CC BY
83
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2010, № 2 (2), с. 490-493
УДК 577.152.111
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭТАНОЛА И ГЕПАРИНА
© 2010 г. А.В. Бочкарева, Ю.В. Зимин
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского [email protected]
Поступала виедакцаю 08.04.2010
В экспериментах по исследованию влияния этанола и предварительно введенного гепарина на активность алкогольдегидрогеназы клеток печени крыс показано, что этанол повышает, а гепарин понижает показатели активности фермента в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток печени.
Ключевые слова: алкогольдегидрогеназа, клетки Введение
Известно, что гепарин, помимо антикоагу-лянтной активности, обладает уникальной способностью к комплексообразованию, в результате чего он может модифицировать действие различных эндогенных биологически активных веществ, в том числе энзимов. В литературе имеются данные о взаимодействии гепарина в основном с ферментами липидного обмена в сердце, печени, почках, стенке аорты, однако практически не исследовано влияние его на работу одного из основных ферментов печени -алкогольдегидрогеназы (АДГ).
АДГ катализирует окисление спиртов и восстановление альдегидов в присутствии кофер-ментов НАД и НАДН. Это один из ключевых ферментов, участвующих в метаболизме алкоголя в организме [1].
Этиловый спирт широко распространен в живой природе. Малая диссоциация и очень слабая полимеризация небольших молекул этанола обусловливают его необычайную способность растворяться в воде и жирах и, следовательно, легко проходить через биологические мембраны. Данные свойства определяют его важную роль в физиологических и биохимических процессах, происходящих в организме. Токсическое действие экзогенного этанола на организм чрезвычайно сложно и многообразно. Введение алкоголя в зависимости от его дозы вызывает стрессовые, неспецифические реакции организма [2]. Исследования показывают, что внутрибрюшинное введение крысам этанола в дозе 4.5 мг/кг вызывает сон, средняя продолжительность которого составляет 94.0±8.8 мин [3]. Окисление этанола осуществляется преимущественно в печени, где метаболизиру-
печени крыс, этанол, гепарин.
ется до 95% введенного в организм алкоголя, что приводит к изменениям в ферментных системах этого органа [4].
В связи с этим, цель данной работы - исследование особенностей изменения активности алкогольдегидрогеназы печени экспериментальных животных при введении в организм экзогенного этанола и гепарина.
Материал и методы
В исследовании использовали экстракт печени белых лабораторных нелинейных крыс-самцов массой 150-200 г. Сначала животным вводили гепарин в концентрации 250 МЕ/кг, через 20 минут внутрибрюшинно вводили этанол (4.5 г/кг), после чего животные в течение 24 минут теряли рефлекс переворачивания. Фиксировали время потери данного рефлекса и время его восстановления. Период нахождения крыс в боковом положении отражает время эта-нолового сна. Крыс после окончания эксперимента забивали декапитированием. Затем проводили исследования активности АДГ в митохондриальной и цитоплазматической фракциях, которые получали методом дифференциального центрифугирования [5]. Активность алкоголь-дегидрогеназы определяли в данных фракциях на микроспектрофотометре PowerWave ХБ (ША).
Определенае актавноста фермента с ас-пользованаем в качестве субстрата этанола (прямая реакцая). Окисление этилового спирта под действием АДГ сопровождается восстановлением НАД. В спектрофотометрическую кювету помещали 2.7 мл 100 мМ глицинового буфера (рН 9.6); 0.1 мл раствора, содержащего
Таблица
Время этанолового сна (мин) у крыс и изменение его продолжительности при предварительном введении гепарина
Группа Этанол 4.5 г/кг Гепарин 25G МЕ/кг + + этанол 4.5 г/кг
Продолжительность этанолового сна 94.0±8.8 42.l±3.G***
Примечание: достоверное отличие от группы этанол: *** -р < 0.001 300
ф
250
л
8
а
ане
& I
S § 200 иб
В I
И
а Тз
ть ло
Я 5
но мн
m
и
150
100
50
Контроль
Этанол
Гепарин + Этанол
0
□ Прямая реакция □ Обратная реакция
Рис. 1. Активность алкогольдегидрогеназы в митохондриальной фракции клеток печени крыс при введении этанола и действии гепарина + этанола. Достоверное отличие от контрольной группы: *- р < 0.05, *** - р < 0.001. Достоверное отличие от группы этанол: оо -р < 0.01, °°° -р < 0.001
фермент; 0.1 мл 30 мМ раствора этанола; 0.1 мл 20 мМ раствора НАД. Содержимое кюветы быстро перемешивали и измеряли увеличение оптической плотности при 340 нм через каждые 15 секунд в течение 3 минут. Расчет активности фермента проводили по формуле (1):
Активность = (ДЕ • V)/ (е • Б • Т • Ь), (1)
где ДЕ - разница экстинкции до начала реакции и через 1 минуту после; V - объем проб, равный 3 мл; е - молярный коэффициент экстинкции НАДН - 6.22-106; Б - содержание белка в пробе в мг (или ткани в граммах); Т - время, за которое исследуется реакция - 1 мин; Ь - толщина слоя исследуемого раствора, равная 1 см.
Активность АДГ выражали в нмоль НАДН за 1 мин на 1 мг белка.
Определение активности фермента с использованием в качестве субстрата аце-тальдегида (обратная реакция). Активность АДГ оценивали по скорости окисления НАДН, которая регистрируется спектрофотометрически по убыли величины оптической
плотности при длине волны 340 нм. В спектрофотометрическую кювету помещали 2.7 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 7.4);
0.1 мл раствора, содержащего фермент; 0.1 мл 23 мМ раствора ацетальдегида; 0.1 мл 5 мМ раствора НАДН. Содержимое кюветы быстро перемешивали и измеряли увеличение оптической плотности при 340 нм через каждые 15 секунд в течение 3 минут. Расчет активности фермента проводили по формуле (1). Активность АДГ выражали в нмоль НАДН за 1 мин на 1 мг белка.
Статистическая обработка результатов была проведена с применением t-критерия Стъюдента с использованием программы Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A.Glantz, McGraw-Hill.
Результаты и их обсуждение
Предварительное введение экспериментальным животным гепарина приводило к уменьшению продолжительности этанолового сна (таблица).
250 -
150 -
I!
є
50
Контроль
Этанол
Гепарин + Этанол
0
□ Прямая реакция □ Обратная реакция
Рис. 2. Активность алкогольдегидрогеназы в цитоплазматической фракции клеток печени крыс при введении этанола и действии гепарина + этанола. Пояснения - под рис. 1
Введение крысам этанола при предварительном введении гепарина приводило, в основном, к снижению активности данного фермента (рис. 1, 2). В митохондриальной фракции показатель активности алкогольдегидрогеназы (прямая реакция) составил 44.6±5.2 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р < 0.05) ниже по сравнению с показателями контроля (61.7±5.2 нмоль/мин на мг белка) в 1.4 раза (рис. 1). В цитоплазматической фракции клеток печени активность фермента в прямой реакции в группе гепарин + этанол составила 43.6±2.9 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р < 0.001) ниже по сравнению с контролем (136.8±7.8 нмоль/мин на мг белка) в 3.1 раза, в обратной - 134.5±8.1 нмоль/мин на мг белка, что также достоверно (р < 0.001) ниже данных контрольной группы (212.2±12.1 нмоль/мин на мг белка) в 1.6 раза (рис. 2). Повышение активности алкогольдегидрогеназы наблюдалось в обратной реакции в митохондриальной фракции клеток печени. Здесь показатель активности фермента составил 245.0±9.1 нмоль/мин на мг белка, что достоверно (р < 0.001) выше контрольных показателей (96.1±6.1 нмоль/мин на мг белка) в 2.5 раза (рис. 1).
Предварительное введение животным гепарина приводило к снижению значений активности алкогольдегидрогеназы в данных субклеточных фракциях печени крыс группы гепарин + этанол по сравнению с группой, которой вводился этанол (рис. 1, 2). В митохондриальной фракции показатель ферментативной активности в прямой реакции был достоверно
(р < 0.001) ниже данных группы этанола (114.1±8.6 нмоль/мин на мг белка) в 2.6 раза (рис. 1). В цитоплазматической фракции клеток печени активность алкогольдегидрогеназы в прямой реакции в группе гепарин + этанол была достоверно (р < 0.001) ниже по сравнению с показателями группы этанола (183.1± ±22.1 нмоль/мин на мг белка) в 4.2 раза, в обратной - также достоверно (р < 0.01) ниже данных группы этанола (190.7±17.4 нмоль/мин на мг белка) в 1.4 раза (рис. 2). Повышение активности алкогольдегидрогеназы наблюдалось в обратной реакции в митохондриальной фракции клеток печени группы гепарин + этанол по сравнению с группой этанола (181.8±17.6 нмоль/мин на мг белка): здесь показатель активности фермента был достоверно (р < 0.01) выше в 1.3 раза (рис. 1).
Таким образом, внутрибрюшинное введение экспериментальным животным этанола в основном повышает показатели активности алко-гольдегидрогеназы в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток печени, в то время как предварительное введение гепарина приводит к снижению показателей ферментативной активности.
Заключение
Проведенные исследования показали, что этанол (4.5 мг/кг) и гепарин (250 МЕ/кг) существенно изменяют активность алкогольдегидро-геназы печени экспериментальных животных, при этом введение этанола достоверно повышает показатели активности фермента по сравне-
нию с интактными животными, а предварительное введение гепарина вызывает противоположный эффект. Однако в обратной алкоголь-дегидрогеназной реакции в митохондриальной фракции клеток печени наблюдалось максимальное увеличение активности фермента в 2.5 раза при действии гепарина.
Список литературы
1. Zakhari S. Overview: how is alcohol metabolized by the body // Alcohol Res. Health. 2006. V. 29. № 4. Р. 245-254.
2. Wachtel E., Borochov N., Bach D., Miller I.R. The effect of ethanol on the structure of phosphatidylserine bilayers // Chem. Phys. Lipids. 1998. V. 92. № 2. P. 127-137.
3. Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1985. 232 с.
4. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Углеводный обмен, печень и алкоголь. Пущино: МГУ им. Ломоносова, 1988. 148 с.
5. Эванз У.Г. Органеллы и мембраны животной клетки // В кн.: Биологические мембраны. Методы. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Б. Финдлея, У.Г. Эванза. М.: Мир, 1990. С. 13-61.
CHANGES IN ALCOHOL DEHYDROGENASE ACTIVITY OF RAT LIVER CELLS UNDER ETHANOL AND HEPARIN ACTION
A. V. Bochkareva, Yu. V. Zimin
The experiments on the action of 4.5 mg/kg ethanol and preinjected 250 IU/kg heparin on rat liver alcohol dehydrogenase activity have shown that ethanol increases and heparin decreases the indices of the enzyme activity in mitochondrial and cytoplasmic fractions of liver cells.
Keywords: alcohol dehydrogenase, rat liver, ethanol, heparin.
