CC BY
26
УДК 591.1
Итоги и перспективы исследования идентификации взаимодействия микроорганизмов рубца
жвачных животных
К.Г.Логачев, Б.С.Нуржанов, А.Ф.Гулиц
ГНУ Всероссийский НИИ мясного скотоводства РАСХН И.Ф.Каримов
ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет
Аннотация. В статье приводятся обобщенные данные исследований в области механизмов взаимодействия микроорганизмов, населяющих рубец жвачных животных. Обоснована необходимость дальнейшего проведения исследований в данной сфере.
Summary. The article cites the aggregate research data on the mechanisms of rumen microorganisms’ interaction, and justifies the necessity of further research in the field.
Ключевые слова: микроорганизмы, крупный рогатый скот, биосенсор, рубец, инфузории, E. тоН, тест-система
Key words: microorganisms, cattle, biosensor, rumen, infusoria, E. coli, test system.
В процессе эволюционного развития пищеварительный тракт жвачных животных, в том числе крупного рогатого скота, приспособился к переработке большого количества грубого растительного корма, в состав которого входит много клетчатки.
В ротовой полости жвачных осуществляется пережевывание корма и обильное смачивание его слюной, обладающей буферной емкостью и содержащей в своем составе бикарбонаты, натрий, калий, мочевину и фосфаты. Корм вместе со слюной попадает в желудок.
Желудок жвачных состоит из четырех отделов - рубца, сетки, книжки и сычуга. Из них только сычуг соответствует желудку других млекопитающих: он имеет пищеварительные железы, в него выделяются пищеварительные ферменты и соляная кислота. Реакция среды в сычуге резко кислая.
Из указанных трех отделов основное значение имеет рубец, являющийся по своей сути большой «бродильной установкой». В этом отделе в огромных количествах живут разнообразные микроорганизмы, вызывающие процессы брожения, которые протекают в условиях нейтральной или слабощелочной реакции. В рубце наряду с бактериями обитает масса простейших - очень мелких жгутиконосцев и инфузорий, так как здесь создаются весьма благоприятные условия для их развития [1, 5, 6].
Благодаря различной по своему видовому составу микрофлоре (более 60 видов бактерий) и ее обилию в рубце, происходит сбраживание основных питательных веществ корма - углеводов, белков и липидов и создаются условия для последующего их эффективного использования в нижележащих отделах пищеварительного тракта.
В результате бактериальной ферментации в рубце образуются летучие жирные кислоты, аминокислоты, пептиды, аммиак, углекислый газ, метан и другие конечные продукты обмена. Однако микроорганизмы рубца не только переводят в усвояемую форму некоторые питательные вещества корма, но и синтезируют ряд жизненно важных веществ - аминокислоты, липиды, витамины.
Конечные продукты преобразования микрофлорой питательных веществ всасываются в рубце и используются в качестве промежуточных продуктов обмена веществ.
Нижележащие отделы пищеварительного тракта также имеют большое значение в дальнейшем переваривании, всасывании и обмене неиспользованных в рубце питательных веществ, а также синтезированных микроорганизмами органических веществ и собственно бактериального белка. Своеобразие пищеварительных процессов у жвачных и образующиеся при этом метаболиты оказывают существенное влияние на течение обменных процессов в организме животных, на их здоровье, и продуктивность [3, 7, 8].
В соответствии с развитием последних тенденции кормления скота Максвини и Мэккэром была выдвинута важность изучения взаимоотношений микробной экологии рубца и разнообразие микроорганизмов пищеварительного тракта жвачных животных. В течение прошлого десятилетия увеличение населения, уменьшение пригодных для обработки земель, вызванное деградацией почвы, урбанизация, индустриализация, и связанные с этим увеличение спроса на продукты животноводства вызвало разительные перемены в подходах кормления домашнего скота, выражающиеся в применении новых кормовых добавок и новых видов корма, что провоцирует изменения во взаимоотношении микропопуляций рубца жвачных. В тоже время изменяются требования к качеству продукции животноводства, а также и методов, используемых в их производстве. Животноводство должно соответствовать этим новым требованиям повышением производительности, при соблюдении защиты окружающей среды и здоровья человека, не нарушая биоразнообразие и природные ресурсы. Микроорганизмы пищеварительного тракта жвачных животных оказывают прямое воздей-
ствие на преобразование поступающей пищи в конечные продукты жизнедеятельности, воздействующие на животное и окружающую его среду. Важным моментом в развитии вопросов применения тех или иных кормовых добавок для животноводства является понимание процессов взаимодействия микробиоты рубца между собой, а также синергических связей с хозяином [1, 16].
До недавнего времени для изучения микробиологии пищеварительного тракта использовали классические методы, такие как культивирование микроорганизмов рубца, подсчет количества и изучение качественных характеристик кормов. Для данных методов характерным является высокие трудозатраты, использование большого перечня дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.
Сегодня появились новые способы изучения микроорганизмов, основанные на использовании биосенсоров. Эти технологии имеют высокий потенциал для реконструирования понимания функции рубца и способствуют преодолению ограничения классических методов, базирующихся на изоляции и таксономической идентификации, необходимых для лучшего понимания роли микроорганизмов и рубца в целом, а также для достижения высокой продуктивности и уменьшения экологического загрязнения и загрязнения пищевой цепи [2, 17].
Биосенсором называют измерительное устройство, которое состоит из чувствительного биологического компонента, распознающего химическое или физическое воздействие, и связанного с ним преобразователя, который генерирует сигнал в ответ на аналит. Современное определение биосенсора традиционно базируется на определении биосенсорного электрода, которое дал Кларк. В 1962 году он предположил, что ферменты можно сорбировать на электрохимических датчиках и такие «ферментные электроды» могут быть использованы для целей биологического тестирования. В дальнейшем границы определения биосенсора постепенно расширялись. Одним из стимулирующих поводов для развития биосенсорной технологии было стремление применить биосенсоры для медицины. Возможность анализа биологических препаратов, проб крови и лекарственных препаратов с помощью экспрессных и дешевых приемов способствовало внедрению биосенсоров. Примером может служить биосенсор для определения глюкозы в крови людей больных сахарным диабетом. Общественный интерес к медицинскому использованию биосенсоров возрос при осознании опасности загрязнения окружающей среды.
Индустриализация и новые технологии сделали жизнь человека комфортной, но создали многочисленные экологические проблемы. Действительно, пестициды, тяжелые металлы, отходы химической, фармакологической, пищевой, нефтяной, космической промышленности, в значительных количествах попадают в объекты окружающей среды, почву и водные источники, включаются в пищевые цепи, создавая угрозы для здоровья и жизни человека и животных. Действие ряда экотоксикантов связано с генотоксическими повреждениями генома, с возникновением и сохранением мутаций, возможно, с возникновением рака. Определенную роль в возникновении рака могут играть эпигенетические причины, связанные с дерепрессией или репрессией генов, модификацией оснований ДНК в области промоторов и включением «молчащих» генов в транскрипцию.
В настоящее время биосенсорная техника бурно развивается и использует как традиционные, так и развивающиеся направления (наночастицы, поверхностный плазмонный резонанс, волоконно-оптические, кондуктометрические, электрохимические, генно-инженерные методы) для совершенствования химического и биохимического анализа объектов окружающей среды [16].
Совершенно очевидно, что ответ об опасности экотоксикантов для организма могут дать только биологические методы. Поэтому в последние годы целью многих исследований была разработка простых и адекватных методов для оценки токсического воздействия химических и физических факторов окружающей среды на организм. Так, в последние годы, наряду с биосенсорами электродных типов, широкое распространение получили цельноклеточные (whole-cell) биосенсоры. Они представляют собой живые клетки (микроорганизмов или высших организмов) и дают измеряемый продукт своей геномной деятельности в ответ на присутствие токсикантов. Среди биосенсоров данного типа, микробные цельноклеточные биосенсоры имеют многочисленные преимущества в экологическом тестировании [12, 2]. Культивирование микроорганизмов дешевле по сравнению с культурами клеток высших организмов. Они могут быть получены в больших количествах, подвергнуты более строгому контролю, чем клетки высших организмов, и легко хранятся. При этом, цельноклеточные биосенсоры обычно трансформированы рекомбинантными плазмидами и они имеют в составе этих плазмид промотор, отвечающий на воздействие экотоксикантом транскрипцией репортерного гена, находящегося под контролем этого промотора, и дают в результате трансляции репортерный белок, который легко измерить с помощью флуориметра, люминометра или цветной реакции. Оказалось, что цельноклеточные биосенсоры быстро отвечают на наличие в среде экотоксикантов и в этом качестве превосходят физико-химические методы анализа. Цельноклеточные биосенсоры могут успешно применяться для научных целей: при оценке изучения генетической экспрессии, при физиологических исследованиях на животных, растениях и человеке.
Преимущества использования цельноклеточных биосенсоров связаны с их высокой специфичностью, селективностью и экспрессностью. Новые возможности использования цельноклеточных биосенсоров связаны также с возможностью изучать процессы в клетке, которые были ранее недоступны для анализа. Принципиальной особенностью использования цельноклеточных биосенсоров является способность с их помощью оценить не только биодоступность аналита, но и физиологическое значение получаемых данных. Генетически измененные цельноклеточные биосенсоры реагируют на наличие аналита путем индукции гена, связанного с чувствительным к аналиту промотором путем создания гибридного (фьюз) гена. Обычно такие гибридные гены существуют в генетически трансформированных бактериальных клетках в составе плазмид, которыми трансформируют клетки. Структурная часть генетической конструкции кодирует измеряемый аналитическим способом репортерный белок. Сливаемый со структурным геном промотор обычно представляет собой регуляторный компонент, селективный и индуцируемый аналитом.
Биодоступный аналит проходит через мембрану клетки и взаимодействует с промотором гена-репортера непосредственно или путем инактивации его репрессора. Индуцированный ген транскрибируется. Трансляция мРНК репортерного гена приводит к синтезу белка, который легко регистрируется. Транскрипционные конструкции, созданные путем слияния (fuse, фьюза) гена - репортера и промотора, являются мощным орудием для изучения экспрессии бактериальных генов в природной среде обитания и для детекции определенных соединений в окружающей среде, хотя транскрипционные конструкции, созданные для этой цели, часто оказываются достаточно слабо экспрессируемыми, и их индукция может происходить в течение длительного времени и экотоксикант может поступить к биосенсору в ограниченный промежуток времени, необходимость определять экспрессию гена - репортера, существует. Действительно, определение экотоксиканта может быть принципиально важно для понимания экологической обстановки в данном регионе [11].
Для того, чтобы синтез репортерного белка произошел, необходимо создать генно-инженерными методами плазмиду с клонированным в нее “геном-репортером” под управление промотора, который отвечает на исследуемый аналит. Несколько условий необходимо, чтобы использовать такую биосенсорную конструкцию. Во-первых, генетическая конструкция, отвечающая за синтез репортерного белка, должна быть относительно простой, во-вторых, специфичность чувствительного элемента (промотора) по отношению к аналиту - высокой, и, наконец, в клетке должны отсутствовать сходные протеины или субстраты, которые могут помешать определению данного репортерного белка. Обычно промоторы и энхансеры располагают в cis- положении по отношению к структурному целевому гену. Исследования на клеточных культурах и трансгенных животных позволили отобрать репортерные гены и транскрипционные элементы, ответственные за тканево-специфическую экспрессию генов, в частности тех, которые могут участвовать в ответе на заболевания. Было показано, что воздействие на некоторые гены необходимо для лечения наследственных, вирусных, бактериальных, воспалительных, сердечно - сосудистых и раковых заболеваний. Была оценена также роль генов межклеточной коммуникации и их влияние на активность ряда генов у микроорганизмов [2]. Научные исследования позволили изучить cis-действующие структуры генома (энхансеры, промоторы). Работы на клеточных культурах и трансгенных животных и растениях позволило отобрать репортерные гены, ответственные за базальный и тканево-специфический уровень синтеза белков клетки. Идентификация некоторых репортерных генов (люциферазы светляков и зеленого флуорсцирующего белка), которые могут использоваться как неинвазивные маркеры генетической экспрессии, позволяет в режиме реального времени (например, с помощью конфокальной спектороскопии) следить за экспрессией репортерных и регулирующих метаболизм клетки белков. Так, можно оценить влияние различных транскрипционных факторов и медиаторных механизмов клетки для лечения ряда заболеваний, включая рак, вирусные, воспалительные инфекции, сердечно-сосудистые заболевания [12].
Цельноклеточные биосенсоры и репортерные гены в настоящее время широко используются для обнаружения различных по химическому составу и структуре соединений. Так, например, имеются биосенсоры, с помощью которых можно оценить наличие в среде металлов. Можно определить целый ряд органических соединений, пестицидов, мутагенов, генотоксикантов [17]. В последние годы реплортерные широко используются в качестве тонкого молекулярно-биологического инструмента в фундаментальных и прикладных исследованиях в биологии, химии и медицине.
В результате работ последнего десятилетия были отобраны репортерные белки, наиболее удобные для регистрации. В настоящее время в биосенсорах используются восемь уникальных репортерных белков: зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его мутантные производные (например, CFP,YFP), в -галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза, бактериальная люцифераза и люцифераза светляков, акворин, уропорфироген III метилтрансфераза, красный флуоресцирующий белок кораллов (DsRed). Это положило начало использованию модифицированных микроорганизмов в качестве биотестов [15].
Биотестирование (биологическое тестирование, экотоксикологический анализ) - это оценка токсических эффектов действия химических веществ и смесей по физиологическим, морфологическим реакциям, поведенческим изменениям, изменениям выживаемости, плодовитости тест-организмов.
Под биотестированием понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов.
Биотестирование состоит в определении токсичности среды непосредственно при действии ее на живой организм.
Биотоксичность может быть тестирована на различных моделях (простейших, бактерий) и оценивается с использованием сенсорных тест-систем.
Живые организмы, принадлежащие различным иерархическим уровням в системе классификации всего живого на Земле, по-разному реагируют на токсичные вещества, но всех их объединяет одно гениальное изобретение Природы: единица жизни в каждом организме - клетка. Известно также, что все качественные реакции при воздействии тех или иных токсикантов начинаются на клеточном уровне [9].
Биотесты на простейших, применяемых в качестве тестов при биоиспытаниях, дают результат, имеющий высокую достоверность и сопоставимость с реакцией целого организма, но в силу высокой сложности и трудоемкости таких методов применять эти тесты для массовой оценки пока затруднительно.
Биотестирование - это оценка реакции тест-организмов на ту или иную субстанцию. В качестве тест-организмов, обычно, используют низшие организмы, в том числе и одноклеточные, поскольку проводить опыты с ними гораздо удобнее, чем с высшими животными.
Среди простейших организмов на роль спасителей человека от созданной им самим беды - загрязнения среды обитания - имеются два претендента: бактерии и инфузории.
Из простейших в качестве биотестов используются бактерии иинфузории. Чувствительность этих организмов и достоверность результатов биотестирования во многом зависят от условий их культивирования и подготовки к исследованию.
Использование инфузорий для тестирования имеет свои преимущества: они имеют короткий цикл размножения, поэтому быстро достигается высокая численность популяции, они просты в содержании и достаточно чувствительны. В аналитическом аспекте инфузории интересны тем, что могут рассматриваться как простые рецепторно-эффекторные системы, обладающие способностью реагировать на химическое воздействие целым комплексом биологических, физиологических и биохимических изменений.
Инфузории - это одноклеточные эукариотические организмы, то есть у них есть ядро (а у многих видов инфузорий даже два ядра). Почти все клетки человека и других высших животных имеют ядра, а бактерии - прокариоты (безъядерные). Инфузории были одним из любимых объектов биологов еще лет сто назад, но и сейчас они остаются в центре внимания. Совсем недавно расшифровали геном инфузорий из рода Tetrahymena, состоящий из 27 тысяч генов [1].
Эти одноклеточные - в основном свободноживущие организмы, которые в воде и почве поедают бактерии и водоросли. Они - необходимое звено в трансформации органики, их вклад в биологический круговорот веществ не менее важен, чем у бактерий. Живут инфузории практически везде: в пресных и соленых водах, почве, и число их видов, по разным источникам, от 7 до 10 тысяч.
Характерная особенность инфузорий - относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Инфузории живут и в тундровых озерах, и в тропиках, и даже в горячих источниках с температурой до 50 °С. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Например, Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эту высокую адаптивную способность обеспечивает колоссальное количество генов, большинство которых в повседневной жизни инфузориям не нужны, но включаются, когда условия меняются.
По мере того как простейшие адаптируются к условиям среды, перестраиваются все их жизненные функции, изменяются скорость движения, темп размножения и способность поглощать пищу, а также форма и размеры тела. Но если среда не меняется, то свойства инфузорий остаются стабильными, это и позволяет использовать их как тесты. Конечно, это относится только к инфузориям, культивируемым в лабораторных условиях.
В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения. Например, можно смотреть изменение подвижности от 15 до 30 мин; гибель отдельных клеток от 1 до 4 часов; снижение скорости размножения от 1 до 3 суток; гибель популяции от 4 до 30 суток. Наблюдать за изменением подвижности недостаточно для оценки токсичности. Поскольку на движение у простейших расходуется всего 1 % энергии общего обмена, то подвижность только незначительно отражает те изме-
нения, которые происходят при отравлении токсичными агентами. Гибель отдельных клеток - достаточно надежный показатель, но с его помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Оценка скорости размножения - биотест с большей чувствительностью, по нему можно определять и небольшие концентрации вредных веществ. Если сочетать все тесты, то результат получается надежный.
Бактерии - прокариотические организмы, отстоящие от человека в эволюционном ряду дальше, чем эукариоты - инфузории, хороши там, где легко найти регулярный эталон. Регулярный эталон - постоянно присутствующий при анализах чистый образец, реакцию на который принимают за точку отсчета при исследовании неизвестного образца [2].
Биотесты с использованием живых бактерий отличаются от современных биотестов, использующих инфузории, дафнии, водоросли, рыб, лишь тем, что в качестве параметра жизнедеятельности измеряется биолюминесценция.
Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов. В таблице представлены все известные к настоящему времени биотесты на светящихся бактериях.
Разработка биолюминесцентных биотестов обычно идет в три этапа: подготовка тестовой культуры бактерий; собственно измерение свечения бактерий в присутствии или при отсутствии анализируемых веществ; установление связи между параметрами свечения и количественными характеристиками токсичности среды.
Каждый из этапов имеет свои особенности, связанные с тем, какая культура бактерий используется для анализа. Поэтому все известные к настоящему времени биотесты удобно классифицировать по способу приготовления тестовой культуры (периодической или непериодической) или реагентов на основе бактерий.
Чувствительность светящихся бактерий к различным веществам зависит от многих факторов, и, прежде всего, от штамма и условий культивирования бактерий (состава питательной среды, рН среды, фазы роста бактерий и так далее).
Было показано, что наибольшая чувствительность к аминазину (0,25 мМ) достигается при использовании для анализа Р. phosphoreum в конце экспоненциальной фазы роста и Р. flsheri в начале экспоненциальной и в стационарной фазах роста на полусинтетической среде с пептоном, глицерином и концентрацией №С1 - 50 г/л, рН 8,0.
Описанные в литературе методы тестирования ксенобиотиков отличаются лишь небольшими модификациями. Например, в значительных пределах может меняться количество клеток, взятых для анализа, или объем анализируемой пробы. Однако в силу относительности измерений такие модификации не влияют существенно на последовательность проводимых операций [14].
Таблица 1. Бактериальные биолюминесцентные биотесты
Биотест Действующие вещества
Загрязнение пищевых продуктов микотоксинами (7,53-31,79 мкг/мл) Присутствие в среде антибиотиков (0,2 мкг/мл) Токсичность сточных вод и водной среды Токсичность в воздушной среде (компоненты ракетного топлива) Загрязнение среды гербицидами Определение бактерицидной активности в сыворотке человека Модельное изучение влияния химических и физических факторов Продукты окисления керогена сланцев Токсичность для рыб Рубратоксин В, зеараленон, пенициллин, патулин, цитри-нин, охратоксин А, РР-токсин, афлатоксин В1. Тетрациклин, хлорамфеникол, стрептомицин, неомицин, гентамицин,канамицин. Ароматические углеводороды, дыхательные яды, фенольные соединения и продукты их деструкции, сульфатный лигнин, окрашенные фракции стоков, фенолоксидазы, детергенты, пестициды, тяжелые металлы, кобальт, отходы производства стабилизаторов. Диметилгидразин, альдегиды, спирты, ацетон, НС^ SO2 , Ц£, С12, продукты облучения смеси N0 и цис-2-бутена. Монурон, диурон, нефурон, атразин. Иммуноглобулины, комплементы. Температура, давление, лекарственные препараты, анестетики (галотан), глицерин, сахароза. Высокомолекулярные кислоты. Органические вещества.
Все тесты с использованием периодической культуры сходны между собой - сравнивается свечение бактерий в контроле и в присутствии анализируемых веществ или их смесей.
При создании тест-системы на основе светящихся бактерий часто возникает задача повышения чувствительности бактериальных клеток к низким концентрациям тестируемых соединений. Этого можно достичь изменением условий культивирования, способа обработки токсикантом, использования специфических чувствительных мутантных штаммов. Все эти подходы были использованы при создании тест-системы на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ). Для выяснения механизма их действия на люминесцентную систему необходимо иметь представление и о влиянии этих веществ на жизнеспособность клеток и сохранность их структур. В ряде экспериментов изучали действие на ультраструктуру и выживаемость P. leiognathi и V. harveyi после обработки клеток гидрохиноном, п-бензохиноном, резорцином, пирокатехином,хлоридами кадмия и ртути, взятыми в концентрациях, которые вызывают 50 % тушение люминесценции. Более специфическое действие на люминесцентную систему оказывают п-бензохинон и гидрохинон, не вызывая грубых структурных повреждений. Резорцин и хлорид кадмия являются структурно-неспецифическими агентами, поэтому обработка этими соединениями вызывает структурные повреждения, затрагивающие все компартменты клетки и многие важные функции, в том числе и люминесценцию, что указыает на возможность создания избирательных тестов [13].
Несмотря на очевидные преимущества биолюминесцентного тестирования, такие тесты до сих пор не паспортизованы и не доказана правомерность их использования в качестве индикатора загрязнения окружающей среды. Для этого, прежде всего, необходимо провести сопоставление результатов биолюминесцент-ного тестирования и других современных биотестов [12].
Считается, что среди большого разнообразия мутантов можно выбрать штаммы, избирательно чувствительные к определенным веществам. Однако успешных работ в этом направлении пока мало. Зато появились работы, сделанные с использованием рекомбинантных светящихся бактерий, где успешно эксплуатируется идея о том, что излучающие ферменты- люциферазы и их гены в последние годы стали самыми привлекательными и употребительными маркерами в генетике, эмбриологии, молекулярной биологии, в мониторинге окружающей среды и для биохимической диагностики в медицине. Поэтому помимо использования в люминесцентном анализе природных светящихся бактерий ведется разработка новых направлений биотестирования, и одним из них является использование в качестве тест-объекта люминесцентных рекомбинантных штаммов различных бактерий (E. coli, Pseudomonas, Rysobium и другие). К настоящему времени описано клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы светящихся бактерий Vibrio harveyi, V. fischeri и P. leiognati в плазмидном векторе клеток различных микроорганизмов [10]. Введение lux-гена позволяет создавать высокочувствительные биосенсоры, обладающие высокой специфичностью. Например, сконструированы бактерии, в которых под действием токсикантов увеличивается свечение. С помощью такого биолюми-несцентного биосенсора, созданного на основе E. coli, можно установить наличие в среде (и в смесях тяжелых металлов) ртути. Принцип действия этого биосенсора заключается в увеличении экспрессии lux-генов при наличии в среде ионов ртути. Чувствительность метода выше, чем в атомной абсорбционной спектроскопии. Подобный биосенсор на основе бактерий Pseudomonas putida сконструирован и для определения в среде нафталина, толуола, ксилола [9]. Бактерии рода Rysobium использованы для конструирования люминесцентного биосенсора загрязнения почвы. Некоторые штаммы бактерий рода Salmonella использованы для конструирования люминесцентного биотеста, позволяющего определять распределение бактерий на поверхности различных пищевых продуктов. Было предложено встраивать lux-гены в бактериофаги, которые, внедряясь в клетку-хозяина, через от 30 до 50 мин вызывают экспрессию lux-генов. С использованием этого приема был разработан метод определения бактериальных клеток непосредственно в молоке, который позволяет «уловить» до 10 клеток в образце [12].
Таким образом, приведенные выше данные иллюстрируют актуальность и фундаментальную ценность заявляемого проекта, реализация которого позволит получить комплекс новых знаний о механизмах взаимодействия микроорганизмов, населяющих рубец жвачных, определяющих бактерицидную активность кормового фактора и компонентов рубцовой жидкости. Ожидаемые результаты проекта будут полностью соответствовать современному мировому уровню в данной области знаний.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (согл. №8604).
Литература
1. Георгиевский В. И. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1990. 511 с.
2. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий // Вестник Московского университета. Сер.16. Биология. 2002. №3. С. 20-24.
3. Дускаев Г.К. Процессы пищеварения в рубце бычков разного направления продуктивности при сенно-концентратном рационе // Вестник мясного скотоводства // Матер. Всерос. науч.-практ. конф. Оренбург, 2002. вып.55. С. 106-109
4. Дускаев Г.К. Течение преджелудочного пищеварения у бычков мясной породы в зависимости от типа кормления // Вестник мясного скотоводства, вып. 56. 2003. С. 230-233
5. Дускаев Г.К. Биометрическая зависимость показателей рубцового пищеварения у бычков разного направления продуктивности // Вестник мясного скотоводства // Матер. Всерос. науч.-практ. конф. ВНИИМС. Оренбург, 2006, вып.59. т.1 С. 82-86
6. Левахин Г.И., Дускаев Г.К. Сравнительная характеристика образования основных метаболитов и динамика микрофлоры в рубце молодняка крупного рогатого скота, разного направления продуктивности // Матер. межрег. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов. Оренбург, 2001. С. 31-32
7. Левахин Г.И., Дускаев Г.К., Моисеев И.В., Павлова М.Ю. Жизнедеятельность микрофлоры рубца при разном уровне энергии и качестве клетчатки в рационе бычков // Стратегия научного обеспечения развития конкурентоспособного производства отечественных продуктов питания высокого качества. Матер. Всерос. науч.-практ. конф. Волгоград, 2006. ч.2. С. 424-426.
8. Нуржанов Б.С., Левахин Ю.И., Естефеев Д.В. Эффективность использования азота рациона при скармливании комплексного пробиотического препарата на основе сорбента - цеолита // Вестник мясного скотоводства. Оренбург, 2012. № 3(77). С. 85-88.
9. Чумакова Р.И., И.И. Гительзон Светящиеся бактерии. М: Наука, 1975.
10. Camboim, E.K.A., Tadra-Sfeir,M.Z., de Souza, E.M., Pedrosa, F.de O., Andrade, P.P., McSweeney, C.S., Riet-Correa, F. & Melo,M.A. 2012. Defluorination of sodium fluoroacetate by bacteria from soil and plants in Brazil. The Scientific World Journal (in press)
11. Frutos, P., Moreno-Gonzalo, J., Hervas, G., Garcia, U., Ferreira, L. M., Celaya, R., Toral, P. G., Ortega-Mora, L. M., Ferre, I., and Osoro, K., "Is the anthelmintic effect of heather supplementation to grazing goats always accompanied by anti-nutritional effects?," Animal., Vol. 2, No. 10, 2008, pp
12. Makkar, H. & McSweeney, C.S. 2005. Methods in Gut Microbial Ecology for Ruminants. Springer, The Netherlands. p. 225.
13. Min, B.R., Attwood, G.T., Reilly, K., Sun, W., Peters, J.S., Barry, T.N. & McNabb, W.C. 2002. Lotus corniculatus condensed tannins decrease in vivo populations of proteolytic bacteria and affect nitrogen metabolism in the rumen of sheep. Can. J. Microbiol. 48: 911-921.
14. Morgavi, D.P., Kelly, W.J., Janssen, P.H. & Attwood, G.T. 2012. Rumen microbial (meta)genomics and its application to ruminant production. Animal (in press)
15. Moallem, U., Lehrer, H., Zachut, M., Livshitz, L., and Yacoby, S., "Production performance and pattern of milk fat depression of high-yielding dairy cows supplemented with encapsulated conjugated linoleic acid," Animal., Vol. 4, No. 4, 2010, pp. 641-652.
16. Padmanabha, J., Gregg, K., Ford,M., Prideaux, C.& McSweeney, C.S. 2004. Protection of cattle from fluoroacetate poisoning by genetically modified ruminal bacteria. Anim. Prod. Aust. 25: 293.
17. Zoetendal, E.G., Koike, S. & Mackie, R.I. 2003. A critical view on molecular ecology of the gastrointestinal tract. In: Mannetje, L. (Ed.), Matching Herbivore Nutrition to Ecosystem Biodiversity. Proceedings of the 6th International Symposium on the Nutrition of Herbivores, pp. 59-78. Merida, Yucatan, Mexico.
Логачев Константин Григорьевич, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов ГНУ Всероссийского НИИ мясного скотоводства РАСХН, e-mail: koshak 00@mail.ru, Оренбург, ул. 9 Января, 29
Нуржанов Баер Серекпаевич, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов ГНУ Всероссийского НИИ мясного скотоводства РАСХН, e-mail: vniims.or@mail.ru, Оренбург, ул. 9 Января, 29
Гулиц Александра Федоровна, аспирантка отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов ГНУ Всероссийского НИИ мясного скотоводства РАСХН, e-mail: vniims.or@mail.ru, Оренбург, ул. 9 Января, 29
Каримов Ильшат Файзелгаянович, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии химико-биологического факультета Оренбургского государственного университета, e-mail: ifkarimov@yandex.ru, тел.: 89128421523,
Адрес рабочий: Оренбург, пр. Победы, д. 13, корп. 16, ауд. 306 Адрес домашний: Оренбург, ул. Туркестанская, д. 13, кв. 64
