СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЕНОМА АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР CTXA+TCPA+ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

https://doi.org/10.17116/molgen202038031108

Структурные и функциональные изменения генома авирулентных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор ctxA+tcpA+

© Н.И. СМИРНОВА, Д.А. АГАФОНОВ, Е.Ю. ЩЕЛКАНОВА, Д.А. РЫБАЛЬЧЕНКО, А.А. КРИЦКИЙ, Ж.В. АЛЬХОВА, Я.М. КРАСНОВ, Е.Ю. АГАФОНОВА, В.В. КУТЫРЕВ

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумной институт "Микроб"», Саратов, Россия РЕЗЮМЕ

Введение. Разнообразие вирулентных свойств различных штаммов возбудителя холеры, способного существовать в организме человека и водной среде, определяется большой вариабельностью его генома. Однако механизм возникновения штаммов V. choIerае О1 биовара Эль Тор с измененной вирулентностью остается недостаточно изученным. Материал и методы. Исследован 21 штамм V. choIeraе О1 биовара Эль Тор. Для изучения их свойств использовали белковый электрофорез, иммуноферментный метод (GM^ELISA), полногеномное секвенирование, геномный анализ и SNP-типирование. Вирулентность штаммов оценивали путем внутрикишечного заражения модельных животных. Результаты. Обнаружено, что в геноме выделенных из водной среды авирулентных штаммов V. choIeraе О1 биовара Эль Тор присутствуют профаг CTXç и остров патогенности VPI-1, содержащие гены ctxAВ и tcpA-F соответственно, которые кодируют ключевые факторы патогенности — холерный токсин и токсин-корегулируемые пили. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов этих мобильных элементов 2 авирулентных штаммов (89 и 147) с генотипом ctxA+tcpA+ и 5 клинических вирулентных изолятов с тем же генотипом не выявил отличий между ними. Вместе с тем у авирулентных штаммов ctxA+tcpA+ впервые обнаружено изменение нуклеотидной последовательности глобального регуля-торного гена toxR, расположенного в коровой части генома, — делеция одного нуклеотида (T в позиции 357), что привело к образованию стоп-кодона TGA. Следствие такой мутации — образование дефектного трансмембранного ДНК-связыва-ющего белка TохR, осуществляющего позитивный контроль экспрессии основного регуляторного гена вирулентности toxT, за счет утраты 176 аминокислот. Показано, что потеря функции белка TохR привела к существенному снижению уровня мРНК основных регуляторных (toxR, toxT) и структурных (ctxA, ctxB, tcpA) генов вирулентности изученных штаммов. В результате экспрессия генов холерного токсина у мутантных штаммов 89 и 147 была снижена более чем в 20 раз по сравнению с вирулентными штаммами. Проведен SNP-анализ полногеномных последовательностей штаммов 89 и 147, а также 19 вирулентных штаммов, включая разные геноварианты возбудителя, для выяснения их филогенетических связей. Заключение. Выявлен новый механизм изменения вирулентности холерных вибрионов. У авирулентных штаммов с генотипом ctxA+tcpA+обнаружено изменение нуклеотидной последовательности глобального регуляторного гена toxR. Следствие такой мутации — образование дефектного трансмембранного ДНК-связывающего белка TохR, что привело к резкому снижению продукции токсина, необходимого для развития инфекционного процесса при холере.

Ключевые слова: возбудитель холеры, вирулентность, вариабельность генома, регуляторные и структурные гены, мутации. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Смирнова Н.И. — https://orcid.org/0000-0002-7115-6286; e-mail: rusrapi@microbe.ru Агафонов Д.А. — https://orcid.org/0000-0001-9273-6063; e-mail: rusrapi@microbe.ru Щелканова Е.Ю. — https://orcid.org/0000-0003-0672-8820; e-mail: rusrapi@microbe.ru Рыбальченко Д.А. — https://orcid.org/0000-0002-3117-8229; e-mail: rusrapi@microbe.ru Крицкий А.А. — https://orcid.org/0000-0002-5506-4285; e-mail: rusrapi@microbe.ru Альхова Ж.В. — https://orcid.org/0000-0001-7681-5773; e-mail: rusrapi@microbe.ru Краснов Я.М. — https://orcid.org/0000-0002-4909-2394; e-mail: rusrapi@microbe.ru Агафонова Е.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-9988-6312; e-mail: rusrapi@microbe.ru Кутырев В.В. — https://orcid.org/0000-0003-3788-3452; e-mail: rusrapi@microbe.ru Автор, ответственный за переписку: Смирнова Н.И. — e-mail: rusrapi@microbe.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Щелканова Е.Ю., Рыбальченко Д.А., Крицкий А.А., Альхова Ж.В., Краснов Я.М., Агафонова Е.Ю., Кутырев В.В. Структурные и функциональные изменения генома авирулентных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор ctxA+tcpA+. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(3):108—119. https://doi.org/10.17116/molgen202038031108

Structural and functional changes of the genome in avirulent Vibrio cholerae strains biovar El Tor, genotype ctxA+tcpA+

© N.I. SMIRNOVA, D.A. AGAFONOV, E.Yu. SHCHELKANOVA, D.A. RYBAL'CHENKO, A.A. KRITSKY, Zh.V. AL'KHOVA, Ya.M. KRASNOV, E.Yu. AGAFONOVA, V.V. KUTYREV

FGHI Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia

ABSTRACT

Objective. Genome variability of the cholera agent that is able to persist in human organism and aquatic environment is at the bottom of alteration of its virulent properties. However the mechanism of emergence of V. cholerae O1 strains, biovar EL TOR with altered virulence remains under-researched.

Material and methods. A total of 21 V. cholerae O1 biovar EL TOR strains were examined. In order to study their properties, protein electrophoresis, immunoenzime analysis (GM1-ELISA), whole-genome sequencing, genomic analysis, and SNP typing have been used. The virulence of the strains has been rated by means the intestinal infection of the model animals. Results. We have found out that the genome of isolated from aquatic environment avirulent v. Cholerae o1 biovar EL TOR strains contains CTX9 prophage and pathogenicity island VPI-1, that include ctxAB and tcpA-F genes, respectively, encoding key factors of pathogenicity — cholera toxin and toxin-coregulated pilus. Comparative analysis of the nucleotide sequences of these mobile element genomes in two avirulent strains (89 and 147) with genotype ctxA+tcpA+ and five clinical virulent isolates with the same genotype has not revealed any differences between them. However, changes in the nucleotide sequence of global regulator gene toxR, situated in the core region of the genome, have been first-time detected in avirulent strains. It is a deletion of a single nucleotide (T in the position 357), which led to formation of terminating codon TGA. Consequence of such a mutation — genesis of defective trans-membrane DNA — binding protein ToxR, performing positive control of the main virulence regulator gene toxT expression, owing to the loss of 176 amino acids. It is demonstrated that the loss of toxR protein function has resulted in significant decrease of mRNA level of the key regulatory (ToxR, toxT) and structural (ctxA, ctxB, tcpA) virulence genes in studied strains. Consequently, expression of cholera toxin genes in mutant strains 89 and 147 was more than 20 times reduced as compared to virulent strains. We have also conducted SNP-analysis of whole-genome sequences of the strains 89 and 147, as well as 19 virulent strains, including various genovariants of the agent and showed their phylogenetic relations.

Conclusion. Thus new mechanism of virulence alteration in cholera vibrio strains has been identified. In avirulent strains with genotype ctxA+tcpA+, changes in the nucleotide sequence of global regulator gene toxR have been detected. This mutation has resulted in the formation of a defective trans-membrane DNA — binding protein toxR, which has caused a dramatic decline in the production of the toxin necessary to cause infection with cholera.

Keywords: cholera agent, virulence, genome variability, regulatory and structural genes, mutations. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:

Smirnova N.I. — https://orcid.org/0000-0002-7115-6286; e-mail: rusrapi@microbe.ru Agafonov D.A. — https://orcid.org/0000-0001-9273-6063; e-mail: rusrapi@microbe.ru Shchelkanova E.Yu. — https://orcid.org/0000-0003-0672-8820; e-mail: rusrapi@microbe.ru Rybal'chenko D.A. — https://orcid.org/0000-0002-3117-8229; e-mail: rusrapi@microbe.ru Kritsky A.A. — https://orcid.org/0000-0002-5506-4285; e-mail: rusrapi@microbe.ru Al'khova Zh.V. — https://orcid.org/0000-0001-7681-5773; e-mail: rusrapi@microbe.ru Krasnov Ya.M. — https://orcid.org/0000-0002-4909-2394; e-mail: rusrapi@microbe.ru Agafonova E.Yu. — https://orcid.org/0000-0001-9988-6312; e-mail: rusrapi@microbe.ru Kutyrev V.V. — https://orcid.org/0000-0003-3788-3452; e-mail: rusrapi@microbe.ru Corresponding author: Smirnova N.I. — e-mail: rusrapi@microbe.ru

TO CITE THIS ARTICLE:

Smirnova NI, Agafonov DA, Shchelkanova EYu, Rybal'chenko DA, Kritsky AA, Alkhova ZhV, Krasnov YaM, Agafonova EYu, Kutyrev VV. Structural and functional changes of the genome in avirulent Vibrio cholerae strains biovar El Tor, genotype ctxA+tcpA+. Molekulyamaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(3):108—119. (In Russ.). https://doi. org/10.17116/molgen202038031108

Введение

Холера относится к особо опасным инфекциям, широко распространенным во многих странах Азии, Африки и Латинской Америки, на территории которых сформировались эндемичные очаги. Локальные вспышки и единичные случаи холеры в Российской Федерации (РФ) связаны с завозом из этих стран токсигенных штаммов возбудителя с последующим накоплением его в воде поверхностных водоемов при благоприятных климатических и экологических условиях [1, 2]. Возбудителем семи известных пандемий холеры является Vibrio cholerae двух биова-ров — классического и Эль Тор. Их геномы в каждом случае представлены двумя кольцевыми хромосомами — большой и малой [3]. В геномах, помимо коро-вых генов, расположены различные мобильные элементы, в состав которых входят гены вирулентности, эпидемичности и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды, а также гены устойчивости

к антибиотикам. Выраженные различия между холерными вибрионами классического и Эль Тор био-варов, прежде всего, связаны с особенностями структуры и функции генов tcpA-F и ctxAB, кодирующих основные факторы вирулентности — токсин-коре-гулируемые пили, или TCP (от toxin-coregulated pilus), и холерный токсин, или CT (от cholera toxin) [4, 5]. За счет TCP холерные вибрионы прикрепляются к микроворсинкам тонкого кишечника и колонизируют его. CT, продуцируемый размножившимися вибрионами, вызывает развитие основного клинического симптома — профузную диарею. Гены tcpA-F и ctxAB локализованы в геноме двух мобильных элементов — острове патогенности 1, или VPI-1 (от Vibrio pathogenicity island), и профаге CTXф (от cholera toxin) соответственно [6, 7].

V. cholerae классического биовара был возбудителем первых шести пандемий азиатской холеры (1817—1923 гг.), тогда как за текущую, 7-ю пандемию, начавшуюся в 1961 г., были ответственны

типичные токсигенные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор. За прошедшие с тех пор почти 60 лет геномы этих штаммов претерпели различные изменения, наиболее значимые из которых затронули гены патогенности [8, 9]. В 1991 г. были выделены генетически измененные штаммы (или геноварианты) возбудителя, имеющие существенные генетические отличия от типичных штаммов [10, 11]. Так, в геноме профага СТХф геновариантов был обнаружен кодирующий B-субъединицу CT аллель гена ctxB холерных вибрионов классического биовара, а именно ctxB1. Этот аллель отличается от аллеля ctxB3 типичных штаммов наличием двух однонуклеотидных замен — тимина на цитозин (T/C) в позициях 115 и 203. У современных штаммов возбудителя биосинтез ключевых факторов патогенности TCP и CT кодируют гены, имеющие дополнительные изменения в нуклео-тидной последовательности по сравнению с таковой геновариантов, появившихся в начальный период их формирования (1991—2000 гг.). Различия связаны с присутствием в опероне ctxAB другого аллеля гена ctxB — ctxB7, для которого характерно наличие дополнительной третьей замены C на A в позиции 58 [8— 10]. Кроме того, изменения затронули ген tcpA, кодирующий основную субъединицу пилей TCP, в котором появилась однонуклеотидная несинонимичная замена A на G в позиции 266. Этот аллель гена tcpA обозначен как tcpAcirs [4, 12, 13].

Координированную регуляцию активности генов ctxAB и tcpA-F осуществляет через регуляторный каскад глобальная контролирующая система, основными компонентами которой являются регулятор-ные гены toxR, toxS, aphA из коровой области хромосомы, а также гены tcpP, tcpH и toxT, входящие в состав ОП VPI-1 [14, 15]. Центральная роль в активации транскрипции структурных генов вирулентности принадлежит цитоплазматическому белку ToxT, являющемуся транскрипционным регулятором. В свою очередь транскрипция гена toxT активируется трансмембранным белком ToxR, кодируемым геном toxR, а также дополнительными регуляторными белками ToxS, ТсрР и TcpH [14]. Таким образом, функционирование контролирующей системы оределяется несколькими регуляторными генами, последовательно активирующими друг друга (рис. 1, а).

Благодаря функциональной значимости генов ctxА и tcpA, абсолютно необходимых для развития инфекционного процесса, их принято использовать в качестве генетических маркеров эпидемически опасных штаммов, выделяемых, как правило, от больных холерой или из окружающей человека среды во время эпидемии [3]. В этих случаях профилактические и противоэпидемические мероприятия проводят в полном объеме. При мониторинге окружающей среды в РФ в ряде случаев из водоемов были выделены холерные вибрионы биовара Эль Тор ctxА+tcpA+, однако случаи заболевания холерой отсутствовали.

Причина такой авирулентности изолятов, сохраняющих полноценные гены вирулентности, оставалась неисследованной, хотя этот вопрос требовал решения для полного понимания механизмов популяци-онной изменчивости возбудителя.

В этой работе представлены результаты сравнительного анализа структурных и регуляторных генов вирулентности различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор ctxА+tcpA+, выделенных из воды и от больных. Изучено влияние выявленной мутации в регуляторном гене toxR у авирулентных штаммов на уровень транскрипции основных генов вирулентности.

Материал и методы

Бактериальные штаммы, условия культивирования. Использованные в работе бактериальные штаммы представлены в табл. 1. Штаммы хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» в лиофилизированном состоянии. Бактерии культивировали в бульоне и агаре Luria—Bertani (LB) при 37 °C.

Определение белкового профиля. Электрофорез проводили по методу U. Laemmli и соавт. [16] на приборе Mighty Small II в присутствии додецилсульфа-та натрия в пластинах размером 8x7 см. В работе использовали 12,5% гель. Концентрирующий гель — 4%. Две петли исследуемой культуры ресуспенди-ровали в 100 мкл дистиллированной воды, добавляли 100 мкл «буфера образца», содержащего 0,125 М трис-HCl, рН 6,8; 4% SDS; 20% глицерин; 2% 2-мер-каптоэтанол; 0,03 мМ бромфеноловый синий, затем кипятили на водяной бане в течение 5—7 мин. Электрофорез проводили до вхождения образца в разделяющий гель при нагрузке тока 20 мА и далее при 40 мА. Электродный буфер (рН 8,3) содержал 0,192 М глицина; 0,025 мМ трис; 0,1% SDS. Фиксацию белков осуществляли в течение 1 ч или ночи в 50% растворе ТХУ, окрашивание свежеприготовленным 0,1% раствором Кумасси R-250 в 50% ТХУ — в течение 1 ч при 37 °С. Избыток красителя из геля вымывали 7% уксусной кислотой.

Определение продукции холерного токсина проводили иммуноферментным методом GM1-ELISA [17]. Разведения очищенного CT (Sigma chemicals,COÄ) известной концентрации использовали для построения стандартной кривой и оценки СТ в образцах. Для постановки ELISA применяли кроличьи антитоксические антитела и антикроличий IgG, конъ-югированный с пероксидазой хрена (Gibco-BRL). Эксперименты ставили в 3-кратной повторности. Для статистической обработки данных применяли программу Microsoft Excel 2010.

Определение вирулентности штаммов проводили по методу N. Dutta и М. Habbu [18]. Исследования выполняли на 12 крольчатах 7—8-дневного возраста

Рис. 1. Схема функционирования генной сети вирулентности V. сНо!егав 01 биовара Эль Тор по [15] с модификациями.

а — регуляторная сеть, контролирующая экспрессию генов вирулентности; ОМ — внешняя мембрана бактериальной клетки, 1М — внутренняя мембрана бактериальной клетки, стрелками обозначены взаимодействия между генами, + и — обозначают позитивную и негативную регуляцию соответственно; б — регуляция экспрессии генов отри и отрТ, кодирующих белки внешней мембраны Отри и ОтрТ, белком ТохЯ.

Таблица 1. Штаммы Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор, использованные в работе

ттт .. „ Номера последовательностей в NCBI

Штамм Место и год выделения Источник выделения GenBank

М888 РФ, Астрахань, 1970 Человек LRBH00000000*

М818 РФ, Саратов, 1970 Человек LAHM00000000*

N16961 Бангладеш, 1975 Человек AE003852/AE003853'

223 Украина, Нижние Серогозы, 1991 Речная вода NDXS00000000*

М1275 РФ, Дагестан, 1993 Человек LRAF00000000*

28 РФ, Кривой Рог, 1994 Человек NDXN00000000*

20-а/11 Украина, Николаевская обл., 1995 Человек PYAR00000000*

4661 Бангладеш, 2001 Неизвестен CWPG00000000**

CIRS101 Бангладеш, Дакка, 2002 Человек ACVW01000000**

CP1038 Зимбабве, 2003 Человек ALDC00000000**

Р18899 РФ, Мурманск, 2006 Человек LAKM00000000*

Л3226 РФ, Москва, 2010 Человек JDVX00000000*

2010E1-1716 Гаити,2010 Человек AELH01000000**

147 Украина, Ялта, 2010 Речная вода NDXQ00000000*

89 Украина, Ялта, 2010 Речная вода NDXR00000000*

39 Украина, Мариуполь, 2011 Сточные воды MWRC00000000*

153 Украина, Мариуполь, 2011 Человек MWRE00000000*

301 РФ, Таганрог, 2011 Морская вода AJFN00000000*

76 Украина, Мариуполь, 2011 Человек MPVL00000000*

3265/80 РФ, Москва, 2014 Человек JRQL00000000*

Р19613(81) РФ, Ростов-на-Дону, 2014 Речная вода JRQM00000000*

Примечание. * — нуклеотидные последовательности геномов, секвенированные авторами; ** — нуклеотидные последовательности геномов, взятые из МСВ1 ОепВапк.

массой 130—160 г, которых под эфирным наркозом внутрикишечно заражали 4-часовой агаровой культурой холерных вибрионов в концентрации 107 КОЕ в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Наблюдения

за ними вели в течение 48 ч. Всех павших или усыпленных хлороформом животных вскрывали для оценки развития специфического инфекционного процесса. Его критериями были количество павших

животных, наличие и степень выраженности холеро-генного синдрома.

Выделение и очистку геномной ДНК бактерий проводили с использованием коммерческого набора Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit в соответствии с протоколом производителя. Клетки предварительно обрабатывали мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:10 000 (0,01%) и прогревали при 56 °С в течение 30 мин.

Полногеномное секвенирование и SNP-анализ. Библиотеки для секвенирования готовили из 0,5— 1,0 мкг геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя и секвенировали на генетическом анализаторе Ion PGM (Ion Torrent). Полученные единичные чтения корректировали с использованием программного обеспечения Ion Torrent Suite Software v.5.4 и собирали de novo в кон-тиги с помощью программы Newbler GS Assembler v 2.6. Для поочередного картирования единичных чтений полногеномной последовательности 16 секве-нированных штаммов на референсную последовательность штамма V. cholerae О1 биовара Эль Тор N16961 использовали программный пакет DNASTAR Lasergene v. 11.2 (DNASTAR, Inc., США). Полногеномный SNP-анализ осуществляли при помощи программы Wombac 2.0 (http://github.com/tseemann/ wombac), в результате работы которой получили SNP-матрицу путем сравнения полногеномных последовательностей каждого из 20 секвенированных нами (16) или взятых из GenBank (4) штаммов с последовательностью референсного штамма N16961 (см. табл. 1). Дендрограмму по алгоритму Maximum Parsimony на основании SNP-матрицы строили в программе BioNumerics 7.6 (hhtp://www.applied-maths. com/bionumerics).

Выделение РНК и обратная транскрипция. Культуры V. cholerae для последующего выделения тотальной РНК растили в LB-бульоне (при 37 °C с аэрацией) в течение 5 ч. РНК выделяли с помощью набора реактивов SV total RNA isolation system (Promega, США). Концентрацию и степень очистки полученных препаратов РНК определяли на спектрофотометре Biowave DNA (Biochrom Ltd, Англия). Синтез кД-НК на матрице РНК осуществляли с помощью набора реагентов «Реверта» («ИнтерЛабСервис», Россия). Определение экспрессии генов проводили с использованием прибора Rotor-Gene Q 5plex (Qiagen Inc, GMBH, Германия) с праймерами и TaqMan зондами («Синтол», Россия), указанными в табл. 2. В качестве положительного стандарта использовали разведения плазмидной ДНК (от 107 до 103) с клонированным участком исследуемого гена. Нормирование полученных данных проводили относительно конститутивно экспрессирующегося гена recA методом 2-ЛЛСТ [19]. Для оценки уровня экспрессии гена ПЦР одновременно проводили в двух повторах на трех независимо полученных образцах кДНК. Для статистиче-

ской обработки данных применяли программу Microsoft Excel 2010.

Результаты и обсуждение

Оценка вирулентности штаммов V. cholerae биовара Эль Тор ctxA+tcpA+, выделенных из воды. Для выяснения причин авирулентности ряда штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных из воды в межэпидемический период, в исследование было взято два таких штамма — 89 и 147, имеющих генотип вирулентных эпидемически опасных штаммов ctxA+tc-pA+, но не вызывавших заболевания (см. табл. 1). На первом этапе работы для определения их вирулентности было проведено внутрикишечное заражение шести 7—8-дневных крольчат клетками этих штаммов (в дозе 107 вибрионов). Оказалось, что у инфицированных крольчат не было развития холерной инфекции. У животных либо отсутствовали видимые изменения в толстом и тонком кишечнике (штамм 89), либо кишечник был растянут мутной непрозрачной жидкостью (штамм 147). Такая картина характерна только для энтеропатогенного эффекта и могла быть связана с действием дополнительных факторов патогенности, в частности гемолизина и/или растворимой гемагглютинин/протеазы, продуцируемых, как правило, всеми штаммами холерного вибриона. Напротив, у всех 6 крольчат, инфицированных для сравнения клетками двух клинических вирулентных штаммов Р18899 и 76 с тем же генотипом ctxA+tcpA+, наблюдалась резко выраженная холеро-генная реакция (перерастяжение толстого кишечника прозрачной жидкостью и растяжение тонкого кишечника полупрозрачным содержимым), вызванная действием CT, что указывало на развитие типичной экспериментальной холерной инфекции. Таким образом, воспроизведение экспериментальной инфекции на модельных животных, зараженных клетками штаммов 89 и 147 в достаточно высокой дозе, ни в одном случае не приводило к развитию типичной холерной инфекции. Полученные данные позволили отнести эти изоляты к авирулентным, несмотря на присутствие в их геноме генетических маркеров вирулентных штаммов ctxA и tcpA. Возможная причина такого явления — нарушение продукции у них критических факторов вирулентности (холерного токсина и/или TCP) вследствие мутаций в их структурных и/или регуляторных генах.

Сравнительный анализ структуры генома профа-га СТХф и острова патогенности VPI-1 V. cholerae О1 биовара Эль Тор с разной вирулентностью. Ранее нами при экспериментальном моделировании были выявлены структурные изменения генома вирулентных штаммов после их пребывания в водной среде, которые выражались в потере профага СТХф с генами, кодирующими CT [21]. Такие штаммы утрачивали вирулентность. Для поиска возможных генетиче-

a/a N16961 6/b 69

профаг СТХф

*«| сер

Хоровая

остров патогенности VPI-1 область

|[ orfU^ aee^j zot ^ ■«•! tcpPH^J tcpA£: jjgjf^ foxT^... | foxff^

H ceP orfU^ aee^l zof^ ctxABI^ *«| fcpPH^ tcpAET ^ jêpgf^ foxT^"*

в/с 147 "[ IcpPHp^AT^ tcpB-F

г/d 28 H сер асе ^ zof^] ctxABl \ tcpPH ^ tcpAEJ tcpB-F ^ forT^*«« |

д/е Р1В899 ч cep ^ асе ct*ABl\ —| topPH^fcp^'"5^ tcpB-F^) foxT^. | toxR \

e/f 76 -I

Рис. 2. Схема структуры генома профага СТХф, острова патогенности УР!-! и глобального регуляторного гена toxR авирулентных и вирулентных штаммов V. сho!erae 01 биовара Эль Тор с генотипом ^хА+^рА+.

ctxAB и tcpA-F — структурные ключевые гены вирулентности, кодирующие СТ и ТСР соответственно; ctxB1, ctxB3, ctxB7 — аллели гена ctxB, кодирующего В-субъединицу СТ; tcpAETи tcpACIRS — аллели гена tcpA, кодирующего основную субъединицу ТСР; ^хЯ — глобальный регуляторный ген интактный (белый цвет) или мутантный (черный).

Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов, использованных в работе

Название праймера Нуклеотидная последовательность (5'-3') Ссылка

recA-RT1 ACGGGTAACCTCAAGCAATC TATCCAAACGAACAGAAGCG Рассчитаны авторами

recA-RT2 (FAM)-CCACTGGCGGTAACGCACTGA-(BHQl)

recA-зонд

toxR-RT1 CGGAACCGTTTTGACGTATT [20]

toxR-RT2 CTCGCAATGATTTGCATGAC

toxR-зонд (FAM)-TTAACCCAAGCCATTTCGAC-(BHQl)

toxT-RT1 TGATGATCTTGATGCTATGG Рассчитаны авторами

toxT-RT2 toxT-зонд GACTGATATGCAATCTGTT

(FAM)-GCGTAATTGGCGTTGGGCAGAT-(BHQl)

tcpA-RTl CGCTGAGACCACACCCATA [20]

tcpA-RT2 GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACG Рассчитаны авторами

tcpA-зонд (FAM)-AGAAAACCGGTCAAGAGGGT-(BHQl)

ctxA-RT1 TGCCAAGAGGACAGAGTGAG

ctxA-RT2 ATCCATCATCGTGCCTAACA

ctxA-зонд (FAM)-TCCCGTCTGAGTTCCTCTTGCATG-(BHQl)

ctxB-RT1 GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACA » »

ctxB-RT2 CGACTTTAGCTTCAGTAAGATATGC

ctxB-зонд (ROX)-AGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTG-(BHQ2)

ских изменений у штаммов 89 и 147 мы провели анализ нуклеотидных последовательностей участков их геномов, обязательных для проявления вирулентности, — профага СТХф, несущего структурные гены СТ (оперон ctxAB), а также острова патогенности VPI-1 со структурными генами tcpA-F, кодирующими TCP, и тремя основными регуляторными генами toxT, tcpP и tcpH, контролирующими через регуляторный каскад экспрессию ctxAB и tcpA-F. Оказалось, что исследуемые штаммы содержали в хромосоме ин-тактные геномы профага СТХф со всем набором генов основных (СТ) и дополнительных (Ace, Zot) токсинов, а также ОП VPI-1 и не отличались по этим свойствам от референсного вирулентного штамма N16961 (рис. 2, а—в). При сравнении нуклеотидных

последовательностей геномов этих авирулентных штаммов с таковыми других вирулентных изолятов V. скокгае О1 биовара Эль Тор 28, Р18899 и 76, изолированных от больных холерой в 1994, 2006 и 2011 гг. соответственно, было установлено, что штаммы 89 и 147 относятся к геновариантам возбудителя, возникшим в начальный период их формирования. Геном их профага СТХф содержал в опероне сЫАВ аллель &хВ1 холерных вибрионов классического биовара, что характерно для вирулентных генетически измененных штаммов 28 и Р18899, возникших в начале 90-х годов прошлого столетия (см. рис. 2, б—д). В то же время нуклеотидная последовательность их гена ЩА, кодирующего основную субъединицу ТСР, была идентична таковой типичных штаммов холер-

ных вибрионов Эль Тор (см. рис. 2, а—в). Вместе с тем по этим свойствам авирулентные штаммы 89 и 147 отличались от вирулентного изолята 76, содержащего другие аллельные варианты генов ctxB и tcpA, а именно ctxB7и teрАСш, появившиеся у возбудителя на более поздних этапах эволюции (см. рис. 2, б, в, е). Анализ нуклеотидной последовательности регуляторных генов toxT, tcpP и tcpHиз ОП VPI-1, контролирующих активность ключевых структурных генов вирулентности ctxAB и tcpA-F, показал идентичность их структуры у авирулентных и вирулентных штаммов. Таким образом, предположение о том, что неспособность изучаемых штаммов вызывать развитие холерной инфекции могла быть следствием изменений структуры мобильных элементов, несущих ключевые гены вирулентности, присущих как типичным штаммам, так и геновариантам возбудителя, не подтвердилось.

Обнаружение мутации в глобальномрегуляторном гене toxR. Поскольку, помимо генов toxT, tcpP и tcpH, одним из основных компонентов генной сети вирулентности, координированно регулирующей экспрессию генов СТ и TCP, является глобальный ре-гуляторный ген toxR, расположенный в коровой части генома, можно было ожидать, что одной из причин авирулентности штаммов 89 и 147 могло быть изменение в его структуре. Это предположение основано на том, что трансмембранный сенсорный ДНК-связывающийся белок ToxR (мол. масса 32,5 кД) на уровне транскрипции осуществляет позитивный контроль экспрессии одного из основных регуляторных генов вирулентности toxT, продукт которого — транскрипционный активатор ToxT непосредственно обеспечивает биосинтез двух критических факторов вирулентности TCP и CT (см. рис. 1, а). Действительно, в результате анализа нуклеотидной последовательности гена toxR у обоих штаммов обнаружили делецию одного нуклеотида — тимина (T) в позиции 357, что привело к замене смыслового кодона TTG, кодирующего лейцин, на стоп-кодон TGA (рис. 3, а). Такая мутация обусловила утрату 176 аминокислот (aa) из цитоплазмати-ческого (64 аа), трансмембранного (16 aa) и пери-плазматического (96 aa) доменов (рис. 3, б), присутствующих в интактном белке ToxR вирулентного референсного штамма V. cholerae О1 биовара Эль Тор N16961, содержащего 294 aa (цитоплазматический домен 182 aa, трансмембранный домен 16 aa, пери-плазматический домен 96 aa) [22]. В то же время ну-клеотидная последовательность гена toxR вирулентных клинических штаммов Р18899 и 76 была идентична таковой референсного штамма возбудителя холеры N16961 (см. рис. 3, а).

Образование дефектного белка ToxR, являющееся следствием обнаруженной мутации в нуклеотидной последовательности гена toxR, могло привести к потере его функции. Для проверки этого предпо-

ложения мы провели сравнительный анализ продукции белков внешней мембраны OmpU и OmpT в му-тантных по гену toxR авирулентных штаммах и вирулентных изолятов с интактным геном toxR. Если у авирулентных штаммов, несущих мутацию в гене toxR, действительно изменяется активность кодируемого им белка, то эти штаммы должны отличаться от вирулентных продукцией белка OmpU (38,0 kD), для экспрессии которого требуется интактный белок ToxR, а также белка OmpT (42,0 кД), экспрессия которого негативно регулируется непосредственно ToxR [23, 24] (см. рис. 1, б). В результате было показано, что мутация в гене toxR действительно привела к тому, что в отличие от клинического вирулентного штамма 76 с интактным геном toxR, взятого в качестве контроля, авирулентные штаммы 89 и 147 утратили белок OmpU, но у них появился другой белок — OmpT (рис. 4, дорожки 3—5). Таким образом, обнаруженные изменения продукции двух белков внешней мембраны, гены которых, ompTи ompU, находятся под непосредственным контролем гена toxR, явно связаны с потерей функции белка ToxR у ави-рулентных штаммов в результате нарушения последовательности гена toxR.

Влияние мутации в глобальном регуляторном гене toxR на уровень транскрипции ключевых структурных и регуляторных генов вирулентности. Потеря функции белка ToxR вследствие однонуклеотидной деле-ции в гене toxR, обусловившей образование стоп-ко-дона, могла изменить активность другого центрального регуляторного гена toxT, непосредственным транскрипционным активатором которого является белок ToxR. Методом ОТ ПЦР в реальном времени мы сравнили уровень транскрипции генов toxR и toxT у мутантных по гену toxR штаммов 147 и 89 с таковыми вирулентного штамма 76, взятого в качестве контрольного. В результате было выявлено статистически значимое снижение уровня транскрипции этих генов у мутантных штаммов 147 и 89. Активность их гена toxR снизилась в 1,5—2,0 раза (рис. 5, а). Наиболее выраженным было понижение уровня транскрипции гена toxT — в 5,3 раза у штамма 147 и в 5,6 раза у штамма 89 (см. рис. 5, д). Поскольку белковый продукт гена toxT является прямым позитивным регулятором структурных генов ctxAB и tcpA-F, кодирующих CT и TCP, резкое снижение его транскрипции могло привести к существенному изменению экспрессии генов этих ключевых факторов вирулентности. Для подтверждения этого предположения был определен уровень транс-криции генов ctxA, ctxB и tcpA у изученных штаммов. Оказалось, что их транскрипционная активность была значительно снижена в сравнении с таковой вирулентного штамма 76. Наиболее существенно снизился уровень транскрипции генов холерного токсина — гена ctxA в 33,0—50,0 раза и гена ctxB в 33,0—100,0 раза (см. рис. 5, б, в). Что касается гена

a/a

6/b

HI6961

69

147

P1S899 76

N16961 69

1(7

N16961

69

147

10 100 110 120 350 360

----I .... I .... I ... I----I----I .... I----I.......I .... I .... I . .

ATGTTCGGATTAGGA. ... ACTCTGATTGAGAAAGAAGATAG ... GTTACCAÄTTGATCG ATGTTCGGITT1GGA. ... ACTCTSATTeACAAAGAAGATAG ... GTT1COUT-GATCG ATGTTCGGATTAGGA ... ACT С T GAT T GACAAAGAAGATAG ... GTTACCAAT-GATCG ATGTTCGGATTAßGA ... ACTCTGATTGAGAAAGAAGATAG ... GTTACCAÄTTGATCG ATGTTCGGATTAeSA ... ACTCTGATTGAGAAAGAAGATAG ... GTTACCAATTGATCG

Цитоплазматическмй домен (132 aal

10

. I .

20 . I..

. I.

. I.

90 . I..

. 1.

100 . I...

. I.

110 . I...

. I.

120 . I . . .

. I .

HFGLGHNSKEISMSHIGTKFILAEKiTFD ... ETVDDSSLTQMSTIJUtMIjmSTMPQYVKTVFKRGrQLIAKVETVEE MFGLGKNSKEISHSHICTKFILAEKFTFD ... ET^DSSLTQAISTLRKMLKDSTKSPQYVKTVEKRGYC----------

MFGLGHN3PZX SMSKIGTKFILAZKTTFD ... FEVDDSSLTOMSTUUMLKDSTKSPCYVKTVPKEGYa----------

Трансмембранный домен (16 aal Пер^гтлазматаческий домен (96 аа)

130 140 II 190 II :бо 270 :ва 2эо I .1 — I — I.. .1.. I.. I — I — I.. Р ... и| — I — 1 — I — I — I — I — I... I

EMARE5EAAHDISQP ... LLILIAVLLEIAVLLL ... ATGGQHNQLTlmNYIHSPEVSGEHITLRTVANPNDAJKVCE

Рис. 3. Структура регуляторного гена toxR авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA+tcpA+.

а — нуклеотидная последовательность гена ^хЯ авирулентных (89 и 147) и вирулентных (Р18899, 76 и N16961) штаммов; у авирулентных штаммов серым цветом обозначена делеция одного нуклеотида в гене ОхЯ, приводящая к образованию стоп-кодона ТОЛ; б — аминокислотная последовательность белка ТохЯ — продукта интактного (референсный штамм N16961) и мутантного (штаммы 89 и 147) гена 1охЯ.

Рис. 4. Электрофореграмма белков внешней мембраны OmpU и OmpT авирулентных и вирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA+tcpA+.

М — маркер молекулярной массы, 1, 3 — вирулентные штаммы Дакка 35 Тох+ и 76 соответственно, 2, 4, 5 — авирулентные штаммы Дакка 35 Тох-,89 и 147 соответственно.

tcpA, кодирующего основную субъединицу TCP, то его активность была также снижена — в 7,5 раза у штамма 147 и в 10,0 раза у штамма 89 по сравнению с контрольным штаммом 76 (см. рис. 5, г). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что транскрипция изученных регуляторных и структурных генов вирулентности действительно была заметно снижена у исследуемых штаммов V. cholerae 147 и 89, содержащих однонуклеотидную делецию в регуляторном гене toxR, которая привела к сдвигу рамки считывания и утрате функции глобального регулятора ToxR.

Следовало также ожидать, что следствием этого события будет резкое понижение или отсутствие у авирулентных штаммов продукции CT, определяющего развитие специфического холерогенного синдрома у экспериментальных животных. Действительно, по данным иммуноферментного метода GMt ELISA,

Рис. 5. Относительный уровень транскрипции ключевых структурных СхЛ, ctxB, ^рЛ) и регуляторных (toxR, ^хТ) генов, входящих в состав генной сети вирулентности, авирулентных штаммов V. сИо1егае O1 биовара Эль Тор 147 и 89 ^хЛ^срЛ+ d в сравнении с вирулентным штаммом 76 е1хЛ+ крЛ+.

По оси абсцисс — гены, входящие в сеть вирулентности V. ско1егае 01 биовара Эль Тор. По оси ординат — уровень транскриптов генов в относительных единицах.

продукция токсина у штаммов 89 и 147 составляла 0,01 и 0,02 мкг/мл соответственно, тогда как взятые для сравнения вирулентные клинические штаммы 28, 76 и 153 продуцировали 0,43—0,63 мкг/мл этого белка. Полученные данные позволили заключить, что утрата функции регуляторного белка ТохЯ из-за мутации в гене 1охЯ, обусловившая каскадное снижение мРНК-структурных и регуляторных генов вирулентности штаммов 147 и 89, привела к резкому снижению продукции СТ, что и явилось причиной их ави-рулентности.

Филогенетическая связь авирулентных и вирулентных штаммов V. сНо1егае биовара Эль Тор. Обнаруже-

Рис. 6. Филогенетическое дерево вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор ctxA+tcpA+, построенное методом maximum parsimony tree по данным анализа коровых SNPs в полногеномных последовательностях 21 штамма.

Овалами выделены группы типичных штаммов (1), геновариантов, возникших в ранний период (2), и геновариантов, выделенных в более поздний период эволюции возбудителя (3). В скобках указано количество SNP, отличающее каждую группу от референсного штамма V. cholerae N16961.

ние авирулентных штаммов V. еко1егае биовара Эль Тор, содержащих в геноме все известные генетические маркеры эпидемически опасных штаммов, ставит вопрос об их происхождении. Для выяснения филогенетических связей штаммов 147 и 89 с вирулентными штаммами были использованы нуклеотид-ные последовательности их полных геномов, а также 19 вирулентных штаммов, секвенированных нами (14 штаммов) или взятых из базы данных КСВ1 ОепВапк (5). Выбранные вирулентные штаммы относились к типичным, вызвавшим начало 7-й пандемии холеры, или к разным геновариантам, возникшим на различных этапах эволюции генома возбудителя. Филогенетический анализ и построение дендрограммы проводили на основе выявления коровых в полногеномных нуклеотидных последовательностях этих штаммов. При сравнении с ре-ференсным типичным штаммом возбудителя холеры Эль Тор V. скокгае N16961 в геноме взятых штаммов было найдено 392 SNPs, на основе которых про-

ведено построение дендрограммы МаЫтит Раг-sinomy (рис. 6). Согласно представленным данным, штаммы образовали три группы, отражающие этапы эволюционных преобразований генома патогена (см. рис. 6). В первую группу вместе с референс-ным N16961 вошли типичные штаммы, отличающиеся от него лишь на 48—64 SNPs, что подтверждает их клональное происхождение. Геноварианты возбудителя образовали две отдельные группы — вторую и третью. Вторая группа состояла из вирулентных штаммов генетически измененного возбудителя с аллелем с1хВ1, возникших в ранний период их формирования (1991—1995 гг.) и отличалась от типичного референсного штамма из первой группы на 102— 121 SNPs. Третья группа была представлена новыми вариантами возбудителя, сформированными в более поздний период (2001—2014 гг.) и несущими, согласно ранее полученным данным, дополнительные мутации в генах вирулентности и пандемичности — новые аллели ключевых и дополнительных генов патоген-

Таблица 3. Уникальные несинонимичные однонуклеотидные замены (SNPs) в локусах авирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор 147 и 89 ctxA+tcpA+

Локус Мутация Позиция от начала генома* Позиция в гене Функция кодируемого белка и результат мутации

VC0164 G^A 154496 3034 Белок VexB, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам. Замена пролина на серин

VC0344 C^G 366140 821 Белок ^ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза, обеспечивающий переход колоний в ругозные формы. Замена аланина на глицин

VC0420 T^C 450121 3434 Гипотетический протеин. Замена лейцина на пролин

VC0784 C^T 841149 841 Белок натрий/аланин симпортер, ответственный за транспорт натрия/аланина через клеточную мембрану. Замена глицина на серин

VC1061 A^C 1129007 961 Белок цистеин синтаза/цистатионин бета синтаза, катализирующая переход гомоцистеина в цистатионин. Замена тирозина на аспарагиновую кислоту

VC1258 C^A 1332037 1831 А-субъединица ДНК гиразы. Замена аргинина на серин

Межгенное пространство A^T 2004484 — —

VC2256 G^T 2412656 158 Белок ундекапренил дифосфат синтаза, участвующий в биосинтезе полисахаридов. Замена треонина на аспарагин

VC2394 C^A 2560518 2584 Субъединица белка SecA, участвующего в транспорте белков через мембрану клетки. Замена аланина на серин

Межгенное пространство C^T 2787915 — —

Межгенное пространство C^T 2821368 — —

VCA0025 G^A 31052 (хромосома II) 569 Транспортный белок семейства №дС. Замена серина на аспарагин

Примечание. * — указана позиция по геному референсного штамма V. cholerаe N16961 (номера доступа ОепВапк N^002505 и Ж!_002506).

ности ^Б (^Б7), крА (крАсш), rtxA (г1хА4) и протяженную делецию в VSP-II (см. рис. 6). Эта группа имела более значимые отличия от референсного штамма, составляющие 117—160 SNPs. Что касается изучаемых штаммов 147 и 89, содержащих в структурных генах холерного токсина аллель ctxБ1, то, несмотря на отличия в вирулентности и выделение в более поздний период (2010 г.), эти штаммы оказались филогенетически близкими с геновариантами второй группы, различаясь между собой на три SNPs, что указывает на их клональное происхождение. Тем не менее геномы этих штаммов имели 21—44 SNPs, отличающих их от геномов других штаммов, входящих в состав этой группы, и 14 SNPs, специфичных только для них. Распределенные по геному в разных позициях, эти уникальные SNPs были связаны с изменением аминокислотной последовательности белков, выполняющих в клетке разные функции (транспорт различных веществ, биосинтез полисахаридов, устойчивость к антибиотикам) (табл. 3). Пока неясно, как влияют эти замены на функциональность указанных белков. Тем не менее, вполне возможно, что эти мутации могут быть значимы для функционирования генов вирулентности. Таким образом,

установленные филогенетические связи позволяют полагать, что изученные авирулентные штаммы, сформированные, видимо, на эндемичной по холере территории, являются производными вирулентных геновариантов возбудителя, появившихся в начальный период их формирования. Возникновение мутации в глобальном регуляторном гене toxR, обусловившей авирулентность геновариантов, является, возможно, следствием их адаптации к стрессовым воздействиям водной среды.

Заключение

Возросший интерес к исследованиям вариабельности структуры и функции генома возбудителя холеры, несущего в хромосоме ключевые гены патогенно-сти в составе профага СТХф и острова патогенности VPI-1, в значительной мере обусловлен выделением из водной среды различных штаммов V. ^о1егае биовара Эль Тор с пониженной или утраченной вирулентностью. Механизм их формирования до сих пор оставался малоизученным. Одним из механизмов возникновения таких вариантов является утрата полного генома профага СТХф с генами холерного

токсина [21]. Проведенные исследования позволили получить новую информацию о структурно-функциональных особенностях генома изученных штаммов, изолированных из воды. При анализе секвенирован-ных нами полных геномов выделенных из воды ави-рулентных и клинических вирулентных штаммов, относящихся по генотипу ctxA+tcpA+ к эпидемически опасным штаммам, не было выявлено различий между ними в структуре профага СТХф и острова патогенности VPI-1. В то же время у авирулентных штаммов впервые было обнаружено изменение ну-клеотидной последовательности глобального регу-ляторного гена toxR, расположенного в коровой части генома — делеция одного нуклеотида (Т в позиции 357), что привело к образованию стоп-кодона TGA. Следствие такой мутации — образование дефектного трансмембранного ДНК-связывающе-го белка ТохЯ, осуществляющего позитивный контроль экспрессии основного регуляторного гена вирулентности toxT. Показано, что утрата функции белка ToxR вследствие выявленной мутации в гене toxR обусловила существенное снижение мРНК регуляторных и структурных генов вирулентности у изученных штаммов, выделенных из воды, что в свою очередь привело к их неспособности продуцировать CT, необходимого для развития инфекционного процесса при холере. SNP-анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей двух авирулентных штаммов ctxA+tcpA+ и 19 вирулентных, изолированных на разных этапах 7-й пандемии холеры, указал, что мутантные штаммы вошли в состав группы, включающей в себя вирулентные геноварианты, появившиеся в начальный период их

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Самородова А.В. Кругликов В.Д., Титова С.В., Иванова С.М. и др. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире и России в 2007—2016 гг., прогноз на 2017 г. Пробл. особо опасных инф. 2017;1:13-20.

Moskvitina EA, Tyuleneva EG, Samorodova AV, Kruglikov VD, Titova SV, Ivanova SM, et al. Epidemiological Situation on Cholera across the Globe and in the Russian Federation in 2007—2016. Forecast for 2017. Probl. oso-bo opasnykh inf. 2017;1:13-20 (In Russ.). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-1-13-20

2. Миронова Л.В. Современные представления о закономерностях эпидемического процесса при холере: экологические и молекулярно-био-логические аспекты. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2018;23(5): 242-250.

Mironova LV. Current conceptions concerning the objective laws of a Cholera epidemic process: ecological and molecular biological aspects. Epidemiology and Infectious Diseases. 2018;23(5):242-250. (In Russ.). https://doi.org/10.18821/1560-9529-2018-23-5-242-250

3. Dziejman M, Balon E, Boyd D, Fraser CM, Heidelberg JF, Mekalanos JJ. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(3):1556-1561. https://doi.org/10.3410/E1004686.53905

4. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Чел-дышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетиче-ский анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013;49(9):36-1047.

образования (1991—1995 гг.). Эти данные позволили полагать, что изученные авирулентные штаммы являются производными этих геновариантов возбудителя, появившимися в результате мутации в глобальном регуляторном гене toxR.

Таким образом, выявлен новый механизм изменения вирулентности штаммов V. cholerac биовара Эль Тор c генотипом ctxA+tcpA+, выделенных из воды. Использование полученных данных об изменении структуры и функции глобального регуляторного белка ToxR за счет ранее не описанной мутации в гене toxR может обеспечить более объективную оценку уровня вирулентности различных изолятов V. cholerae биовара Эль Тор с генотипом ctxA+tcpA+, определяющего структуру и тяжесть инфекционного процесса. Дальнейшее выявление различных мутаций в глобальном регуляторном гене toxR и выяснение их возможных связей с уровнем вирулентности у различных штаммов возбудителя холеры составляет предмет нашей будущей работы.

Благодарности. Авторы благодарны к.б.н., с.н.с. РосНИПЧИ«Микроб» Ливановой Л.Ф. за помощь в проведении экспериментов с животными.

Финансирование. Работа не имела спонсорской поддержки.

Соблюдение этических норм. При работе с животными были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные принципы ухода и использования животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Smirnova NI, Zadnova SP, Agafonov DA, Shashkova AV, Cheldyshova NB, Cherkasov AV. Comparative Molecular-Genetic Analysis of Mobile Elements in Natural Strains of Cholera Agent. Russian Journal of Genetics. 2013;49(9):36-1047. (In Russ.). https://doi.org/10.7868/S0016675813090087

5. Karaolis DK, Johnson JA, Bailey CC, Boedeker EC, Kaper JB, Reeves PR. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(6):3134-3139. https://doi.org/10.1073/pnas.95.6.3134

6. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996;272(5270):1910-1914. https://doi.org/10.1126/science.272.5270.1910

7. Karaolis DK, Somara S, Maneval DR Jr, Johnson JA, Kaper JB. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria. Nature. 1999;399(6734):375-379. https://doi.org/10.1038/20715

8. Hu D, Liu B, Feng L, Ding P, Guo X, Wang M, et al. Origins of the current seventh cholera pandemic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(48):7730-7739. https://doi.org/10.1073/pnas.1608732113

9. Mutreja A, Kim DW, Thomson N, Connor TR, Lee JH, Kariuki S, et al. Evidence for multiple waves of global transmission within the seventh cholera pandemic. Nature. 2011;477(7365):462-465. https://doi.org/10.1038/nature10392

10. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол генетика, микробиол, вирусология. 2010;4:11-19.

Smirnova NI, Goryaev AA, Kutyrev VV. Evolution of the Vibrio cholera genome during the modern period. Mol genetics, Microbiol and Virology. 2010;4:11-19. (In Russ.). https://doi.org/10.3103/S0891416810040026

11. Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, Kamruzzaman M, Siddique AK, Sack DA. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J Clin Microbiol. 2002;40(9):3296-3299. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3296-3299.2002

12. Satchell KJ, Jones CJ, Wong J, Queen J, Agarwal S, Yildiz FH. Phenotypic Analysis Reveals that the 2010 Haiti Cholera Epidemic Is Linked to a Hypervirulent Strain. Infect Immun. 2016;84(9):2473-2481. https://doi.org/10.1128/iai.00189-16

13. Hasan NA, Choi SY, Eppinger M, Clark PW, Chen A, Alam M, et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(29):2010-2017. https://doi.org/10.1073/pnas.1207359109

14. Matson JS, Withey JH, DiRita VJ. Regulatory Networks Controlling Vibrio cholerae Virulence Gene Expression. Infect Immun. 2007;75(12):5542-5549. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02686

15. Cotter PA, DiRita VJ. Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective. Annu Rev Microbiol. 2000;54:519-565.

16. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. https://doi.org/10.1038/227680a0

17. Holmgren J, Svennerholm AM. Cholera and the immune response. Prog Allergy. 1983;33:106-119.

https://doi.org/10.1007/978-3-540-88452-1_12

18. Dutta NK, Habbu MK. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation. Br J Pharmacol Chemother. 1955;10(2):153-159. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.1955.tb00074.x

19. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

20. Fykse EM, Skogan G, Davies W, Olsen JS, Blatny JM. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl Environ Microbiol. 2007;73(5):1457-1466. https://doi.org/10.1128/AEM.01635-06

21. Смирнова Н.И., Агафонов Д.А., Кульшань Т.А., Щелканова Е.Ю., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В. и др. Влияние делении профага CTXф возбудителя холеры на экспрессию регуляторных генов, контролирующих вирулентность и образование биопленки. Генетика. 2017;53(2):1-14. Smirnova NI, Agafonov DA, Kul'shan' TA, Shchelkanova EYu, Krasnov YaM, Lozovsky YuV, et al. Effect of СТХф prophage deletion in cholera agent on expression of regulatory genes controlling virulence and biofilm formation. Russian Journal of Genetics. 2017;53(2):1-14. (In Russ.). https://doi.org/10.1134/S1022795417020119

22. Cholera toxin transcriptional activator. https://www.uniprot.org/uniprot/P15795

23. Crawford JA, Kaper JB, DiRita VJ. Analysis of ToxR-dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae. Mol Microbiol. 1998;29(1):235-246. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1998.00925.x

24. Li CC, Crawford JA, DiRita VJ, Kaper JB. Molecular cloning and transcriptional regulation of ompT, a ToxR-repressed gene in Vibrio cholerae. Mol Microbiol. 2000;35(1):189-203. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.01699.x

Поступила в редакцию 25.06.2019 Received 25.06.2019 После доработки 08.07.2019 Revised 08.07.2019 Принята к публикации 18.08.2019 Accepted 18.08.2019