CC BY
95
&
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 67-75
БИОМОДЕЛИРОВАНИЕ
Новые биомодели для оценки высоковирулентных штаммов чумы Yersinia pestis
В.Н. Каркищенко, Е.В. Брайцева
Институт новых технологий РАМН, Москва
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
В связи с необходимостью унификации использования биологических моделей при испытании возбудителей чумы был проведен ряд экспериментов на лабораторных мышах. Были выполнены исследования по чувствительности мышей инбредных линий BALB/c, C57BL/6. СВАДас, DBA/2 и гибридов F1(CBAхB6) и F1(B6хDBA/2) к возбудителю чумы У. рввйв. В экспериментах использовали классический штамм возбудителя чумы У. рввйв 231, высоковирулентный для нелинейных мышей и гибридов. Группой сравнения служили нелинейные мыши из питомника «Андреевка». Полученные данные выявили меньшую по сравнению с нелинейными мышами чувствительность к возбудителю чумы гибридных мышей. Оценивалась средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей после заражения. Средняя продолжительность жизни павших мышей всех линий, за исключением BALB/c была существенно больше при заражении малыми дозами. Резких отклонений от показателей, полученных в контроле, выявлено не было. Мыши всех испытанных линий оказались чувствительны к использованному высоковирулентному штамму чумного микроба, однако, величина LD50 для гибридов была на порядок меньше. Ещё большей оказалась величина LD50 для мышей линии BALB/c. Отличия статистически достоверны.
Ключевые слова: чума, штамм У. рввйв 231, вирулентность, гибриды.
Поиск животных-биомоделей для оценки эффектов чумы (Yersinia pestis) предопределен разной чувствительностью к Yersinia pestis грызунов, носителей возбудителя. Учитывая, что в общую картину развития чумы основной вклад вносит экзотоксин FII или «мышиный токсин» [1, 4, 8, 9], представляло интерес провести исследование наиболее вирулентного штамма Y. pestis 231 на линейных мышах BALB/c, C57BL/6, CBA/Lac, DBA/2 и гибридах F1(CBAxC57BL/6) и F1(C57BL/6xDBA/2). Характерной особенностью «мышиного» токсина является его особенность поражать лабораторных мышей и крыс (табл.1), но не морских свинок. В то же время морские свинки более чувствительны к эндотоксину FI Y. pestis, содержащему липополисахариды (ЛПС I и II) в сильно агрегированном состоянии [4, 5, 6, 7].
Известно [2], что белки «мышиного» токсина, входящие в состав мембран, и липополисахариды эндотоксина образуют единый токсический комплекс Y. pestis в организме чувствительного к чуме хозяина [1, 2, 10, 11].
Поиск оптимальных биомоделей для исследования вакцинных и противомик-робных препаратов в отношении чумного микроба определяется тем, что в природе имеются не только капсульные, но и вирулентные бескапсульные штаммы этого возбудителя. Последние направляют иммунные реакции в химерном направлении, уходя от иммунологического контроля. Это определяет необходимость поиска оптимальных биологических моделей [3] для исследования и стандартизации вирулентности возбудителя чумы.
В.Н. Каркищенко, Е.В. Брайцева
Таблица 1
Показатели физиологических изменений в организме мышей под влиянием чумных «мышиного» экзотоксина и эндотоксина [1]
Показатели «Мышиный» токсин Эндотоксин Инфекционный процесс
LD50 0,1-3 мкг 300-10000 мкг 1 клетка в организме мыши размножается до 1-10 млрд. клеток
Время гибели Спустя 8-9 ч Спустя 12-15 ч 2-5 дней в зависимости от величины заражающей дозы
Патология Мелкие сосудистые расстройства в мозге, легких, брюшине Тяжелые сосудистые расстройства и геморрагии во многих органах Множество бактерий в сосудах с геморрагиями и некрозами во внутренних органах
Содержание животных и работа с ними
Животные содержались по 10 голов в клетках и наблюдались в течение 10 дней. За этот период мыши F1(CBAxB6), F1(B6xDBA/2), BALB/c, C57BL/6, CBA/Lac и DBA/2 хорошо перенесли адаптационный период: были клинически здоровы, активны, павших не было. После адаптации животные были размеще ны и промаркированы в соответствии с условиями эксперимента.
Вся работа по содержанию экспериментальных животных и уходу за ними строилась в соответствии с распорядком дня и утвержденным регламентом. Под распорядком дня подразумевается: санитарная обработка помещений и оборудования, раздача кормов, проведение экспериментальных работ и манипуляций. Уход, содержание, заражение, текущая и заключительная дезинфекция, кремация павших и вышедших из опыта инфицированных животных проводилась в соответствии с СП 1.2.011-04 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности».
Для содержания биопробных животных использовалось клеточное оборудование итальянской фирмы ТесИшр^^ обеспечивающее требуемые комфортные и
68
санитарно-гигиенические условия содержания животных. Смена чистых, заранее дезинфицированных клеток, стерильного подстилочного материала, кормушек и поилок проводилась 2 раза в неделю как для интактных, так и для зараженных животных.
Раздача кормов и поение лабораторных мышей осуществлялось только после окончания текущей дезинфекции помещений или смены клеток и выноса их в моечно-дезинфекционное отделение.
В течение всего эксперимента проводился ежедневный контроль условий содержания животных. На требуемом уровне поддерживались все основные показатели микроклимата: температура воздуха 20—22 ОС, относительная влажность воздуха 50—55 %, скорость движения воздуха 0,1—0,2 м/сек, кратность воздухообмена в клетках содержания инфицированных животных составляла 5—7 м3/час.
Кормление биопробных животных осуществлялось в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР № 1179 от 10.10.1983 г Учитывая, что в эксперименте использовались мыши F1(CBAxB6), помимо основного гранулированного корма ПК 120-3, в рацион питания этих животных были
включены дополнительные ингредиенты. Таким образом, в ежедневный рацион питания из расчёта на одну мышь входили: гранулированный комбикорм — 11,0 г, морковь — 2,8 г, творог — 2,0 г, мясо (говядина отварная) — 0,5 г. Перед кормлением экспериментальных животных гранулированный корм ПК 120-3 подвергался стерилизации при температуре 121 ОС в течение 20 минут. Питьевая вода проходила очистку и стерилизацию через прямоточную установку СТЭЛ-4Н производства НПО «Экран».
Исследования чувствительности ин-бредных и гибридных линий мышей к возбудителю чумы У. pestis выполнены на базе лаборатории Ростовского научно-исследовательского противочумного института.
В экспериментах использовали классический штамм возбудителя чумы У. pestis 231, высоковирулентный для лабораторных мышей и морских свинок. Для мышей в различных опытах определялась LD5Q в пределах 3—6 КОЕ при подкожном введении бактерий. Бактерии штамма периодически пассируются через организм чувствительных к чуме экспериментальных животных для поддержания вирулентности на высоком уровне и сохранения однородности популяции по детерминантам вирулентности. Данный штамм содержит все три типичные для классического чумного микроба плазмиды (табл. 2).
Многочисленными исследованиями установлена связь между патогенностью или
вирулентностью чумного микроба с плазмидами. Что касается возбудителя Уре81!8, то он экспрессирует известные основные детерминанты вирулентности (табл. 3).
Заражение экспериментальных животных
Чувствительность к возбудителю чумы определяли у мышей инбредных линий БЛЬБ/о, C57BL/6, СБАДас, DBA/2 и гибридов F1(CБЛхБ6) и F1(B6х DBA/2), имеющих соответствующие сертификаты качества. Группой сравнения служили нелинейные мыши. Условия содержания и кормления экспериментальных животных описаны выше.
Заражение проводили подкожно в правую заднюю лапку различными дозами бактерий указанного выше штамма, выращенных на агаре LB (18 час при 28 ОС).
Взвесь бактерий готовили в физиологическом растворе, содержащем фосфатный буфер М/30 для поддержания рН 7,2. Из исходной взвеси (109 м.к.), приготовленной по стандарту мутности (методика НИИЭМ им. Гамалеи) готовили ряд десятикратных разведений для получения рабочих взвесей, которые содержали требуемые заражающие дозы в 0,1 мл. Параллельно определяли процент клеток, способных образовывать колонии (КОЕ). Их подсчитывали после посева на 5 чашечек того же агара LB по 100 м.к. (по стандарту мутности).
— Таблица 2 Плазмиды чумного микроба и кодируемые ими свойства [1]
Плазмида Мол.м. (мД) Кодируемые свойства
— рРв1 6 Пестициногенность, фибринолизин, плазмо-коагулазар
Са<3 47 Зависимость от кальция, синтез VWa и других поверхностных белковр
Fra 61-65 FI, «мышиный» токсин
В.Н. Каркищенко, Е.В. Брайцева
Таблица 3
Оценка чувствительности лабораторных мышей разных генотипов к бактериям высоковирулентного штамма возбудителя чумы по величине LD50, летальному эффекту и средней продолжительности жизни павших животных
5 3 2 2 Доза заражения по стандарту мутности, м.к. Доза заражения, КОЕ Число павших мышей из 10 заражённых Средняя продолжительность жизни павших (СПЖ), сутки Всего павших из 50 заражённых Е О К о ю о —I е и н е т а н М
F1( СВАхВб) 10 4,6 2 7,0
102 4,6х01 9 6,8 38 23
103 4,6х102 7 6,7 (76%) (9,1 - 57,8)
104 4,6х103 10 4,4
105 4,6х104 10 4,2
F1(B6хDBA/2) 10 4,6 2 10
102 4,6х101 7 6,8 35 72,2
103 4,6х102 6 6,3 (70%) (30 - 183,1)
104 4,6х103 9 5,8
105 4,6х104 9 4,0
BALB/c 10 4,6 1 5,0
102 4,6х101 8 6,1 39 18,3
103 4,6х102 10 5,8 (78%) (7,3 - 46)
104 4,6х103 10 4,3
105 4,6х104 10 4,2
C57BL/6 10 4,6 8 8,1
102 4,6х101 9 7,2 46 3,6
103 4,6х102 9 5,2 (92%) (1,4 - 9,1
104 4,6х103 10 4,4
105 4,6х104 10 3,6
СВАДас 10 4,6 5 8,6
102 4,6х101 9 7,2 44 5,8
103 4,6х102 10 5,3 (88%) (2,3 - 14,5)
104 4,6х103 10 4,3
105 4,6х104 10 3,2
DBA/2 10 4,6 7 8,1
102 4,6х101 10 7,1 47 2,3
103 4,6х102 10 5,5 (94%) (1 - 7,3)
104 4,6х103 10 5,8
105 4,6х104 10 6,0
Нелинейные 10 4,2 8 9,5
102 4,2х101 10 6,7 48 2,1
103 4,2х102 10 4,4 (86%) (1 - 5,8)
104 4,2х103 10 4,1
105 4,2х104 10 3,9
70
Подсчёт колоний производили на вторые и, окончательно, на третьи сутки после инкубации посевов при 28 ОС. Математические средние показатели числа выросших колоний определяли по результатам подсчёта всех 5 посевов.
Оценка вирулентности Y. pestis 231
При сравнительных исследованиях была определена вирулентность Yersinia pestis 231 (фенотип Fra+, Tox+, Lcr+, Pst+, Pla+, Pgm+, pH6+) для нелинейных мышей и гибридов F1(CBAxB6) из филиала «Анд-реевка» НЦБМТ РАМН. С этой целью мышей заражали суспензией суточной (28 ОС) агаровой культуры подкожно в дозах 5-10-20-40-80-160 м.к. по стандарту мутности ОСО 42-28-85-ОЗП. Для инфицирования использовали по 4, 6 или 10 мышей в каждой группе. За животными наблюдали в течение 14 суток. Павших животных вскрывали с посевом органов и тканей на пластины агара Хоттингера рН 7,1±0,1. У всех мышей наблюдали генерализацию процесса с выделением культур Y. pestis 231 из региональных лимфатических узлов, селезёнки, печени, крови, лёгких. Оценивалась средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей после заражения (табл. 4). Расчёт значений ЛД50 проводили по формуле Кербера в модифика-
ции И.П.Ашмарина и А.А.Воробьёва (1962). Результаты представлены в табл. 4. Значение LD5Q, доверительный интервал м.к. 7 (1 ... 22), соответствовало 3 КОЕ.
Данные опыта свидетельствуют о высокой степени вирулентности использованной нами субкультуры Y. pestis 231. В дальнейшем в эксперимент были взяты партии гибридных F1(CBAxB6) и нелинейных мышей. Сразу же после завершения адаптации животные из обеих групп были заражены теми же дозами Y. pestis 231 (из одной суспензии). Использовали субкультуру, выделенную из нелинейной мыши предыдущего опыта. Результаты представлены в табл. 4 и 5.
Полученные данные выявили меньшую по сравнению с нелинейными мышами чувствительность к возбудителю чумы гибридных мышей. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в значениях LD5Q, в группах гибридных мышей полной гибели животных в зависимости от увеличения заражающей дозы возбудителя чумы (40-80-160 м.к.) не наблюдали.
Культуру, выделенную от гибрида, зараженного 20 м.к. (по мутности), вновь использовали для инфицирования мышей F1(CBAxВ6), в дозах 80-160-320-6401280 м.к. (по стандарту мутности). Результаты представлены в табл. 6.
Таблица 4
Вирулентность Y. pestis 231 для нелинейных мышей
Заражающая доза по стандарту мутности, м.к. Число павших мышей из 4 зараженных СПЖ, сутки Значение LD50, доверительный интервал, м.к.
5 2 6,0
10 3 7,0
20 3 9,0 7 (1 ... 22), что соответство-
40 4 6,0 вало ~3 КОЕ
80 4 5,7
160 4 6,5
В.Н. Каркищенко, Е.В. Брайцева
Пассирование У. pestis 231 через организм гибрида не привело к повышению вирулентности для этого вида животных: от 1280 м.к. пала лишь одна мышь.
В связи с этим проведено сравнительное изучение вирулентности субкультуры У pestis 231, прошедшей двукратное пассирование через организм беспородных мышей при малых заражающих дозах. Для инфицирования использовали дозы 2Т01,
2-102, 2• 103, 2-104 м.к. (по стандарту мут-
ности). На каждую инфицирующую дозу брали по 6 гибридных и белых мышей. Результаты представлены в табл. 7.
Как видно из табл. 7, падёж гибридов по мере увеличения заражающих доз оказался ровнее, хотя одно животное, из 6 взятых для дозы 2-104 м.к. (по мутности), не пало. При вскрытии всех выживших гибридов на 14-е сутки после заражения (регионарный лимфоузел, селезёнка, печень, кровь, лёгкое) культур чумного микроба выделено не было.
Таблица 5
Сравнительная характеристика вирулентности У. реяйя 231 для нелинейных мышей
и гибридов F1(CBAxB6)
Заражающая доза по стандарту мутности м.к. Число павших мышей из 6 заражённых СПЖ, сутки Значение LD50, доверительный интервал, м.к. Число павших мышей из 6 заражённых и к т & Ж, П С Значение LD50, доверительный интервал, м.к.
Нелинейные мыши Гибриды F1(CBAxB6)
5 2 4,5 0 —
10 3 7,0 3 10,3
20 3 6,3 11 (3 ... 35) по мутности, 6 7,7 25 (8 . 80) по мутности,
40 [6] 5,0 что соответствовало [4] 5,2 что соответствовало
~ 4 КОЕ ~ 10 КОЕ
80 [6] 4,7 [3] 4,7
160 [6] 4,6 [3] 5,3
Таблица 6
Вирулентность У. рestis 231 (от гибрида) для мышей F1(CBAxB6)
Заражающая доза по стандарту мутности, м.к. Число павших мышей из 6 зараженных СПЖ, сутки Значение ЬЭ50, доверительный интервал, м.к.
80 5 6,6
160 3 7,0 160 (50 ... 500), что соответ-
320 6 7,5 ствовало ~10 КОЕ
640 6 6,6
1280 [1] 7,0
72
I I I I I
Наблюдение за животными проводили в течение 15 суток. Павших вскрывали, контролируя патанатомическую картину, делали высевы на агар крови сердца. Посевы выращивали при 28 ОС в течении 2-3 суток. Выросшие культуры проверяли на чистоту визуально микроскопически и диагностическим тестом.
LD5Q (или MLD) определяли, как принято, по формуле:
lgLD5Q = lgDN — о ( 'LLi — 0,5) п,
где: N — общее число испытанных доз; п — общее число животных, которым введена каждая доза;
о — логарифм кратности испытанных доз;
Таблица 7
Вирулентность У. реяйя 231 для нелинейных мышей и гибридов F1(CBAxB6)
Заражающая доза по стандарту мутности м.к. Число павших мышей из 6 заражённых СПЖ, сутки Значение ЬРзо, доверительный интервал, м.к. Число павших мышей из 6 заражённых и к т £ И П С начение LD50, доверительный
Нелинейные мыши Гибриды F1(CBAxB6)
2101 3 б,7 4 10,2
2102 [б] 4,7 20 (2 ... 40) по мутности, [3] 5,3 63 (16 ... 200) по мутности,
2103 б 4,1 что соответствовало б 7,8 что соответствовало
~ 8 КОЕ ~ 25 КОЕ
2104 [б] 3,9 [5] 4,б
Таблица 8
Средняя продолжительность жизни лабораторных мышей в зависимости от дозы заражения Y.pestis
Доза заражения, ЬО50 Контроль (нелинейные) F1(CBAxB6) /2) A/ B D X 6 £ 1 F BALB/c C57BL/6 CBA/Lac DBA/2
1 % к контролю 9,5 100 7,0 73,7 10,0 105,3 5,0 52,7 8,1 85,3 8,б 90,5 8,1 85,3
10 6,7 б,8 б,8 б,1 7,2 7,2 7,1
% к контролю 100 101,5 101,5 91,0 107,5 107,5 105,8
— 102 4,4 б,7 б,3 5,8 5,2 5,3 5,5
— % к контролю 100 152,8 143,2 131,9 118,2 120,5 125,0
103 3,9 4,2 4,0 4,2 3,б 3,2 б,0
% к контролю 100 102,4 102,б 107,7 92,3 82,0 153,8
Средний 5,7 5,8 б,0 5,1 5,7 5,7 б,5
показатель и % по всем дозам 100 101,8 105,3 89,5 100 100 114,0
В.Н. Каркищенко, Е.В. Брайцева
Ы — отношение числа животных, погибших от данной дозы, к общему числу животных, которым введена данная доза; DN — максимальная доза (105 м.к.).
Итоги титрования средней летальной дозы представлены в табл. 6 и 7 и в сводной табл. 8.
Мыши всех испытанных линий оказались чувствительны к использованному восоковирулентному штамму чумного микроба, однако величина LD5Q для гибридных мышей была на порядок меньше. Отличия статистически достоверны. Несколько большей оказалась величина LD5Q для мышей линии БЛЬБ/е.
Патоморфологическая картина у животных-биомоделей
Патанатомическая картина была практически одинакова у всех павших мышей, независимо от принадлежности к линии, и такой же, как у нелинейных мышей, и типичной для чумной инфекции у этих грызунов. Именно у мышей, павших на
3-4-е сутки, обнаружили в месте введения гиперемию подкожной клетчатки и кровоизлияния, сильно увеличенный региональный лимфоузел, увеличенную печень, суховатую на разрезе, сильно увеличенную полнокровную селезёнку, ги-перемированные лёгкие с очагами геморрагий. У павших на 6-е сутки и позже зарегистрированы дополнительные изменения в виде появления в паренхиме селезёнки некротических «просяных» зёрен. Особенностью мышей F1(CBAxB6) и СБЛ/2 было наличие у павших животных серозной жидкости в брюшинной полости.
От всех павших мышей из всех органов выделены культуры возбудителя чумы инфицирующего штамма, что свидетельствует об интенсивной септицемии. Средняя продолжительность жизни павших животных всех генотипов, за исключением BALB/c, была несколько больше при
74
заражении малыми дозами. Резких отклонений от показателей, полученных в контроле, выявлено не было.
Летальный эффект чумного микроба без учёта инфицирующей дозы использованного штамма был наименьшим в отношении гибридов F1(B6xDBA/2). Для мышей F1(CBAxB6) и BALB/c он казался лишь несколько ниже контрольного.
Литература
Домарадский И.В. Чума, М.: Медицина, 1998.
Зюзина В., Демидова Г., Плесцитная А. Реализация токсических свойств капсульным веществом Yersinia pestis. Материалы 7-го съезда Всерос. о-ва эпидемиол., микробиол., паразитол. М., 1997, с. 293-294. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. М.: Изд. ВПК, 2004.
Наумов А.В., Кузьмиченко И.А., Тарасенко Т.И. Биохимические аспекты патогенности возбудителя чумы. Мед. паразитол., № 4, 1995, с. 17-22.
Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид Yersinia pestis, детерминирующих синтез пе-стицина 1, фракции 1 и «мышиного» токсина. Генетика. 1983, т. 19, с. 1081-1090. Bennet L., Tornabene T. Characterization of the antigenic subunits of envelope protein of Yersinia pestis. J.Bacteriol. 1974, v. 177, 48-55. Giardi J., McGhee J., Keith M. Summary and recommendations for future research. In.: Genetically engineered vaccines. N.Y.- London: Plenum Press, 1992, p. 301-314.
Holmstrom A. Identification and characterization of novel virulence determinant of Yersinia pseudotuberculosis: a possible role for YorK in regulating translocation. Lisentiate thesis. Ulmea, 1995.
Hurtrel B.J., Alonso M., Lagrange P., Hutrel M. Delaued-type hypersensitivity and acquired resistance to plague in mice immunized with killed Yersinia pestis and immunoregulators. Immunology, 1981, v. 44, 297-304.
10. Leary S., Williamson E., Griffit K. et al. Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects against plague. Infect. and Immun, 1995, v. 63, 2854-2858.
11. Nakajama R., Motin V., Brubaker R. Supression of cytokines in mice by protein A-, V-antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization. Infect. and Immun., 1995, v. 63, 3021-3029.
NEW BIOMODELS FOR ESTIMATION OF HIGH VIRULENT STRAIN OF YERSINIA PESTIS PLAGUE
V.N. Karkischenko, E.V. Braitseva
Institute of New Technologies of RAMS Research Center for Biomedical Technologies of RAMS
BALB/c, C57BL/6, CBA/Lac and DBA/2 mice, F1(CBAxC57BL/6) and F1(C57BL/6xDBA/2) hybrids were examined for sensitiveness to the pathogenic organism of plague (strain Y. pestis 231). The sensitiveness of nonlinear outbred mice was lesser than that of hybrid mice. At infection of small doses, the average length of life of died mice of all strains, except BALB/c, was longer. Mice of all strains were sensitive to the high virulent strain of plague microbe, but the LD50 value for the hybrid mice was one order lower, and the LD50 value for BALB/c was higher. This difference is statistically reliable.
Key words: plague, Y. pestis 231 strain , virulent, hybrids.
