ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОМА ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬ ТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ДО НАЧАЛА И В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ ТЕКУЩЕЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

https://doi.org/10.17116/molgen20213902125

Изменчивость генома холерных вибрионов Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии холеры

© Н.И. СМИРНОВА, Д.В. БАДАНИН, Д.А. РЫБАЛЬЧЕНКО, Я.М. КРАСНОВ, А.А. КРИЦКИЙ, Ю.В. ЛОЗОВСКИЙ, А.В. ФЕДОРОВ, В.В. КУТЫРЕВ

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», Саратов, Россия РЕЗЮМЕ

Введение. Нестабильность генома возбудителя холеры приводит к появлению его новых вариантов с измененными эпидемически значимыми свойствами. Это определяет актуальность исследования динамики изменений структуры генов пато-генности и персистенции холерных вибрионов, выделенных через длительные периоды времени.

Материал и методы. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов 44 токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии, среди которых 29 было выявлено в России. Для SNP-типирования использовали алгоритм Байесовского эволюционного анализа с применением программы BEAST v2.5.1.

Результаты и обсуждение. На основе SNP-анализа показано, что занос эпидемически опасных штаммов в Россию (1970— 2014 гг.) совпадал с временным периодом трех различных волн глобального распространения холеры в мире. Сравнение нуклеотидных последовательностей участков генома холерных вибрионов, определяющих вирулентность и способность к эпидемическому распространению, подтвердило многоступенчатость и быстроту их изменения. Впервые установлено, что геномы островов патогенности VPI-1 и VPI-2 предпандемических штаммов содержат различные мутации, которые отличают их от генома пандемических штаммов. В то же время выявлена консервативность нуклеотидной последовательности всех изученных генов персистенции из VPI-2 и EPI пандемических изолятов. Напротив, у современных нетоксигенных штаммов ctxAtcpA- обнаружена существенная вариабельность генов персистенции, входящих в состав этих мобильных элементов. Заключение. Новые данные о структуре участков генома холерных вибрионов, связанных с персистенцией, могут быть использованы для дифференциации холерных вибрионов с разной эпидемической значимостью.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, полногеномная последовательность, биоинформационный анализ, мобильные элементы, гены вирулентности и персистенции.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Смирнова Н.И. — https://orcid.org/0000-0002-7115-6286; e-mail: rusrapi@microbe.ru Баданин Д.В. — https://orcid.org/0000-0002-9662-8438; e-mail: rusrapi@microbe.ru Рыбальченко Д.А. — https://orcid.org/0000-0002-3117-8229; e-mail: rusrapi@microbe.ru Краснов Я.М. — https://orcid.org/0000-0002-4909-2394; e-mail: rusrapi@microbe.ru Крицкий А.А. — https://orcid.org/0000-0002-5506-4285; e-mail: rusrapi@microbe.ru Лозовский Ю.В. — https://orcid.org/0000-0003-4382-7254; e-mail: rusrapi@microbe.ru Федоров А.В. — https://orcid.org/0000-0001-7190-4427; e-mail: rusrapi@microbe.ru Кутырев В.В. — https://orcid.org/0000-0003-3788-3452; e-mail: rusrapi@microbe.ru Автор, ответственный за переписку: Смирнова Н.И. — e-mail: rusrapi@microbe.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Смирнова Н.И., Баданин Д.В., Рыбальченко Д.А., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Федоров А.В., Кутырев В.В. Изменчивость генома холерных вибрионов Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021;39(2):25—37. https://doi.org/10.17116/molgen20213902125

Variability of the genome of El Tor cholera vibrios isolated before the onset and in different periods of the current pandemic

© N.I. SMIRNOVA, D.V. BADANIN, D.A. RYBAL'CHENKO, YA.M. KRASNOV, A.A. KRITSKY, YU.V. LOZOVSKY, A.V. FEDOROV, V.V. KUTYREV

FGHI Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia ABSTRACT

Introduction. Genome instability of the cholera agent leads to emergence of its new variants with altered epidemically significant features. It determines the relevance of investigation of the dynamics in pathogenicity gene structure and cholera vibrio persistence changes over extended periods of time.

Materials and methods. Bioinformatic analysis of whole genome nucleotide sequences of 44 toxigenic and non-toxigenic V. cholerae O1 strains, biovar El Tor, isolated before the onset and in different periods of the current pandemic, out of which 29 were found in Russia. SNP-typing applying Bayesian evolutionary analysis, using BEAST v2.5.1 software package. Results and discussion. Based on SNP-analysis, it was demonstrated that importation of epidemically hazardous strains into the territory of Russia (1970—2014) overlapped with three different waves of global spread of cholera across the world. Nucleotide sequence comparison of genomic regions, defying their virulence and ability to spread epidemically confirmed multi-layered rap-

id changes in cholera vibrios in the process of evolution. For the first time ever, it was established that genomes of pathogenicity islands, VPI-1 and VPI-2, of pre-pandemic strains contained different mutations, which distinguished them from the genome of pandemic strains. At the same time, we revealed conservation of nucleotide sequence of all the studied persistence genes from VPI-2 and EPI of pandemic isolates. On the contrary, modern non-toxigenic strains ctxA tcpA- show considerable variability of persistence genes included into the structure of these mobile elements.

Conclusion. New data on the structure of regions of the genome of Vibrio cholerae associated with persistence can be used to differentiate vibrio cholerae with different epidemic significance.

Keywords: Vibrio cholerae, whole genome sequence, bioinformatic analysis, mobile elements, virulence and persistence genes. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:

Smirnova N.I. — https://orcid.org/0000-0002-7115-6286; e-mail: rusrapi@microbe.ru Badanin D.V. — https://orcid.org/0000-0002-9662-8438; e-mail: rusrapi@microbe.ru Rybal'chenko D.A. — https://orcid.org/0000-0002-3117-8229; e-mail: rusrapi@microbe.ru Krasnov Ya.M. — https://orcid.org/0000-0002-4909-2394; e-mail: rusrapi@microbe.ru Kritsky A.A. — https://orcid.org/0000-0002-5506-4285; e-mail: rusrapi@microbe.ru Lozovsky Yu.V. — https://orcid.org/0000-0003-4382-7254; e-mail: rusrapi@microbe.ru Fedorov A.V. — https://orcid.org/0000-0001-7190-4427; e-mail: rusrapi@microbe.ru Kutyrev V.V. — https://orcid.org/0000-0003-3788-3452; e-mail: rusrapi@microbe.ru Corresponding author: Smirnova N.I. — e-mail: rusrapi@microbe.ru

TO CITE THIS ARTICLE:

Smirnova NI, Badanin DV, Rybal'chenko DA, Krasnov YaM, Kritsky AA, Lozovsky YuV, Fedorov AV, Kutyrev VV. Variability of the genome of El Tor cholera vibrios isolated before the onset and in different periods of the current pandemic. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2021;39(2):25—37. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20213902125

Введение

Реальная опасность эпидемии холеры, особо опасной инфекционной болезни, для Российской Федерации определяется возможностью заноса возбудителя из множества эндемичных очагов в результате интенсивной миграции населения. Возбудитель первых шести пандемий азиатской холеры (1817— 1923 гг.) Vibrio cholerae О1-серогруппы относится к классическому биовару, который к концу прошлого столетия был вытеснен V. cholerae О1 биовара Эль Тор, вызвавшем в 1961 г. текущую 7-ю пандемию холеры [1, 2]. О непатогенных холерных вибрионах этого биовара впервые стало известно в 1905 г. после выделения их от паломников на карантинной станции Эль Тор Синайского полуострова. Первые сведения о вирулентных клонах вибрионов Эль Тор появились в 1937 г. после вызванной ими вспышки холеры на о. Целебес в Индонезии. Тем не менее эти пред-пандемические штаммы оказались неспособными к широкому распространению за пределы основного очага [3].

Глобальное распространение холеры Эль Тор из Индонезии в район Бенгальского залива, а оттуда во многие страны мира началось лишь в 1961 г. и происходило тремя перекрывающимися волнами [4, 5]. Появление пандемического потенциала у вибрионов Эль Тор было обусловлено изменением структуры и функции их генома. Секвенирование генома возбудителя 7-й пандемии показало присутствие в клетках двух кольцевых хромосом (большой и малой), состоящих из коровых и приобретенных через горизонтальный перенос генов в составе мобильных генетических элементов [6]. Среди последних большой инте-

рес представляли гены патогенности и персистенции, входящие в состав профага СТХф (от cholera toxin), островов патогенности VPI-1 и VPI-2 (от Vibrio Pathogenicity Island), острова персистенции в окружающей среде EPI (от Environmental Persistence Island) [7—12]. Структура таких генов возбудителя холеры Эль Тор отличалась от таковой возбудителя азиатской холеры. Так, различия в структуре генов ctxAB, кодирующих холерный токсин, или CT, и входящих в состав генома профага СТХф, заключались в разных нукле-отидных последовательностях гена репрессора rstR, а также гена ctxB. Аллели указанных генов у классических вибрионов были обозначены как rstRC!ass и ctxBC!ass, или ctxBl, у вибрионов Эль Тор — как rstRBt и ctxBBi, или ctxB3. Нуклеотидная последовательность гена tcpA, входящего в состав VPI-1 и определяющего продукцию основной субъединицы токсин-корегули-руемых пилей (или TCP от Toxin-Coregulated Pilus), обеспечивающих колонизацию вибрионами тонкого кишечника человека, была также разной. У классических вибрионов присутствовал аллельный вариант tcpAC!ass, а у вибрионов Эль Тор — tcpAE!t. Кроме того, в геноме вибрионов Эль Тор появились уникальные участки ДНК, названные островами пандемичности VSP-I и VSP-II (от Vibrio Seventh Pandemic island), которые обусловили появление пандемического потенциала [5, 11, 12].

Дальнейшая эволюция возбудителя привела к возникновению его геновариантов в начале 90-х годов прошлого столетия. Их формирование связано с приобретением типичными пандемическими штаммами вибрионов Эль Тор горизонтально перенесенных генов холерных классических вибрионов —

всего профага СТХф, включая гены rstRClass и ctxBl, или только гена ctxB1. Повышенный патогенный и эпидемический потенциал геновариантов обусловил повсеместное вытеснение ими типичных вибрионов Эль Тор [5, 13]. Но их геном оказался весьма нестабильным. Появились дополнительные точечные мутации в генах вирулентности ctxB1 и tcpAm. В результате возникли новые варианты возбудителя с ранее неизвестными аллелями ключевых генов вирулентности — аллелем ctxB7, отличающимся от аллеля ctxB1 одной дополнительной мутацией (C^A в позиции 58), и аллелем tcpACIRS, имеющим нуклеотидную замену A на G в позиции 266 [14—16]. К тому же у новых вариантов произошла потеря большого участка ДНК в геноме VSP-II [16—19].

Вместе с тем во время эпидемий и в межэпидемический период в водных экосистемах разных стран, включая Россию, были обнаружены нетоксигенные эпидемически безопасные штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор, лишенные генов СТ и вызывающие лишь отдельные случаи острых кишечных инфекций [20, 21].

В связи с выраженными генетическими различиями между разными штаммами представляется важным изучение динамики изменения генома вибрионов Эль Тор на протяжении более 100 лет. Несмотря на большой интерес к этой проблеме, до сих пор отсутствуют четкие представления о распространенности мутаций в генах патогенности и персистенции в природных популяциях холерных вибрионов, изолированных в разные временные периоды. Остаются неясными эволюционные связи холерных вибрионов разной эпидемической значимости. Между тем появление технологии секвенирования позволяет значительно углубить наши знания о перестройках генома холерных вибрионов, значимых в их эволюции.

Цель настоящей работы — поиск и сравнительный анализ изменений структуры генов патогенности и персистенции холерных вибрионов, выделенных через длительные периоды времени на территории России и других стран, на основе биоинформационного анализа секвенированных нуклеотидных последовательностей полных геномов древних и современных изолятов.

Материалы и методы

Штаммы бактерий. В работе использовали ну-клеотидные последовательности полных геномов 44 токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды текущей пандемии, а также в период эпидемического благополучия по холере. Нуклео-тидные последовательности штаммов были получены нами ранее (29 штаммов) или взяты из NCBI GenBank (15 штаммов).

Секвенирование полных геномов холерных вибрионов проводили на платформе Ion PGM (Ion Torrent, США) с использованием стандартных протоколов пробоподготовки и программного обеспечения [21].

Биоинформационный анализ. Сравнительный анализ полногеномных последовательностей штаммов V. cholerae по мобильным элементам проводили относительно последовательности генома референс-ного штамма V. cholerae N16961. Для выравнивания полногемномных последовательностей и выявления делеций, инсерций использовали программу Mauve (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html). Поиск единичных точечных мутаций (SNPs) и контроль достоверности результатов осуществляли картированием ридов и собранных в контиги фрагментов генома исследуемых штаммов посредством программы Snippy (https://github.com/tseemann/snippy). Визуализацию результатов картирования производили при помощи программы Ugene (http://ugene.net/ru/).

SNP-анализ. Для SNP-типирования использовали алгоритм Байесовского эволюционного анализа с применением программы BEAST v2.5.1. Построение филогенетического дерева провели на основе SNP-матрицы, полученной путем попарного сравнения с геномом референсного штамма при помощи программы Snippy.

Результаты и обсуждение

Филогенетические связи холерных вибрионов Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры. Поскольку однозначные данные

0 происхождении холерных вибрионов Эль Тор разной эпидемической значимости до сих пор отсутствуют, мы провели филогенетический анализ «древних» нетоксигенных и токсигенных штаммов, изолированных от людей до начала текущей пандемии, клинических токсигенных штаммов, выявленных в период пандемии, а также нетоксигенных штаммов, выделенных из внешней среды в настоящее время. На рис.

1 изображено филогенетическое дерево, построенное на основании анализа 44 861 коровых SNPs полногеномных последовательностей 44 штаммов, из которых 29 было выявлено в России и сопредельных странах. Установлено четкое деление взятых штаммов на пять основных кластеров (см. рис. 1, а). Наиболее «древние» предпандемические нетоксигенные штаммы (1910 г., 1938 г.) образовали отдельный кластер I, который может быть предшественником вибрионов кластера III, состоящего из пандемических токсигенных штаммов (1961—2014 гг.) (табл. 1). Отличия штаммов из кластеров I и III от референсного N16961 составляли в среднем 853—871 SNPs и 5—103 SNPs соответственно. Кластер II включал предпандемические изоляты, выявленные во время локальной вспышки холеры (1937 г.), которые, вероятно, принадлежат к отдельной филогенетической

Рис.1. Схематическое изображение филогенетического дерева по данным анализа 44 861 коровых SNPs в полногеномных последовательностях 44 токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор.

а — филогенетические связи 44 штаммов разной эпидемической значимости, выделенных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры (1910—2017 гг.); б — эпидемически опасные штаммы, занесенные в Россию и сопредельные страны с различными волнами 7-й пандемии холеры; черными треугольниками обозначены штаммы, распространенные из первичного очага холеры с известной волной 7-й пандемии.

линии, поскольку их отличия от референсного достигали 1190—1243 SNPs. Дивергенция штаммов этого кластера от «древних» нетоксигенных штаммов коррелировала с приобретением ими генов холерного токсина в составе профага СТХф. Обособление кластера III было связано с формированием генома холерных вибрионов, ставших способными к широкому распространению. Показано, что занос эпидемически опасных штаммов в Россию, происходящий на протяжении 44 лет (1970—2014 гг.), совпадал с временным периодом трех разных волн глобального распространения возбудителя в мире из первичного очага. Об этом свидетельствует четкое разделение штаммов, выявленных в России, на 3 группы и присутствие в каждой из них контрольных штаммов из эндемичных очагов с известной принадлежностью к каждой волне пандемии (C7, CRC711, N16961, 86B2 — 1 волна; VC51, MJ-1236 — 2; VN243P_07, 4339, CIRS101 — 3) (см. рис. 1, б). Тем не менее высокий уровень филогенетического родства штаммов, выделенных на территории России и других стран через длительные периоды времени от начала 7-й пандемии, свидетельствует о едином источнике их происхождения, что полностью согласуется с результатами других исследователей [4, 22, 23].

Что касается нетоксигенных вибрионов, изолированных из внешней среды на территории России и вошедших в состав кластеров IV и V, то очевидна их значительная удаленность от всех клинических

изолятов. Однако штаммы из кластера IV, имеющие в геноме "УР1-1 и отличающиеся от референсного по 3195—5099 SNPs, филогенетически были более близки к пандемическим токсигенным штаммам по сравнению с изолятами из кластера V, различия которых с референсным достигали 16154— 16960 SNPs. Такая ситуация может указывать на их происхождение от токсигенных. Генетические же связи между нетоксигенными штаммами, выделенными до текущей пандемии и в современный период на территории России, оказались весьма слабыми. Таким образом, на основании данных полногеномного секвенирования с последующим анализом коровых SNPs впервые проведена оценка филогенетических связей токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов, выделенных в России и ряде сопредельных стран, с различными группами пред-пандемических штаммов. Эти данные позволили высказать предположение о происхождении эпидемически опасных штаммов, а также показали, что их занос в Россию был связан с тремя отдельными волнами пандемии холеры.

Выявление различий в распространенности и структуре мобильных элементов с основными генами патогенности и эпидемичности среди разных штаммов. В результате биоинформационного анализа секвенированных полногеномных последовательностей 37 штаммов были показаны различия в распространенности мобильных элементов

Таблица 1. Штаммы V.cholerae биовара Эль Тор, полногеномные нуклеотидные последовательности которых использованы в работе

Штамм Место и год выделения Источник № доступа в GenBank

NCTC8457 Саудовская Аравия, 1910 Человек NZ_AAWD01000000

MAK676 Индонезия, о.Целебес, 1937 Человек JRBD00000000

MAK757 Индонезия, о.Целебес, 1937 Человек AAUS00000000

MAK66-2 Индонезия, о.Целебес, 1938 Человек CP001233, CP001234

NCTC5395 Ирак, 1938 Человек CP013137

C7* Индонезия, 1961 Человек SRR6027720

CRC711* Индия, 1962 Человек CP013303

M818 РФ, Саратов, 1970 Человек LAHM00000000

M888 РФ, Астрахань, 1970 Человек LRBH00000000

M1030 Туркмения, 1972 Человек NEDX00000000

N16961* Бангладеш, 1975 Человек AE003852, AE003853

86B2* Бангладеш, 1986 Человек SRR6027683

VC51* Индия, 1992 Человек ERR018124

M1275 РФ, Дагестан, 1993 Человек LRAF00000000

MJ-1236* Бангладеш, 1994 Человек CP001485, CP001486

Р17644 РФ, Ачинск, 1997 Человек JRTW00000000

M1344 РФ, Казань, 2001 Человек NEDY00000000

CIRS101* Бангладеш, 2002 Человек CWPG00000000

4339* Индия, 2004 Человек ERR025361

P18899 РФ, Мурманск, 2006 Человек LAKM00000000

VN243P_07* Вьетнам, 2007 Человек SRR6027863

Л3226 РФ, Москва, 2010 Человек JDVX00000000

2010E1-1786 Гаити, 2010 Человек AELH01000000

76 Украина, Мариуполь, 2011 Человек MPVL00000000

153 Украина, Мариуполь, 2011 Человек MWRE00000000

M1509 РФ, Москва, 2012 Человек NEDZ00000000

3265/80 РФ, Москва, 2014 Человек JRQL00000000

M1395 РФ, Астрахань, 1981 Вода LQBY00000000

M1399 РФ, Астрахань, 1982 Вода LQBZ00000000

M1332 РФ, Челябинск, 2000 Человек PYCE00000000

M1337 РФ, Астрахань, 2000 Человек NEEB00000000

Р18748 РФ, Сочи, 2004 Человек NIFH00000000

P18778 РФ, Ростов-на-Дону, 2005 Вода NIFI00000000

M1467 РФ, Калмыкия, 2010 Вода VTLI00000000

M1501 РФ, Калмыкия, 2011 Человек LRAE00000000

M1504 РФ, Калмыкия, 2011 Вода VTLN00000000

M1507 РФ, Калмыкия, 2011 Вода VTLP00000000

111 РФ, Калмыкия, 2012 Вода VTLQ00000000

M1526 РФ, Калмыкия, 2012 Вода VUAA00000000

132 РФ, Калмыкия, 2013 Вода VUAC00000000

433 РФ, Сочи, 2015 Вода NEDW00000000

2613 РФ, Калмыкия, 2015 Вода PYCA00000000

3178 РФ, Калмыкия, 2017 Вода PYCH00000000

124 РФ, Калмыкия, 2017 Вода PYCD00000000

Примечание. Жирный шрифт — нуклеотидная последовательность взята из МСВ1 ОепВапк; * — штаммы, взятые в качестве контрольных при определении волны распространения исследуемых штаммов в России во время текущей пандемии холеры.

с ключевыми генами патогенности между древними и современными изолятами. Геном предпандемиче-ских нетоксигенных штаммов был лишен профага СТХф, но имел VPI-1 (см. табл. 1, рис. 1, а), что полностью согласуется с данными, полученными ранее [23]. Однако нуклеотидная последовательность гена tcpA из VPI-1 отличалась от таковой референс-ного штамма N16961 по 158 нуклеотидам. Выявленную нами новую аллель данного гена обозначили

как fcpAAlt (рис. 2, б). Тем не менее обнаруженные мутации, видимо, не влияли на функциональную активность кодируемого геном белка, поскольку известно, что эти вибрионы колонизировали кишечник людей [23]. Вторую группу препандемических штаммов, выявленных в 1937 г., отличало от первой наличие в их геноме УР1-1 с другим аллелем гена tcpA — tcpAm•, идентичным таковому в N16961, и профага СТХф холерных классических вибрионов

Рис.2. Схема структуры генома профага СТХф и острова патогенности УРМ V. сНо!егав биовара Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры.

а — схема структуры генома профага СТХф; б — схема структуры генома 'УР1-1 и нуклеотидная последовательность гена №рА; жирным шрифтом выделены мутации в гене 1срАа1' — 158 однонуклеотидных замен.

(СТХфа:ш) с аллелями ctxBClass (или ctxB1) и rstRClass. (см. табл. 1, рис. 2, а). Присутствие в их хромосоме VPI-1 с аллелем tcpAElt исключало их происхождение от нетоксигенных штаммов с аллелем tcpAAlt. Этот факт подтверждает независимое происхождение предпандемических клинических штаммов. Следует отметить нестабильное наследование ими профага СТХфа:ш, поскольку известны штаммы, утратившие его (см. табл. 1).

Токсигенные штаммы, вызвавшие пандемию холеры, содержали в геноме оба мобильных элемента — профаг СТХф и VPI-1. Однако их профаг СТХф нес иные аллели генов ctxB и rstR — ctxBElt (или ctxB3) и rstRElt, тогда как структура VPI-I с аллелем tcpAElt была идентична таковой предпандемических токсигенных штаммов (см. рис. 2, а, б). Более того, в их геноме присутствовали новые участки ДНК — острова пан-демичности VSP-I и VSP-II. Именно такие штаммы (M818, M888, M1030), сформированные в Юго-Восточной Азии к 1961 г., впервые были занесены в Россию (1970 г.) и Туркменистан (1972 г.) во время первой волны пандемии (см. табл. 1). Вторая волна пандемии была связана с появлением в начале 90-х годов на эндемичных по холере территориях атипичных штаммов возбудителя с гибридным профагом СТХф, имеющим аллели ctxB1 и rstRElt, и их заносом в Россию в 1993—2001 гг. (M1275, P17644, 1344). Генетической меткой штаммов, занесенных с третьей волной (2006—2014 гг.) и вызвавших в России (P18899, L3226, M1509, 3265) и Украине (153, 76) отдельные случаи или локальную вспышку холеры, стал новый аллель гена tcpA в VPI-1 — tcpACIRS. Кроме того, штаммы, изолированные в более поздний период 3-й волны, отличались наличием нового аллель-ного варианта ctxB7 в геноме CTXф, появившегося в результате дополнительной мутации (см. табл. 1, рис. 2). Основным последствием таких изменений в генах ctxB и tcpA стало повышение вирулентности возбудителя [14]. И, наконец, следует особо отметить, что у штаммов, занесенных в Россию и Украину с 3-й волной пандемии, в геноме VSP-II появилась протяженная делеция размером 13105 пн, включающая 21 ген. Возможно, что образование такой деле-ции происходило в несколько этапов, так как были выявлены штаммы, у VSP-II которых потерянный участок затрагивал лишь 4 гена.

Среди исследуемых нетоксигенных штаммов в геноме семи изолятов присутствовал VPI-1 с аллелем tcpAm, идентичным таковому токсигенных штаммов из 1-й и 2-й волн пандемии. Эти данные свидетельствует в пользу нашего предположения о наличии общей предковой формы таких нетоксигенных изолятов и токсигенных штаммов. Геном других нетоксигенных вибрионов был лишен всех мобильных элементов, связанных с патогенностью (см. табл. 1).

Таким образом, приведенные выше сведения подтвердили многоступенчатость и быстроту изме-

нения участков генома холерных вибрионов Эль Тор, определяющих их вирулентные свойства и способность к эпидемическому распространению. Впервые выявлена новая аллель гена tcpA в VPI-1 «древних» нетоксигенных штаммов. Вирулентность первых клинических штаммов обусловлена присутствием в их геноме VPI-1 с геном tcpAElt и профага холерных классических вибрионов. Подтверждено отсутствие в их геноме двух островов пандемичности, что, вероятно, является причиной их неспособности к эпидемическому распространению. В отличие от «древних» токсигенных изолятов в геноме эпидемически опасных штаммов, занесенных в Россию с первой волной пандемии, появились три новых мобильных элемента — профаг СТХфш с ранее неизвестными аллелями ctxBElt (или ctxB3) и rstRElt, а также два острова пандемичности — VSP-I и VSP-II. Все последующие этапы изменения генома возбудителя холеры Эль Тор, обнаруженные почти через 30 лет после его возникновения, обусловлены как получением им нового генетического материала (гена ctxB1) от классических вибрионов, так и возникновением мутаций разного типа в ключевых генах вирулентности и эпидемично-сти. Все это свидетельствует о нестабильности участков генома, связанных с вирулентностью. Что касается нетоксигенных вибрионов, циркулирующих в водоемах России, то среди них выявлены вибрионы, в геноме которых присутствовал VPI-1 с геном tcpAElt, что указывает на их возможную филогенетическую связь с эпидемически опасными штаммами.

Изменчивость генов персистенции, входящих в состав острова патогенности VPI-2 и острова персистенции в окружающей среде EPI. Далее, мы попытались оценить изменчивость генов персистенции вибрионов Эль Тор, входящих в состав VPI-2 и EPI. В отличие от мобильных элементов вирулентности, VPI-2 и EPI присутствовали в геноме всех исследуемых штаммов независимо от времени их выделения (см. табл. 1). Для выяснения изменения их структуры в ходе эволюции на первом этапе работы провели сравнение структуры VPI-2 (57,3 т.п.н.), содержащего 11 генов nan-nag области, значимых для выживания вибрионов в разных экологических нишах — в водной среде и организме человека [25, 26]. Оказалось, что VPI-2 «древних» нетоксигенных штаммов не отличался по структуре от референсного штамма и содержал все 3 основных блока генов — гены системы рестрикции/модификации, область nan-nag и гены, гомологичные генам фага Mu (рис. 3, а, б). Вместе с тем впервые установили, что предпандемические токсигенные штаммы имели делетирован-ный VPI-2 размером 42,4—46,6 т.п.н., утративший блок фаговых генов, включая в ряде случаев (штамм MAK757) и прилежащие к нему гены (см. рис. 3, в). В отличие от них в хромосоме всех изученных токсигенных штаммов, изолированных в период пандемии, присутствовал интактный VPI-2 (см. рис. 3,г). Неток-

Таблица 2. Молекулярно-генетические особенности мобильных генетических элементов, связанных с и персистенцией, различных штаммов У.сЬо!егае О1 биовара Эль Тор

вирулентностью

Штамм СТХф VPI-1 VPI-2 VSP-I VSP- II EPI

ctxB rstR tcpA

Предпандемические штаммы (токсигенные и нетоксигенные)

NCTC5395 — — tcpAa" + — — EPI н.з.

MAK676 ctxB1 rstRcla tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

MAK757* ctxB1 rstRcla tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

MAK66-2* ctxB1 rstRcla tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

NCTC8457 — — tcpAa" + — — EPI н.з.

Пандемические штаммы (токсигенные)

С7(1в) ctxB3 rstREl tcpAEl + н.з. + + +

CRC711(1B) ctxB3 rstREl tcpAEl + н.з. + + +

М818(1в) ctxB3 rstREl tcpAEl VPI-2A + н.з. + EPI н.з.

М888(1в) ctxB3 rstREl tcpAEl VPI-2A + н.з. + EPI н.з.

М1030(1в) ctxB3 rstREl tcpAEl + + + н.з. +

N16961(1в) ctxB3 rstREl tcpAEl + + + +

86В2(1в) - rstREl tcpAEl + н.з. + + +

VC51(2в) ctxB1 rstREl tcpAEl VPI-2A VSP- IA - +

M1275 ctxB1 rstREl tcpAEl VPI-2A + + +

MJ-1236^) ctxB1 rstRClass tcpAEl + н.з. + + +

P17644 ctxB1 rstREl tcpAEl + н.з. + н.з. VSP- IIA EPI н.з.

M1344 ctxB1 rstREl tcpAEl VPI-2A + + н.з. EPI н.з.

aRS101(3в) ctxB1 rstREl tcpACIRS + н.з. + VSP- IIA +

4339 (3в) ctxB1 rstREl tcpACIRS VPI-2A + VSP- IIA +

Р18899(3в) ctxB1 rstREl tcpACIRS VPI-2A + VSP- IIA EPI н.з.

VN243P_07(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + + VSP- IIA +

Л3226(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + + VSP- IIA +

2010Е1-1716(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + н.з. + VSP- IIA +

76(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS VPI-2A + VSP- IIA +

153(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + н.з. + VSP- IIA +

М1509(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + н.з. + н.з. VSP- IIA EPI н.з.

3265/80(3в) ctxB7 rstREl tcpACIRS + н.з. + н.з. VSP- IIA EPI н.з.

Нетоксигенные штаммы

M1395 — — tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

M1332 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

M1337 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

P18748 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

P18778 — — tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

M1467 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

M1501 — — tcpAEl VPI-2A — — EPI н.з.

M1504 — — tcpAEl + — — EPI н.з.

M1507 — — tcpAEl + — — EPI н.з.

111 — — tcpAEl + — — EPI н.з.

M1517 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

132 — — — VPI-2A — — EPI н.з.

2613 — — tcpAEl + — — EPI н.з.

Примечание. * — «+» — присутствие интактного мобильного элемента; «—» — отсутствие мобильного элемента; н.з. — нуклеотидная замена.

сигенные штаммы, выделенные из водной среды в современный период, отличались от «древних» неток-сигенных изолятов большой вариабельностью УР1-2. В хромосоме 69,2% исследуемых штаммов, обитающих в воде и лишенных другого острова патогенно-сти — УР1-1, присутствовал дефектный УР1-2, сохранивший лишь центральный блок генов, связанных в основном с утилизацией аминосахаров и сиаловых кислот (УС1773 — УС1784). При этом размер делеции

VPI-2 у разных штаммов был неодинаков и колебался от 37,3 до 45,8 т.п.н. (см. рис. 3, д). Однако ряд неток-сигенных штаммов, в геноме которых присутствовал VPI-1, несли интактный VPI-2 (см. рис. 3, г).

Далее мы определили вариабельность кластера генов nan-nag VPI-2, вовлеченных в расщепление (nanH), транспорт (dctPQM) и катаболизм сиаловой кислоты [26]. Сравнение нуклеотидной последовательности этих генов у «древних» предпандемических

Рис. 3. Схема структуры генома острова патогенности VPI-2 V.cholerae биовара Эль Тор, выделенных до начала и в разные периоды 7-й пандемии холеры.

а — схема структуры острова патогенности VPI-2 референсного эпидемически опасного штамма N16961; б — структура VPI-2 древних нетоксигенных штаммов NCTC8457, NCTC5395; в — структура VPI-2 токсигенных предпандемических штаммов MAK676 и MAK757; г — структура VPI-2 токсигенных эпидемически опасных штаммов; д — структура VPI-2 нетоксигенных штаммов, выделенных в современный период.

и современных пандемических штаммов показало их идентичность. Это означает, что на протяжении более 100 лет указанные гены не претерпели никаких изменений. Вместе с тем, несмотря на их консервативный характер у всех изученных штаммов, выделенных от людей, мы обнаружили, что у нетоксигенных вибрионов, циркулирующих в воде открытых водоемов, картина была иной. Среди 13 изученных у 9 изолятов с делетированным VPI-2, сохранивших лишь центральный блок генов, во всех генах класте-

ра nan-nag было выявлено множество синонимичных и несинонимичных однонуклеотидных замен — от 1 до 88. Более того, 2 штамма (132, M1332) утратили 7-9 генов этой области (табл. 3). Ничего подобного не происходило у штаммов, сохранивших интакт-ный VPI-2. В отличие от изолятов с делетированным VPI-2, у этой группы вибрионов (M1504, M1507, 111 и 2613) гены кластера nan-nag не были затронуты мутациями (см. табл. 3). Эти факты указывают на то, что появление точечных мутаций в генах области nan-

m ^ en m \a tr--

m ~ m ~ m

a

О < р

о

о п о

сло

и

F

т

Шт

39757

9 99 8 9

TT TfTfTf

СЛ

O- < 2

, on ^ 2

СЛ 2

o©

9

а н

8

<

/7 /2 88 25

oo ^ oo ¡^

o< о

oo oo 828

2 2

4

о

"•^OO^O^OO

95393

"0< О

6 66666 /9

t-- oo t-- t-- t--

65565

76676

o< о

o< о

гчКсл

o< о

^ <

527887 933476 333774

0002 5555

к к

и

S a

Es g g

nag коррелировало с возникновением делеционных перестроек в геноме VPI-2. Причина появления множественных мутаций в генах нетоксигенных вибрионов с нарушенной структурой VPI-2 остается непонятной. Можно было бы предположить, что эти мутации — следствие длительного и сильного стрессового воздействия водной среды на вибрионы. Но наряду с ними в водной среде обитают нетоксигенные вибрионы с интактным VPI-2, у которых в этих генах мутаций не выявлено. Приблизить нас к ответу могут только дополнительные исследования.

Наиболее существенный для сохранения холерных вибрионов в окружающей среде остров персистенции EPI (16,7 т.п.н.) содержит 17 генов, объединенных в 2 оперона: секреторный (mshHIJKLM-NEGF) и структурный (mshBACDOPQ). Эти гены кодируют и контролируют продукцию маннозочув-ствительных пилей адгезии, участвующих в образовании биопленки, в составе которой вибрионы защищены от действия стрессовых факторов [9, 27]. При сравнении нуклеотидной последовательности этих генов токсигенных и нетоксигенных предпан-демических изолятов, а также пандемических штаммов с таковыми референсного штаммы мы не выявили больших изменений. Единичные нуклеотид-ные замены были лишь в нескольких генах (табл. 4). Следовало бы ожидать, что столь важные для выживания клетки гены должны быть консервативными и у нетоксигенных вибрионов, сохраняющихся в течение длительного периода в водной среде. Однако нуклеотидные последовательности всех генов msh нетоксигенных вибрионов ctxA-tcpA- несли синонимичные и несинонимичные замены — от 1 до 65 (см. табл. 4). В нетоксигенных штаммах ctxA-tcpA+ лишь немногие гены были затронуты мутациями (см. табл. 4). Причина таких явных различий в вариабельности генов msh между нетоксигенными штаммами, обитающими в одинаковых условиях водной среды, но имеющими существенные геномные отличия, пока неясна. Однако независимо от объяснений этого явления, накопление мутаций в генах персистенции в популяции нетоксигенных вибрионов представляется целесообразным для их лучшей адаптации к меняющимся условиям водной среды. Таким образом, обнаружение VPI-2 и EPI во всех геномах изученных штаммов, включая самые древние, свидетельствует о том, что эти острова являются одними из «старейших», приобретение которых их предшественником обеспечило появление у них адаптивного механизма для выживаемости в разных экологических нишах. Выявленная консервативность нуклеотидной последовательности практически всех генов из области nan-nag VPI-2 и генов msh, входящих в состав EPI, у предпандемических и пандемических изолятов связано, видимо, с их функциональной значимостью для клетки во время пребывания вибрионов в относительно постоянной среде в организме человека.

a

si

P

.с

о л

a

si

C

si

&

и

в

I

M si

К

si

ит

P

S VS

I

т0 шт

р п

к о

H

к о

H

6

P

S VS

V +

ct

V

P

S

-

g VD

>S В

ю Й «

M

Эти гены оказались стабильными и у современных нетоксигенных вибрионов, обитающих в воде, в геноме которых имелись интактные УР1-1 и УР1-2. Однако ситуация резко меняется при смене геномного портрета вибрионов. Впервые обнаружена существенная вариабельность указанных генов у водных вибрионов с делетированным УР1-2, а также прямая связь между высоким уровнем мутации генов персистенции, расположенных на разных мобильных элементах, и утратой значительной части генома УР1-2. Причина такой интенсивной перестройки генома этих вибрионов, широко распространенных в водоемах России, пока не совсем ясна. Вряд ли можно утверждать, что выявленные генетические события происходят только под давлением стрессовых факторов среды, поскольку в этих же водоемах встречаются нетоксигенные вибрионы с интактны-ми УР1-2 и ЕР1. Возможно, что общее нарушение структуры генома вибрионов также имеет отношение к возникновению многочисленных однонукле-отидных замен в разных генах.

Заключение

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов исторически давних и современных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор подтвердил, что появление вирулентных штаммов связано с приобретением ранее непатогенными вибрионами профага СТХф с генами СТ. Однако история возникновения самых первых и современных клинических изолятов была, видимо, разной, поскольку отсутствует полное сходство их профагов (СТХфС1ам и СТХфш). Наиболее «древние» мобильные элементы вибрионов Эль Тор — это острова патоген-ности УР1-1 и УР1-2, а также остров персистенции ЕР1, необходимые для колонизации кишечника человека и выживания в меняющихся условиях внешней среды. Ранее неизвестные отличия нуклеотид-ной последовательности гена tcpA из УР1-1 нетокси-генных и токсигенных предпандемических штаммов обусловлены, возможно, их разными предшественниками. Об этом свидетельствуют и выявленные нами различия между геномами УР1-2 этих штаммов, выражавшиеся в делеции этого ОП размером 10,7— 14,9 тпн у токсигенных изолятов. Кроме того, очевидным становится тот факт, что УР1-2, обнаруженный в геноме как предпандемических, так и пандемических штаммов, не может быть генетической меткой последних, как утверждалось ранее [10].

Что касается эпидемически опасных штаммов, то их занос в Россию в течение 44 лет происходил на протяжении 3 разных волн пандемии. Об этом свидетельствует характер кластеризации пандемических маркерных штаммов и взятых в анализ изолятов из России при их типировании по коровым SNPs. Выявлены две следующие особенности их геномов.

Первая — стабильность «старейших» мобильных элементов VPI-2 и EPI, предназначенных для обеспечения персистенции холерных вибрионов во внешней среде. Входящие в их состав гены, значимые для сохранения вибрионов в условиях стресса, в основном оставались неизмененными в течение указанного периода времени. Вторая — быстрые эволюционные изменения генов мобильных элементов, связанных с вирулентностью возбудителя и способностью штамма вызывать развитие эпидемического процесса. Геном впервые появившихся пандемических штаммов оставался относительно стабильным на протяжении почти 30 лет (1961—1993 гг.) Однако после первых преобразований, обусловленных получением нового аллеля гена ctxB (ctxB1) от классических вибрионов, наиболее значимые для вирулентности и эпидемич-ности участки его генома стали претерпевать различные изменения. Начиная с 2006 г. в России выявили штаммы с ранее неизвестными аллелями генов ctxB (ctxB7) и tcpA (tcpACIRS). Появление точечных мутаций в этих генах вирулентности, как правило, сопровождалось делецией многих генов в VSP-II. Такая изменчивость возбудителя холеры Эль Тор в современный период эволюции указывает на усиление его вирулентности и повышение эпидемического потенциала, что подтверждено другими исследователями [5, 15].

В то же время для нетоксигенных вибрионов, изолированных в России и лишенных не только

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Kaper JB, Morris JG, Levine MM. Cholera. Clin Microbiol Rev. 1995;8:48-86. https://doi.Org/10.1128/cmr.8.1.48

2. Миронова Л.В. Современные представления о закономерностях эпидемического процесса при холере: экологические и молекуляр-но-биологические аспекты. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2018;23(5):242-250.

Mironova LV. Current conceptions concerning the objective laws of a cholera epidemic process: ecological and molecular biological aspects. Epidemi-ologiya i Infectionnye bolezni. 2018;23(5):242-250. (In Russ.). https://doi.org/10.18821/1560-9529-2018-23-5-242-250

3. Tanamal ST. Notes on paracholera in Sulawesi (Celebes). Am J Trop Med Hyg. 1959;8(1):72-78. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1959.8.72

4. Mutreja A, Kim DW, Thomson N, Connor TR, Lee JH, Kariuki S et al. Evidence for several waves of global transmission within the seventh cholera pandemic. Nature. 2011;477(7365):462-465. https://doi.org/10.1038/nature10392

5. Ramamurthy T, Mutreja A, Weill FX, Das B, Ghosh A, Nair GB. Corrigendum: revisiting the global epidemiology of cholera in conjunction with the genomics of Vibrio cholerae. Front Public Health. 2019;7:237. https://doi.org/10.3389/fpubh.2019.00237

6. Heidelberg JF, Elsen JA, Nelson WC, Clayton RA, Gwinn ML, Dodson RJ et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 2000;406:477-483. https://doi.org/10.1038/35020000

7. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996;272(5270):1910-1914. https://doi.org/10.1126/science.272.5270.1910

8. Karaolis DK, Johnson JA, Bailey CC, Boedeker EC, Kaper JB, Reeves PR. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(6):3134-3139. https://doi.org/10.1073/pnas.95.6.3134

СТХф, но и VPI-I, характерна иная закономерность — четко выраженная нестабильность мобильных элементов персистенции VPI-2 и EPI, выражающаяся как в потере протяженных участков ДНК, так и в возникновении множественных однонуклео-тидных замен в сохранившихся генах. Обнаруженные изменения, вероятно, имеют большую селективную ценность, поскольку эти вибрионы способны к длительному сохранению в неблагоприятных условиях водной среды.

В целом результаты анализа геномных последовательностей «древних» и современных штаммов позволили глубже понять динамику изменения генома холерных вибрионов Эль Тор в процессе эволюции, а также получить новую информацию о структуре генома «древних» штаммов и различиях в стабильности мобильных элементов вирулентности и персистенции между токсигенными и нетоксигенны-ми изолятами. Более того, новые данные о структуре участков генома холерных вибрионов, связанных с персистенцией, могут быть использованы для дифференциации холерных вибрионов с разной эпидемической значимостью.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа не имела финансирования.

9. Marsh JW. and Taylor RK. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus. J Bac-teriol. 1999;181(4):1110-1117. https://doi.org/10.1128/jb.181.4.1110-1117.1999

10. Jermyn WS, Boyd EF. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002;148:3681-3693. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3681

11. Dziejman M, Balon E, Boyd D, Fraser CM, Heidelberg JF, Mekalanos JJ. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(3):1556-1561. https://doi.org/10.3410/f.1004686.53905

12. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Чел-дышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетиче-ский анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013;49(9):036-1047.

Smirnova NI, Zadnova SP, Agafonov DA, Shashkova AV, Cheldyshova NB, Cherkasov AV. Comparative Molecular-Genetic Analysis of Mobile Elements in Natural Strains of Cholera Agent. Russian Journal of Genetics. 2013;49(9):036-1047. (In Russ.). https://doi.org/10.7868/S0016675813090087

13. Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, Kamruzzaman M, Siddique AK, Sack DA. New variants ofVibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J Clin Microbiol. 2002;40(9):3296-3299. https://doi.org/10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002

14. Son MS, Megli CJ, Kovacikova G, Qadri F, Taylor RK. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J Clin Microbiol. 2011;49:3739-749. https://doi.org/10.1128/JCM.01286-11

15. Kim EJ, Lee CH, Nair GB, Kim DW. Whole-genome sequence comparisons reveal the evolution of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2015;23(8):479-489.

https://doi.org/10.1016/j.tim.2015.03.010

16. Weill КХ, Domman D, Njamkepo E, Almesbahi AA, Naji M, Nasher SS. et al. Genomic insights into the 2016—2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019;565(7738):230-233. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3

17. Taviani E, Grim CJ, Choi J, Chun J, Haley B, Hasan NA et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett. 2010;308(2):130-137. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02008.x

18. Imamura D, Morita M, Sekizuka T, Mizuno T, Takemura T, Yamashiro T, et al. Comparative genome analysis of VSP-II and SNPs reveals heterogenic variation in contemporary strains of Vibrio cholerae O1 isolated from cholera patients in Kolkata, India. PLoS Negl Trop Dis. 2017;11(2):e0005386. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005386

19. Baddam R, Sarker N, Ahmed D, Mazumder R, Abdullah A, Morshed R. et al. Genome dynamics of Vibrio cholerae isolates linked to seasonal outbreaks of cholera in Dhaka, Bangladesh. mBio. 2020;11;11(1). pii: e03339-19. https://doi.org/10.1128/mBio.03339-19

20. Титова С.В., Москвитина Э.А., Кругликов В.Д., Самородова А.В., Тюленева Е.Г., Монахова Е.В. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2006—2015 гг. прогноз на 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2016;1:20-27.

Titova SV, Moskvitina EA, Kruglikov VD, Samorodova AV, Tyuleneva EG, Monakhova EV et al. Cholera: Analysis of Epidemiological Situation across the World and in Russia within a Period of 2006—2015. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2016;1:20-27. (In Russ.). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-1-20-27

21. Смирнова Н.И., Агафонова Е.Ю., Щелканова Е.Ю., Агафонов Д.А., Краснов Я.М., Ливанова Л.Ф., Кутырев В.В. Геномное разнообразие нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae O1, выделенных на территории России и сопредельных стран. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;3:76-86.

Smirnova NI, Agafonova EYu, Shchelkanova EYu, Agafonov DA, Krasn-ov YaM, Livanova LF, Kutyrev VV. Genomic diversity of non-toxigenic Vibrio cholerae O1 strains, isolated in the territory of Russia and neighboring states. Molecular Genetics Microbiology and Virology. 2018;3:76-86. (In Russ.). https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84

22. Кулешов К.В., Маркелов М.Л., Дедков В.Г., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Керманов А.В. и др. Филогенетический анализ геномов штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территории Ростовской области. Журн микробиол, эпидемиол и иммунобиол. 2013;6:13-20. Kuleshov KV, Markelov ML, Dedkov VG, Vodop'ianov AS, Kermanov AV, Pisanov RV. Phylogenetic analysis of genomes of Vibrio cholerae strains isolated on the territory of Rostov region. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobi-ol. 2013;6:13-20. (In Russ.).

23. Hu D, Liu B, Feng L, Ding P, Guo X, Wang M et al. Origins of the current seventh cholera pandemic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(48):7730-7739. https://doi.org/10.1073/pnas.1608732113

24. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры. Генетика. 2005;41(1):1-10.

Osin AV, Nefedov KS, Eroshenko GA, Smirnova NI. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae El Tor preseventh and seventh pandemic strains isolated in various periods. Russian Journal oof Genetics. 2005;41(1):53-62 (In Russ.).

https://doi.org/10.1007/s11177-005-0007-y

25. Taylor G. Sialidases: structures, biological significance and therapeutic potential. Curr Opin .Struct Biol. 1996;6(6):830-837. https://doi.org/10.1016/s0959-440x(96)80014-5

26. Almagro-Moreno S, Boyd EF. Sialic acid catabolism confers a competitive advantage to pathogenic Vibrio cholerae in the mouse intestine. Infect Immun. 2009;77(9):3807-3816. https://doi.org/10.1128/IAI.00279-09

27. Watnick PI, Fullner KJ, Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor. J Bacteriol. 1999;181(11):3606-3609.

https://doi.org/10.1128/jb.181.11.3606-3609.1999

Поступила в редакцию 24.03.2020 Received 24.03.2020 После доработки 25.03.2020 Revised 25.03.2020 Принята к публикации 26.03.2020 Accepted 26.03.2020