Кинетические свойства митохондриальной алкогольдегидрогеназы клеток печени при токсическом гепатите Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 222-224

УДК 577.151.4

КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ

ГЕПАТИТЕ

© 2011 г. А.А. Уланова В.Н. Крылов х, Ю.В. Зимин 1,2

1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии

[email protected]

Поступила в редакцию 23.03.2011

Проведены исследования кинетических свойств митохондриальной алкогольдегидрогеназы клеток печени при токсическом гепатите с помощью нового кинетического метода. Установлено, что при токсическом гепатите существенно падает сродство фермента к субстратам реакции, преимущественно в обратной ферментативной реакции, что приводит к увеличению доли высокотоксичного ацетальдегида в клетках печени.

Ключевые слова: алкогольдегидрогеназа, кинетика, митохондрии, токсический гепатит, биотрансформация.

Введение

По образному выражению печень называют «метаболическим мозгом», тем самым подчеркивания первостепенную значимость данного органа для жизнедеятельности организма.

Несомненно, что заболевания печени и их осложнения, к сожалению, занимают значительное место в практической медицине. На сегодняшний день весь список современных лабораторных тестов (серологических, иммунологических, биохимических) не позволяет масштабно оценить специфичность того или иного заболевания данного органа. Поэтому современные взгляды большинства научных светил направлены на поиск универсальных маркеров различных патологических изменений печени. Данная проблема, в первую очередь, носит медико-биологический характер и ее решение во многом зависит от изучения особенностей молекулярных механизмов регуляции метаболизма данного органа, в частности ферментативных ансамблей субклеточных органелл.

Среди огромного количества энзимов ферменты биотрансформации занимают особое место, в частности алкогольдегидрогеназа (АДГ).

АДГ преимущественно находится в печени, где преобразует до 90% всего этанола в организме. Данный фермент хорошо изучен в цитоплазматической фракции печени при различных патологических состояниях: опухоли, гепатит, окислительный стресс и т.д. В отличие от бактериальных клеток [1], митохондриальная АДГ

изучена недостаточно, особенно при патологии печени.

Цель данной работы - изучение кинетических свойств АДГ в митохондриальной фракции печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите.

Материалы и методы

Исследования проводили на беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Модель экспериментального токсического гепатита создавали подкожным введением 66%-ного раствора CQ4 в растительном масле в дозе 0.3 мл 4 раза в неделю в течение трёх месяцев [2].

Митохондриальную фракцию клеток печени экспериментальных животных получали методом дифференциального центрифугирования [3].

Активность алкогольдегидрогеназы (АДГпр) с использованием в качестве субстрата этилового спирта определяли по методу [4], с использованием в качестве субстрата ацетальдегида (АДГобр) - по методу [5].

Для определения кинетических констант реакций АДГ использовали полную кривую накопления продуктов реакции (зависимость скорости накопления продуктов от времени от начала реакции до полного расходования субстрата). Из первичных экспериментальных данных полной кинетической кривой зависимости (V от ?), используя математический метод, рассчитывали кинетические параметры ферментативной реакции (К, Vmax/Kí) [6].

Концентрацию белка в субклеточных фракциях определяли по методу Лоури в модификации [7].

Полученные экспериментальные данные были обработаны с использованием программы

КГЛИтСА 6.1.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследований изучалась активность алкогольдегидрогеназы в митохондриальной фракции печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите (табл. 1).

Установлено, что активность в митохондриальной фракции АДГ в обратной реакции (обр.) больше, чем в прямой реакции (пр.) в 7.7 раза. Полученные изменения активности указывают, что в физиологических условиях алкогольде-гидрогеназная реакция в митохондриальной фракции печени интактных животных направлена на образование менее токсичного эндогенного этанола из ацетальдегида.

Таблица 1

Активность АДГ в митохондриальной фракции печени крыс при токсическом гепатите (мкмоль НАДН/мин на г ткани, п - кол-во животных)

Фермент Митохондриальная фракция

Интактные животные, n = 40

АД1 пр 0.89± 0.07

АД! обр 6.81±0.61*

Токсический гепатит, n = 18

АД1 пр 1.22±0.10

АД1 обр 0.70±0.10*

* Достоверные изменения между прямой и обратной реакциями фермента,р > 0.05.

У животных с экспериментальным токсическим гепатитом наблюдается другая метаболическая картина, когда активность АДГ в обратной реакции становится в 1.7 раза меньше, чем в прямой реакции. В данном случае характерно, что при поражении печени алкогольдегидроге-наза в митохондриальной фракции активно окисляет этанол с образованием высокотоксичного ацетальдегида.

Предполагается, что синтезируемые молекулярные формы алкогольдегидрогеназы у ин-тактных животных и животных с токсическим гепатитом отличаются друг от друга. Для выяснения этого нами были изучены кинетические свойства АДГ в митохондриальной фракции печени.

В табл. 2 приведены кинетические показатели АДГ в митохондриальной фракции печени крыс при токсическом гепатите.

Из табл. 2 видно, что у интактных животных сродство к субстратам в обратной реакции АДГ достоверно выше, чем в прямой реакции, в 4.5 раза. При этом максимальная скорость реакции фермента митохондриальной фракции также выше в обратной реакции в 7.4 раза. В результате каталитическая эффективность алко-гольдегидрогеназы в обратной ферментативной реакции также существенно выше, чем в прямой реакции (в 33.5 раза).

Таблица 2

Кинетические показатели АДГ в митохндриальной фракции печени крыс при токсическом гепатите (Кг - мин; Утах - мкмоль НАДН/мин;

Ка - Утлх/К, - мкмоль НАДН/ мин2, п - кол-во животных)

Митохондриальная фракция

Интактные животные, n = 40

Фермент V y max Ка

АД1 пр M±m 1.72±0.26 0.84±0.13

АД1 обр M±m 0.38±0.06* 6.25±0.95*

Токсический гепатит, n = 18

АД1 пр M±m 2.31±0.35 0.83±0.13

АД1 обр M±m 2.68±0.41 0.83±0.10

При токсическом гепатите у животных в митохондриальной фракции кинетические характеристики алкогольдегидрогеназной реакции имеют практически одинаковые значения (табл. 2).

Проведенные исследования кинетических свойств алкогольдегидрогеназы в печени крыс подтверждают, что в результате моделирования экспериментального гепатита, под влиянием четыреххлористого углерода в клетках печени происходят существенные изменения генома, которые приводят к сокращению генетического полиморфизма ферментов, в частности класса оксидоредуктаз [8]. Результатом данных изменений является исчезновение молекулярных форм алкогольдегидрогеназы, обладающих высоким сродством к ацетальдегиду, что приводит к выраженному токсическому эффекту в клетках печени.

Список литературы

1. Saliola M., Getuli C., Mazzoni C. еі al. A new regulatory element mediates ethanol repression of KlADH3, a Kluyveromyces lactis gene coding for a mitochondrial alcohol dehydrogenase // FEMS Yeast Res. 2007. V. 7. N. 5. P. 693-701.

2. Солопаева И.М., Солопаев Б.П. Стимуляция регенерации патолологически измененной печени и

хорионический гонадотропин. Н. Новгород: ННГУ, 1991. 124 с.

3. Финдлей Дж., Эванз У. Биологические мембраны. Методы / Пер. с англ. М.: Мир, 1990. 424 с.

4. Keung W.M., Ho Y.W., Fong W.P. Isolation and characterization of shrew liver alcohol dehydrogenase // Comp. Biochem. and Physiol. B. 1989. V. 93. N. 1. P. 169-173.

5. Koivusalo M., Baumann M., Votila L. Evidence for the identity of glu-tathione - derendent formaldehyde dehydrogenase and class III alcohol dehy-drogenase // FEBS Lett. 1989. V. 257. N. 1. P. 105-109.

6. Зимин Ю.В., Сяткин С.П., Березов Т.Т. Молекулярные механизмы метаболической адаптации патологически измененной печени при токсическом гепатите // Вопросы медицинской химии. 2001. Т. 47. № 3. С. 346-352.

7. Dawson J.M., Heatlic P.L. Lowry method of protein quantification Evidence for Photosensitivity // Anal. Biochem. 1984. V. 140. N. 2. P. 391-393.

8. Couzigou P., Coutelle C., Fleury B., Iron A. Alcohol and aldehyde dehydrogenase genotypes, alcoholism and alcohol related disease // Alcohol Suppl. 1994. N 2. P. 21-27.

KINETIC PROPERTIES OF MITOCHONDRIAL ALCOHOL DEHYDROGENASE IN LIVER CELLS UNDER TOXIC HEPATITIS

A.A. Ulanova, V.N. Krylov, Yu. V. Zimin

Kinetic properties of mitochondrial liver alcohol dehydrogenase under toxic hepatitis have been studied by a new kinetic method. It has been found that under toxic hepatitis there is a significant decrease in enzyme-reaction substrate affinity, mostly in the reverse enzymatic reaction, which leads to an increase in the proportion of highly toxic acetaldehyde in the liver cells.

Keywords: alcohol dehydrogenase, kinetics, mitochondria, toxic hepatitis, biotransformation.