CC BY
106
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 81-87
Изменчивость предпочтения алкоголя у лабораторных мышей в зависимости от генотипа и среды
Е.Ф. Шмидт
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Изучали изменчивость предпочтения алкоголя у лабораторных мышей 15 инбредных линий в зависимости от генотипа и условий содержания. Использовали тест свободного предпочтения 8%-ного этанола. Продолжительность каждой серии опытов составляла 6 недель. Мыши CC57W были «высокопьющими» (9,64 г абсолютного этанола на 1 кг массы тела за 24 часа), также как C57BL/6 (8,06 г/кг) и CC57BR (7,60 г/кг). Мыши DBA/2 (0,23 г/кг) и 101/H (0,29 г/кг) были «низкопьющими». Получение предпочитаемого корма уменьшало склонность к алкоголю у животных всех испытанных генотипов. Наличие в клетке гнездостроительного материала уменьшало потребление этанола у мышей одних линий (C57BR c 7,60 до 3,30 г/кг; TPS с 2,03 до 0,46 г/кг), увеличивало у других (C3HA c 1,00 до 5,25 г/кг; 101/H с 0,29 до 1,65 г/кг) и не оказывало эффекта на третьих (CBA/Lac, WR, BALB/c).
Ключевые слова: мыши, алкоголь, генотип, окружающая среда.
Введение
Исследование изменчивости предпочтения этанола лабораторными животными (в частности, мышами инбредных линий) представляет значительный интерес в связи с изучением биологических основ формирования алкогольной мотивации и алкогольной зависимости, а также для разработки и испытания медицинских препаратов, снижающих влечение к алкоголю.
Для определения склонности к алкоголю обычно используют один из двух поведенческих тестов: потребления или предпочтения. В первом случае животных лишают воды и предоставляют им для питья этанол определённой концентрации, во втором — как этанол, так и воду. Первый тест не вполне корректен, поскольку потребление алкоголя является вынужденным, поэтому для модельных экспериментов желательно использовать тест предпочтения.
Среди эндогенных факторов, обусловливающих отношение лабораторных животных к этанолу, важнейшими являются генетические, половые и возрастные [1,
11, 12]. Существенную роль играет и микрофлора пищеварительного тракта, состав которой в свою очередь зависит от указанных особенностей. Действию экзогенных (средовых) факторов на предпочтение алкоголя также посвящено немало работ, рассматривающих влияние как абиотических (температура, шум), так и биотических (калорийность и состав диет), а также этологических воздействий (изоляционный стресс) [2]. Изучение эффектов экзогенных влияний может быть вполне корректным только при условии использования в эксперименте животных определённых генотипов, так как на одно и то же средовое воздействие различные в генетическом отношении особи реагируют по-разному, причём, нередко, противоположным образом.
Цель данной работы заключалась в оценке изменчивости генетически детерминированного уровня потребления алкоголя у лабораторных мышей инбредных линий в условиях свободного доступа к воде и этанолу (тест предпочтения), а также влияния на него некоторых внутренних и средовых факторов.
Е.Ф. Шмидт
Материалы и методы
Результаты
Исследование проводилось на половозрелых самках в возрасте 2—3 месяцев из коллекционного фонда лабораторных мышей РАМН, содержавшихся в конвенциональных условиях, группами по 5 голов в клетках размером 20 х 15 х 13 см фирмы ВЕ-ЛАЗ. В качестве подстилочного материала применялись древесные опилки. Животные получали полнорационный гранулированный корм в избыточном (неограниченном) количестве. Мышей содержали группами, чтобы исключить воздействие на них изоляционного стресса. По этой причине для опыта были выбраны самки, так как совместное содержание взрослых самцов могло спровоцировать проявления агрессивности. Каждая клетка была оборудована двумя поилками, ёмкостью 300 мл, одну из которых заполняли 8%-ным этиловым спиртом (весовые проценты), а другую — кипячёной водой, подкисленной соляной кислотой (в соответствии с рекомендациями 1СЬА5). Животные имели постоянный свободный доступ к обеим поилкам. Для контроля механического вытекания жидкостей от случайных сотрясений служили пустые клетки, снабжённые такими же ёмкостями.
Продолжительность каждой серии опытов составляла 6 недель. Взвешивания мышей, замеры объёмов жидкостей и заполнение бутылок производили еженедельно, при этом поилки с водой и спиртом меняли местами, так как по некоторым данным у лабораторных грызунов может вырабатываться условный рефлекс на положение сосуда с предпочитаемой жидкостью. Эксперименты выполняли последовательно в течение трёх лет для уменьшения влияния годовых и сезонных колебаний.
Оценку результатов проводили по двум показателям: потреблению алкоголя в граммах 100%-ного этанола на 1 кг массы тела за одни сутки, и по доле 8%-ного этанола от общего объёма потреблённой жидкости (в процентах).
82
Генетическая изменчивость потребления и предпочтения алкоголя (в тесте предпочтения) у мышей 15 инбредных линий с учётом генотипов окраски шерсти и гап-лотипа H-2 показана в табл. 1.
Свободное потребление алкоголя (в пересчёте на 100%-ный этанол) на единицу массы тела за одни сутки колеблется от
0,23 г/кг у мышей DBA/2 до 9,63 г/кг у CC57W, т. е. размах фенотипической изменчивости по данному признаку составляет 9,40 г/кг. Наибольшей внутрилиней-ной вариабельностью отличаются мыши C57BL/6 (о = 1,52) и CC57W (о = 1,34), наименьшей — C3HA (о = 0,01). Таким образом, межлинейная изменчивость потребления этанола (о = 2,92) почти в два раза превышает внутрилинейную. Животных исследованных инбредных линий можно разделить на три условные группы: «сильнопьющие» (потребляющие свыше 6,4 г/кг этанола в сутки), «умереннопьющие» (потребляющие до 6,4 г/кг этанола) и «малопьющие» (потребляющие не более 3,2 г/кг этанола). Границы классов были определены делением уровня потребления этанола у максимально «пьющей» линии на три. Среди «сильно»- и «умереннопьющих» мышей оказалось достоверно больше несущих гаплотип b, чем среди «малопьющих» (метод %2, p < 0,01). Не обнаружено корреляции между потреблением этанола и генами окраски шерсти, хотя аллель a (неагути) чаще встречался у «сильно»- и «умереннопьющих» линий, но разность недостоверна (td = 3,6 < tst = 3,8; p > 0,05).
Межлинейная изменчивость предпочтения алкоголя воде (по доле, которую составлял 8%-ный этанол от общего объёма потреблённой жидкости, выраженной в процентах) варьировала от 2,7 у DBA/2 до 95,5 у CC57W. Наименьшая вариабельность по данному признаку отмечена у мышей I/St (о = 1,3), наибольшая — у WR (о = 21,3),
Таблица 1
Вариабельность потребления и предпочтения алкоголя мышами различных генотипов в тесте предпочтения ^ = 52 группы)
Линия Количество групп Гены окраски шерсти Гаплотип H-2 Потребление (грамм 100%-ного этанола на 1кг массы тела за 1 сутки) Предпочтение (доля 8%-ного этанола от общего объёма выпитой жидкости в %)
CC57W 2 c b, a, b 9,63 ± 0,94 95,5 ± 2,4
C57BL/6 3 a b 8,06 ± 1,03 94,0 ± 1,4
CC57BR 2 a, b b 7,60 ± 0,57 89,5 ± 2,4
BRSUNT 3 a, b j 5,00 ± 0,21 53,3 ± 5,6
C57L 4 a, b, d, ln b 4,69 ± 0,43 48,3 ± 6,1
CBA/Lac 6 + k 4,30 ± 0,51 64,5 ± 6,6
WR 6 a b 3,75 ± 0,75 50,5 ± 8,7
C3H/Sn 2 + k 2,73 ± 0,40 37,0 ± 5,0
BALB/c 6 b, c d 2,47 ± 0,40 34,2 ± 6,2
TPS 4 a k 2,03 ± 0,27 25,0 ± 5,7
SWR 2 c q 1,83 ± 0,33 20,0 ± 2,0
C3HA 2 + k 1,00 ± 0,05 13,0 ± 1,0
I/St 4 a, b, d, p, s j 0,92 ± 0,08 10,5 ± 0,6
101/H 3 AW k 0,29 ± 0,09 2,7 ± 0,9
DBA/2 3 a, b, d d 0,23 ± 0,12 2,7 ± 1,4
межлинейная изменчивость несколько выше (о = 32,05).
Оба показателя (потребления и предпочтения алкоголя) у «сильно»- и «малопьющих линий изменялись прямо пропорционально, тогда как «умереннопьющие» линии по потреблению этанола на 1 кг массы тела располагались в порядке: BRSUNT > C57L > CBA/Lac > WR, а по его предпочтению — CBA/Lac > BRSUNT > WR > C57L.
Доза алкоголя, потребляемого лабораторными мышами в зависимости от продолжительности контакта с ним. Животные разных генотипов отличались по динамике потребления этанола (см. рисунок).
Потребление алкоголя на протяжении эксперимента повышалось у самок четырех из 15 испытанных линий (BALB/c, CBA/Lac, CC57BR, C3HA), снижалась также у четырех (I/St, CC57W, C3H/Sn, BRSUNT) и колебалась незначительно у шести линий (DBA/2, C57BL/6, TPS, WR, 101/H, C57L). Примечательно, что у мы-
шей линии SWR при почти одинаковом потреблении алкоголя в первую и последнюю неделю эксперимента в середине опыта (третья неделя) наблюдался резкий скачок этого показателя в сторону увеличения.
Влияние предпочитаемого корма на потребление этанола. Животным 5 инбредных линий, помимо физиологически сбалансированных гранул, предоставляли излюбленный ими корм — овсяную кашу. Самки всех испытанных линий, получавшие предпочитаемый корм, потребляли меньше этанола, чем мыши, содержавшиеся на стандартной диете (табл. 2). Размах изменчивости в опыте составлял 0,44—3,28 г/кг за 1 сутки, а в контроле 0,97—8,32 г/кг (о = 1,46 и 3,24 соответственно).
Влияние наличия или отсутствия гнездостроительного материала на свободное потребление алкоголя. В клетки, где содержались экспериментальные группы животных, помимо обычного подстилочного материала (древесных опилок), помещали вискозную вату, из которой мыши могли
Е.Ф. Шмидт
строить гнёзда, тогда как в клетках с контрольными группами имелись только опилки. Из табл. 3 видно, что в присутствии гнездостроительного материала потребление этанола уменьшалось у самок 5 ин-бредных линий из 10: CC57W, C57BL/6, CC57BR, C57L и TPS, причём у CC57BR и TPS — статистически достоверно.
За исключением TPS, это мыши «сильнопьющих» линий, родственных по происхождению. Самки двух «малопьющих»
линий 101/H и C3HA, напротив, увеличивали потребление этанола при наличии ваты в клетке (хотя разность значений статистически недостоверна, вероятно, из-за размеров выборки). У мышей трех «умереннопьющих», неродственных друг другу линий CBA/Lac, WR и BALB/c помещение в клетку синтетической ваты не влияло на потребление алкоголя. Изменчивость по данному признаку была несколько ниже при наличии в клетке вис-
CC57W
J_______J WR
«Добровольное» потребление 100%-ного этанола лабораторными мышами инбредных линий
(грамм на 1 кг массы тела за сутки)
Таблица 2
Изменчивость потребления алкоголя в зависимости от предпочитаемых кормов у лабораторных мышей
84
Линия Число опытов Потребление алкоголя (в граммах 100%-ного этанола на 1 кг массы тела) Порог вероятности ошибочных прогнозов
Полнорационные гранулы + предпочитаемый корм Полнорационные гранулы
CC57W 8 3,28 ± 0,94 8,34 ± 0,87
C57BL/6 8 4,23 ± 0,75 7,82 ± 0,43 p < 0,001
CBA/Lac 8 2,82 ± 0,01 4,31 ± 0,51 p < 0,01
BALB/c 9 1,74 ± 0,88 2,47 ± 0,40 p < 0,05
101/H 8 0,44 ± 0,11 0,97 ± 0,55
Таблица 3
Изменчивость потребления алкоголя в зависимости от гнездостроительного материала у лабораторных мышей
Линия Число опытов Потребление алкоголя (в граммах 100%-ного этанола на 1 кг массы тела) Порог вероятности ошибочных прогнозов
Подстилочный + гнездостроительный материал Подстилочный материал
C57BL/6 6 7,54 ± 0,14 8,06 ± 1,03
CC57W 4 7,05 ± 0,58 9,63 ± 0,94
C3HA 4 5,25 ± 1,19 1,00 ± 0,05
C57L 4 4,31 ± 0,90 5,07 ± 0,20
CBA/Lac 6 4,17 ± 0,26 4,44 ± 1,00
WR 6 3,82 ± 0,67 3,67 ± 1,55
CC57BR 5 3,30 ± 1,16 7,60 ± 0,57 p < 0,05
BALB/c 6 2,79 ± 0,20 2,14 ± 0,80
101/H 6 1,65 ± 1,00 0,29 ± 0,09
TPS 8 0,46 ± 0,08 2,03 ± 0,27 p < 0,01
козной ваты, чем в контроле: в первом случае размах изменчивости составлял 1,65—7,05 г/кг, (о = 2,22) , во втором 0,29— 9,63 г/кг, (о =3,18).
Обсуждение результатов
Связь между генотипом лабораторных мышей и склонностью к добровольному потреблению этанола установлена давно [9]. Полигенная природа алкоголизма у человека и животных подтверждается современными исследованиями по картированию генов, детерминирующих определённые аспекты отношения к алкоголю. Такие гены обнаружены на всех хромосомах мыши, кроме 2, 5, 12, 13 и Х-й хромосомы [15]. Особенно сильное влияние на предпочтение этанола оказывают гены, расположенные на 15-й хромосоме мыши [8]. Наши данные согласуются с мнением о существенной роли главного локуса гистосовместимости мышей (или тесно сцепленных с ним генов) в предрасположенности к потреблению алкоголя [4].
Оценка отношения животных к алко-
голю по доле этанола в общем объёме выпитой ими жидкости оказалась недостаточно информативной (см. табл. 1). Причина этого, вероятно, заключается в том, что мыши разных инбредных линий поглощают различное количество жидкости на единицу массы тела. Так, например, самки линии C57L выпивали за сутки 130,00 ± 6,36 мг/кг жидкости, а самки CBA/Lac — 87,92 ± 2,92 мг/кг (разность достоверна при p < 0,001).
Анализ кривых потребления алкоголя от продолжительности контакта с ним показал, что данная функция не является линейной и, следовательно, процесс привыкания к этанолу достаточно сложен. Это подтверждается множеством современных работ, описывающих биохимические механизмы формирования алкогольной зависимости. Однако единства мнений по данному вопросу нет, так одни исследователи отводят большую роль метаболизму триптофана и серотонина в развитии пристрастия к алкоголю [6], тогда как другие влияния этих веществ не обнаруживают [3]. Есть основания, позволяющие пред-
Е.Ф. Шмидт
положить, что значительный вклад в предрасположенность к потреблению этанола может вызывать генетический полиморфизм каппа-опиоидных рецепторов [14].
Интересно, что дополнительное предоставление экспериментальным животным «лакомства» в виде предпочитаемой ими овсяной каши, снижало потребление алкоголя у мышей всех испытанных линий. Причём снижение потребления этанола в опыте прямо коррелировало с уровнем его потребления животными данной линии в контроле (см. пороги вероятностей ошибочных прогнозов). Поскольку мышам из контрольных групп полноценные в пищевом отношении гранулы предоставлялись в неограниченном количестве, такой эффект нельзя объяснить исключительно энергетическими или физиологическими причинами. Вероятно, возможность потреблять предпочитаемый корм психологически отвлекает животных от этанола, препятствуя выработке алкогольной мотивации, причём тем сильней, чем более выражена у них склонность к приёму алкоголя. Это означает, что замена отдельных ингредиентов в рационе другими, физиологически равноценными, может стать причиной искажения результатов эксперимента.
Наиболее парадоксальными оказались результаты экспериментов с предоставлением лабораторным мышам гнездостроительного материала. Если бы животные всех или большинства генотипов ответили на него снижением потребления алкоголя, это можно было бы объяснить уменьшением теплоотдачи за счёт термосберегающих свойств ваты. Однако, как уже отмечалось, мыши разных инбредных линий продемонстрировали весь спектр возможных реакций — от отсутствия какой-либо реакции до чётко выраженного и статистически достоверного «плюс»- и «минус»-эффекта. Можно предположить, что для мышей одних генотипов отсутствие убежища или невозможность реализовать гнездостроительный инстинкт является стрессом, вызывающим
86
усиленное потребление этанола [13], тогда как для животных других линий более значительным стрессом оказывается появление в клетке незнакомого предмета, что также приводит к возрастанию алкогольной мотивации [5].
Перспективы изучения основ формирования алкогольной зависимости и алкогольной мотивации у человека и животных в дальнейшем, по-видимому, будут связаны с широким использованием в модельных экспериментах трансгенных и но-каутных мышей [7].
Выводы
1. Изменчивость свободного потребления алкоголя определяется в первую очередь генотипом животного, поскольку генетически детерминированная межлинейная вариабельность по данному признаку превышает внутрилинейную, обусловленную неконтролируемыми флуктуациями среды и физиологического состояния организма.
2. Прослеживается связь между высоким потреблением этанола и гаплотипом b у лабораторных мышей.
3. Уровень потребления алкоголя мышами зависит от продолжительности контакта с ним, а динамика этого показателя во времени является специфической для каждой инбредной линии.
4. Предоставление предпочитаемого корма уменьшает влечение к этанолу у животных всех испытанных генотипов.
5. Помещение в клетку гнездостроительного материала снижает потребление спирта у мышей одних линий, повышает его у других и не оказывает влияния на третьих.
6. Для моделирования развития алкоголизма у человека, с учётом социальных аспектов, целесообразно использовать мышей линий CC57BR, TPS и, возможно, C3HA, так как количество добровольно потребляемого ими этанола напрямую зависит от неблагоприятных условий содержания.
4.
7.
Литература
Андронова Л.М., Барков Н.К. Особенности формирования и течения экспериментального хронического алкоголизма в зависимости от пола. Фармакол. и токсикол., 1979, т. 42, № 1, с. 71-76.
Буров Ю.В., Власова Н.В., Родионов А.П. Влияние изоляционного стресса на фармакогенетику этанола в крови крыс. Бюлл. эк-сперим. биол. и мед., 1984, № 9, с. 320-321. Каледин В.И., Климова Н.В., Васильев Г.Б., Иванова Е.А., Васильева Е.Д., Ильницкая С.И. Изучение предрасположенности к алкоголизму, активности триптофаноксиге-назы и структуры интрона 6 соответствующего гена у мышей линий C57BL/6, CC57BR/Mv и BALB/c. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 2003, т. 136, № 10, с. 435-437. Шошина С.В., Майский А.И. Главная система гистосовместимости мышей (Н-2) и реакции организма на этанол. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1982, т. 94, № 7, с. 55-58. van Abeelen J.H.F. Genetic analysis of behavioural responses to novelty in mice. Nature, 1975, v. 254, No. 5497-5, 239-41.
Badawy A.A Tryptophan metabolism in alcoholism. Adv. Exp. Med. Biol., 1999, 467, 265-74. Bowers B.J. Applications of transgenic and knockout mice in alcohol research. Alcohol Res. Health, 2000, 24(3): p. 175-84.
8. Browman K.E., Crabbe J.C. Quantitative trait loci affecting ethanol sensivity in BXD recombinant inbred mice. Alcohol Clin. Exp. Res., 2000, Jan, 24(1), 17-23.
9. Crabbe J.C. Sensitivity to ethanol in inbred mice: genotypic correlations among several behavioural responses. Behav. Neurosci., 1983, 97, 280-89.
10. Deitrich R.A., Bludeau P., Erwin V.G. Phenotypic and genotypic relationships between ethanol tolerance and sensitivity in mice selectively bred initial sensitivity to ethanol (SS and LS) or development of acute tolerance (HAFT and LAFT). Alcohol Clin. Exp. Res., 2000, May, 24(5), 595-604.
11. Fuller J.L., Collins R.L. Ethanol consumption and preference in mice: a genetic analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1972, v. 197, 42-48.
12. Grieve S.J., Littleton J.M. Age and strain differences in the rate of development of functional tolerance to ethanol by mice. J. Pharm. and Pharmacol., 1979, v. 31, No. 10, 696-700.
13. Heyman G.M. An economic approach to animal models of alcoholism. Alcohol Res. Health, 2000, 24(2), 132-39.
14. Vadasz C., Saito M., Gyetvai B. et al. Scanning of five chromosomes for alcohol consumption loci. Alcohol, 2000, Aug., 22(1), 25-34.
15. Vadasz C., Saito M., Balla A. et al. Mapping of quantitative trait loci for ethanol preference in quasi-congenic strains. Alcohol, 2000, Feb., 20(2), 161-71.
2.
5.
6.
THE VARIABILITY OF ALCOHOL PREFERENCE IN LABORATORY MICE ACCORDING TO THEIR GENOTYPE AND ENVIRONMENT
E.F. Schmidt
Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
The variability of alcohol (8%-ethanol) preference in laboratory mice of 15 inbred strains according to their genotype and environment was studied. It appeared that CC57W mice were “high-drinking” (9.63 g of absolute ethanol per 1 kg of body weight for 24 h), along with C57BL/6 (8.06 g/kg) and CC57BR (7.60 g/kg) mice, whereas DBA/2 (0.23 g/kg) and 101/H (0.29 g/kg) mice were “low-drinking”. Preferable food decreased inclination to alcohol in animals of all genotypes tested. The presence of nest-building material in cage decreased ethanol consumption in some groups of mice strains (CC57BR — from 7.60 g/kg to 3.30 g/kg, TPS — from 2.03 g/kg to 0.46 g/kg), or increased it in the other groups (C3HA — from 1.00 g/kg to 5.25 g/kg, 101/H — from 0.29 g/kg to 1.65 g/kg), or had no effect in the rest groups (CBA/Lac, WR, BALB/c).
Key words: mice, alcohol, genotype, environment.
