования при -20° С.
Активность глутатион-Б-трансферазы (Г-S-T) определяли спектрофотометрически при 25° С, с 1-хлоро-2,4-динитробензолом в качестве субстрата [8]. Реакционная смесь содержала в конечном объеме 3,0 мл - 0,1 М фосфатного буфера (рН = 6,5), 1 ммоль глутатиона восстановленного, 1 ммоль субстрата. Определялось возрастание оптической плотности при 340 нм в течение 3 минут. Определялась скорость неферментативной реакции и вычиталась из полученного результата для каждого определения. Активность фермента выражалась в мкмоль субстрата/минута/мг белка, для пересчета был использован коэффициент экстинции 9,6 ммоль-1см-1.
Активность цитоплазматической НАД(Ф)Н:хи-
нон оксидоредуктазы 1 (НХО 1) определялась методом Фишера [9], с 2,6-дихлорофенолиндофено-лом в качестве субстрата. Реакционная смесь содержала, в конечном объеме 1,0 мл - 50 ммоль Трис буфера рН 7,5; 0,23 мг/мл бычьего сывороточного альбумина; 0,08% Тритон Х-100, 100 мкмоль субстрата, 300 мкмоль НАДН. Определялось уменьшение оптической плотности при 600 нм. Определялась скорость неферментативной реакции и вычиталась из полученного результата для каждого определения. Активность НХО 1 выражали в нмоль/мин на 1 мг белка, для пересчета был использован коэффициент экстинции 21 ммоль-1см-1.
Активность глутатион редуктазы (ГР) определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм и выражали через количество окисленного НАДФН в мкмоль/мин на 1 мг белка [10]. Реакционная смесь содержала: 1,0 ммоль глутатиона окисленного, 0,1 ммоль НАДФН, 0,5 ммоль ЭДТА, 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,6). Для пересчета был использован коэффициент экстинции 6,22 ммоль-1 см-1.
Содержание белковых карбонильных групп определяли 2,4-динитрофенилгидразиновым методом по методике Левина с соавт. [11]. Предварительно из образца удалялась ДНК в реакции преципитации с 1% сульфатом стрептомицина. Далее образец, содержащий 50-100 мкг белка, осаждали 10% трихлоруксусной кислотой, осадок дважды промывали ТХУ и растворяли в 0,5 мл 2М НС1, содержащей 10 ммоль 2,4-динитрофенилгидрази-на, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли 0,5 мл 20% ТХУ, центрифугировали при 5000 g, осадок трижды промывали смесью этанол-этилацетат и растворяли в 3 мл 8М мочевины. Оптическую плотность измеряли при 370 нм. Количество карбонильных групп выражали в нмоль на 1 мг белка, для пересчета использовали коэффициент экстин-ции 21 ммоль-1см-1.
Концентрацию глутатиона восстановленного (rSH) определяли в реакции с 5,5'-дитио-бис-нитро-бензойной кислотой (ДНТБ) [12]. Навеску ткани растирали при 4° С в ступке с 2 объемами 1,15% KCl, экстракт центрифугировали при 3000 g, супернатант депротеинизировали добавлением равного объема 4% сульфосалициловой кислоты и использовали для определения rSH. Реакционная смесь содержала 0,25 мл депротеинизированного супернатанта, 2,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН = 8,0). Реакцию запускали добавлением 0,25 мл 1 ммоль ДНТБ. Оптическую плотность измеряли через 15 минут при длине волны 412 нм, для пересчета использовали коэффициент экстинции 14,15 ммоль-1см-1. Количество rSH выражали в мкмоль на 1 мг ткани.
Концентрацию белка в пробах оценивали при помощи метода Бредфорда [13].
Результаты обработаны статистически с использованием критерия Манна-Уитни. Показатели представлены как Х±8Б. Различия между группами считали достоверными при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты исследования активности ферментов и концентрации Г8И в гомогенате ткани почек представлены на рисунках 1- 3. Как видно из рис. 1 доксорубицин вызывал снижение концентрации глутатиона восстановленного в паренхиме почек (Г8И) по сравнению с контролем почти на 30%. В группе животных, которым перед введением док-сорубицина вводили эритропоэтин, концентрация глутатиона, восстановленного в тканях почек, статистически не отличались от контрольной группы.
В группе ДОК активность глутатион-редукта-зы была достоверно ниже, чем в контрольной группе. Введение эритропоэтина перед инъекцией доксорубицина предотвращало индуцированное доксорубицином снижение активности ГР в гомо-генате почек (рис. 2).
Введение доксорубицина не вызывало достоверных изменений активности НХО 1. При совместном введении доксорубицина с эритропоэтином активность НХО 1 в гомогенате почечной ткани была достоверно выше по сравнению с группой ДОК (рис. 3).
Введение доксорубицина не приводило к изменению активности глутатион-8-трансферазы в сравнении с контрольной группой (0,105±0,025 против 0,118±0,015 мкмоль/мин/мг белка соответственно, р>0,05). В гомогенате почек животных, которым перед инъекцией доксорубицина внутривенно вводили эритропоэтин, активность Г8Т (0,122±0,0200 мкмоль/мин/мг белка) не отличалась от аналогичного показателя в группах Контроль (р>0,05) и ДОК (р>0,05).
Не выявлено достоверных различий в содержании корбонильных групп белковых молекул у крыс, получавших препараты, и животных контрольной группы. В контрольной группе их содержание составило 2,13±1,01 мкмоль/мг белка, в группе ДОК - 4,21±2,36 мкмоль/мг белка (р>0,05), в группе ЭПО -2,961,98 мкм±оль/мг белка (р>0,05).
ОБСУЖДЕНИЕ
Исследования последних лет выявили два основных механизма токсичности доксорубицина в отношении нормальных тканей. Первый механизм заключается в формировании комплекса доксору-бицина и Бе2+, что может приводить к образова-
Рис. 1. Влияние доксорубицина (Док) и совместного введения доксорубицина с эритропоэтином (Эпо) на концентрацию восстановленного глутатиона (ГБН) в гомогенате почечной ткани. ** - р < 0,01 (различие с группой ДОК); # -р < 0,05 (различие с группой Контроль).
Рис. 2. Влияние доксорубицина (Док) и совместного введения доксорубицина с эритропоэтином (Эпо) на активность глутатион редуктазы (ГР) в гомогенате почечной ткани. *** - р < 0,001 (различие с группой ДОК); ## - р < 0,01 (различие с группой Контроль).
Рис. 3. Влияние доксорубицина (Док) и совместного введения доксорубицина с эритропоэтином (Эпо) на активность НАД(Ф)Н:хинон оксидиредуктазы 1 (НХО1) в гомогенате почечной ткани. ** - р < 0,01 (различие с группой ДОК).
нию гидроксильного радикала и инициации цепных реакций с вырожденным разветвлением. Антрацик-линовые антибиотики могут способствовать высвобождению ионов Бе2+ из ферритина в результате взаимодействия с этим белком, либо опосредованно, через генерацию супероксид анион-радикала, тем самым усугубляя оксидативный стресс [14].
Второй механизм цитотоксичности доксоруби-цина связан с его редокс-циклической активностью внутри клетки [15]. В основе этого механизма лежит способность флавиновых редуктаз (цитох-ром-Р-450 редуктаза, цитохром Ь5-редуктаза, НАДН-дегидрогеназа, ксантин-оксидаза) восстанавливать доксорубицин из формы хинона до се-михинона, т.е. осуществлять одноэлектронное восстановление. Доксорубицин, в форме семи-хинона, является свободным радикалом и способен восстанавливать кислород до супероксид анион-радикала. В ходе реакции с кислородом, кроме супероксид анион-радикала, генерируется исходная форма доксорубицина (т.е. хинон) [14,15]. Цикл одноэлектронного восстановления/окисления доксорубицина может функционировать достаточно продолжительное время и вызывать внутриклеточный оксидативный стресс, который приводит к снижению внутриклеточной концентрации ГБН, и как следствие, к снижению внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала [16]. Установлено, что снижение внутриклеточной концентрации ГБИ может запускать митохондри-альный путь реализации апоптоза [4]. В работах последних лет отмечается, что токсический эффект антрациклиновых антибиотиков в отношении нормальных тканей реализуется, в основном, через индукцию апоптоза [1,17].
Полученные нами данные свидетельствуют, что введение крысам доксорубицина приводит к снижению концентрации ГБИ в паренхиме почки, это согласуется с литературными данными [2]. Эритропоэтин предотвращал индуцированное док-сорубицином снижение ГБИ в почечной ткани, что является благоприятным эффектом. Механизмы, с помощью которых эритропоэтин препятствовал снижению содержания восстановленного глутати-она, требуют дополнительных исследований. Возможно, такой эффект связан с активацией эритропоэтином ЖК/БТЛТ сигнальных путей, которые принимают участие в поддержании внутриклеточного редокс-потенциала [7]
Положительным эффектом эритропоэтина является обнаруженная нами активация препаратом НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1. Этот фермент защищает клетки от токсического воздействия веществ хиноидной природы путем осуществления
двухэлектронного восстановления хинонов до стабильных гидрохинонов. Такая реакция снижает возможность одноэлектронного восстановления доксорубицина до семихинона [18]. Кроме того, НХ01 обладает рядом других защитных функций, например, поддерживает в восстановленном состоянии коэнзим Q10 - один из основных антиоксидан-тов мембран клеток, восстанавливает а-токоферол гидрохинон в а-токоферол и участвует в детокси-кации супероксид-анион радикала [19]. Увеличение активности НХ01 положительно отражается на способности клеток противостоять доксоруби-цин-индуцированному оксидативному стрессу, тогда как снижение активности НХ01 вызывает повышенную чувствительность к веществам хи-ноидной природы, к которым относятся все антра-циклиновые антибиотики [18,19].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, эритропоэтин снижает доксо-рубицин-индуцированный оксидативный стресс в тканях почек. 0сновными механизмами, обеспечивающими защиту почки от доксорубицин-инду-цированного оксидативного стресса, являются поддержание уровня восстановленного глутатио-на, индукция активности ферментов НАД(Ф)Н:хи-нон оксидоредуктазы 1 и глутатион редуктазы.
Благодарности. Исследование поддержано грантом «Университеты России», Грант УР 11.01.029
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Abdelrahman EJ, Sharpies MC, McDonald AF et al. Erythropoietin attenuates the tissue injury associated with hemorrhagic shock and myocardial ischemia. Shock 2004; 22: 63-69
2. Anusevicius Z, Sarlauscas J, Cenas N. Two-electron reduction of quinones by rat liver NAD(P)H:quinone oxidoreductase: quantitative structure-activity relationships. Arch Biochem Biophys 2002; 404: 254-256
3. Arola O, Saraste A, Pulkki K. Acute doxorubicin cardiotoxicity involves cardiomyocyte apoptosis. Cancer Res 2000; 60: 1789-1792
4. Basser RL, Green MD. Strategies for prevention of anthracycline cardiotoxicity. Cancer Treat Rev 1993; 19: 57-77
5. Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annal Biochem 1976; 72: 248254
6. Carlberg I, Mannervik B. Purification and characterization of the flavoenzyme glytathione reductase from rat liver. J Biol Chem 1975; 250: 5475-5480
7. Celik A, Gokmen N, Erbayraktar S et al. Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 2258-2263
8. Dziegiel P, Suder E, Surowiak P et al. Role of exogenous melatonin in reducing the nephrotoxic effect of daunorubicin and doxorubicin in the rat. J Pineal Res 2002; 33: 95-100
9. Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem
Biophys 1972; 82: 70-77
10. Fisher GR, Gutierrez PL. Free radical formation and DNA strand breakage during metabolism of diaziquone by NAD(P)H quinine-acceptor oxidoreductase (DT-diaphorase) and NADPH-cytochrome c reductase. Free Radic Biol Med 1991; 10: 359-370
11. Habig WG, Pabst MJ, Jakoby WB. Glutathione S-transferase. The first enzymic step in mercapturic acid formation. J Biol Chem 1974; 249: 7130-7139
12. Klatt P, Lamas S. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative stress. Eur J Biochem 2000;267:4928-4944
13. Levin RL, Garland D, Oliver CN et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzym 1990; 186: 464-478
14. Minotti G, Cairo G, Monti E. Role of iron in anthracycline cardiotoxicity: new tunes for an old song? FASEB J 1999; 13: 199-212
15. Parsa С, Kim J, Riel R et al. Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart. J Biol Chem 2004; 279: 20655-20662
16. Powis G. Free radical formation by antitumor quinones. Free Rad Biol Med 1989; 6: 63-101
17. Schafer QF, Buettiner GR. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/ glutathione couple. Free Rad Biol Med 2001; 30: 1191-1212
18. Siegel D, Gustafson DL, Dehn DL et al. NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase 1: role as a superoxide scavenger. Mol Pharmacol 2004; 65: 1238-1247
19. Sun X, Zhou Z, Kang JY. Attenuation of doxorubicin toxicity in metallothionein-overexpressing transgenic mouse heart. Cancer Res 2001; 61: 3382-3387
20. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev 2001; 15: 2922-2933
Поступила в редакцию 26.01.2005 г.
